修乘波 吳 剛 孫培春 朱元增 銀平章

(河南省新野市人民醫(yī)院普外科，新野 473500)

胃癌發(fā)病率高，五年生存率低，早期診斷率僅僅維持在10%～20%左右[1]。目前手術(shù)切除是唯一可能的治愈手段，但大部分仍存在腫瘤復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)，因此了解發(fā)生發(fā)展過(guò)程中分子機(jī)制對(duì)于胃癌的防治具有極大的臨床價(jià)值[2]。

腫瘤組織往往通過(guò)細(xì)胞外基質(zhì)(Extracellular matrix，ECM)重塑完成自我調(diào)控從而獲得侵襲能力并向其他組織轉(zhuǎn)移[3,4]。此過(guò)程中，CAFs細(xì)胞亞群發(fā)揮重要的生物學(xué)功能。CAFs可增強(qiáng)腫瘤的生長(zhǎng)、侵襲能力并降低對(duì)化療藥物的敏感性；可增強(qiáng)血管形成、免疫細(xì)胞浸潤(rùn)和腫瘤細(xì)胞的克隆形成能力[5]；也可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生EMT，這是腫瘤上皮細(xì)胞獲得遷移和侵襲能力的重要生物學(xué)過(guò)程。上皮表型向間質(zhì)轉(zhuǎn)化，失去細(xì)胞極性，失去與基底膜的連接從而獲得較高的遷移和侵襲能力。胸腺細(xì)胞分化抗原-1(Thy-1)是一類(lèi)糖脂?；?，主要錨定細(xì)胞表面[6]，其基因具有高度保守性[7]。作為干細(xì)胞表面分子標(biāo)記物，主要在軸突成熟中發(fā)揮著重要作用。但有文獻(xiàn)報(bào)道，其在腫瘤細(xì)胞凋亡和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用，并可介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞之間的連接。

本研究首先將分離鑒定出的CAFs/NFs與胃癌細(xì)胞系SNU-1和MKN45進(jìn)行共培養(yǎng)，檢測(cè)胃癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力及EMT分子指標(biāo)的表達(dá)以明確CAFs是否對(duì)腫瘤細(xì)胞的遷移能力和EMT造成影響；并驗(yàn)證CAFs是否通過(guò)Thy-1過(guò)表達(dá)，從而誘導(dǎo)細(xì)胞的遷移能力和EMT的發(fā)生。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1臨床資料 胃癌組織標(biāo)本來(lái)源于鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院接受胃癌根治術(shù)的5例患者。所有患者在術(shù)前未接受放化療的治療，原發(fā)性胃癌需得到胃鏡和組織學(xué)檢查的確診，并且癌旁的正常組織未受到癌細(xì)胞浸潤(rùn)。所有標(biāo)本的收集和使用均取得患者及家屬的知情同意，符合人體試驗(yàn)委員會(huì)制定的倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)并得到倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.1.2細(xì)胞系 胃癌細(xì)胞系SNU-1和MKN45均購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上?？茖W(xué)研究院細(xì)胞資源中心。

1.1.3主要試劑 胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；胰蛋白酶、RPMI1640培養(yǎng)基、磷酸鹽緩沖液(PBS)購(gòu)自美國(guó)HyClone公司；鼠抗人E-鈣黏素(E-cadherin，E-cad)、N-鈣黏素(N-cadherin，N-cad)、結(jié)合鋅指蛋白2(ZEB2)、Thy-1和GAPDH抗體購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司；HRP標(biāo)記羊抗鼠二抗購(gòu)自美國(guó)Zymed公司；羊抗鼠FITC標(biāo)記熒光二抗購(gòu)自美國(guó)Earthox公司；基因引物購(gòu)自上海生工公司；總RNA 提取試劑盒購(gòu)自北京索萊寶生物科技有限公司；cDNA逆轉(zhuǎn)試劑盒與SYBR實(shí)時(shí)定量試劑購(gòu)自日本TaKaRa公司；Transwell微孔板購(gòu)自美國(guó)康寧公司。

1.2方法

1.2.1組織塊法原代分離CAFs 術(shù)中取新鮮的胃癌組織標(biāo)本5例，PBS浸泡沖洗后用眼科剪剪碎并逐塊鋪滿(mǎn)含血清的28 cm2培養(yǎng)皿中，置于5%CO2，37℃培養(yǎng)箱中孵育2 h，待貼壁牢固后加入約2 ml含20%FBS，100 U/ml青霉素，100 μg/ml鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)液，每隔2～3 d換液，直至細(xì)胞自組織塊爬出后去除組織塊。待細(xì)胞鋪滿(mǎn)整個(gè)培養(yǎng)皿后，應(yīng)用胰酶消化法對(duì)細(xì)胞進(jìn)行純化。正常胃組織的NFs的培養(yǎng)方法與此相同。

1.2.2建立體外共培養(yǎng)體系 調(diào)整對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的CAFs的細(xì)胞密度約為1×105個(gè)/ml，置入6孔板中，約2 ml/孔，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h；調(diào)整對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的胃癌細(xì)胞約為1×106個(gè)/ml，并接種于0.4 μm Transwell小室的上層上，約1 ml/孔，將接種有胃癌細(xì)胞系的Transwell小室轉(zhuǎn)移至含有成纖維細(xì)胞的6孔板上，培養(yǎng)箱中孵育48 h。

1.2.3間接免疫熒光觀察成纖維細(xì)胞內(nèi)α-SMA蛋白的表達(dá) 收集各組細(xì)胞后，4%多聚甲醛固定后，PBS清洗5 min 3次，0.5% Trition X-100破膜后，PBS清洗5 min 3次，5%BSA-PBS室溫下封閉30 min 后加入α-SMA抗體，4℃孵育過(guò)夜后，PBS清洗5 min 3次，加入熒光二抗，避光室溫下孵育2 h，PBS清洗5 min 3次，最后加入DAPI染核5 min，PBS沖洗干凈后甘油封片，熒光顯微鏡下觀察。

1.2.4Transwell小室遷移實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力 將8 μm的Transwell小室放入接種CAFs的24孔培養(yǎng)板中，加入10%FBS的RPMI1640培養(yǎng)基600 μl/孔，并向小室里加入無(wú)血清培養(yǎng)基制成的腫瘤細(xì)胞懸液(1×106個(gè)/ml)，200 μl/孔。每組重復(fù)3個(gè)樣本，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h； 取出Transwell小室，去除未穿膜細(xì)胞后甲醇固定30 min，PBS清洗后用1%結(jié)晶紫染色20 min。顯微鏡下計(jì)數(shù)穿膜細(xì)胞。

1.2.5Western blot 檢測(cè)各組細(xì)胞目標(biāo)蛋白的表達(dá)情況 BCA蛋白濃度試劑盒測(cè)定蛋白濃度后，取等量蛋白質(zhì)電泳后轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上；3%脫脂奶粉封閉洗脫后，一抗4℃孵育過(guò)夜，洗膜后加入二抗，室溫下孵育2 h；再次洗膜后在暗室進(jìn)行增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光(ECL)顯影，用圖像分析軟件Quantity One分析各個(gè)條帶的光密度值。

1.2.6實(shí)時(shí)定量PCR 檢測(cè)α-SMA和Thy-1的表達(dá) 收集各組細(xì)胞，TRIZOL提取細(xì)胞總RNA，測(cè)其濃度和純度后用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒獲得cDNA，以cDNA為模板利用ABI7500 Fast System進(jìn)行PCR擴(kuò)增。并將GAPDH設(shè)置為內(nèi)參基因。各個(gè)引物序列如下：α-SMA:上游5′-CAGGGCTGTTTTCCCATCCAT-3′，下游5′-CCATGTTCTATCGGGTACTTC-3′; Thy-1:上游 5′-CGGTCCAGTTGCCTTCTCCC-3′，下游 5′-GAGTGGCTGTCTGTGTGGGG-3′;GAPDH:上游5′-CCTCAACGACCACTGTCA-3′，下游 5′-TTACTCCTTGGAGGCCATGT-3′。PCR反應(yīng)條件如下：95℃變性30 s；95℃、5 s，60℃、34 s，循環(huán)40次。每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。并采用2-ΔΔCT來(lái)分析目的基因的表達(dá)。

2 結(jié)果

2.1胃癌患者分離的原代細(xì)胞CAFs/NFs的形態(tài)觀察與鑒定 從形態(tài)學(xué)而言，分離出的CAFs呈紡錘形，長(zhǎng)梭形或星狀的形態(tài)，與NFs相比并未見(jiàn)顯著的差異。CAFs也可呈現(xiàn)三邊形或多邊形，傳代后CAFs分裂周期變短并出現(xiàn)偽足和胞突，當(dāng)細(xì)胞密度較低時(shí)，細(xì)胞之間可呈現(xiàn)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)；而當(dāng)細(xì)胞密度較高時(shí)，細(xì)胞之間接觸抑制或密度抑制減弱，并融合成纖維束狀結(jié)構(gòu)。就分子學(xué)表達(dá)而言，由于α-SMA在CAFs和NFs中表達(dá)具有明顯差異，可作為鑒定這兩種成纖維細(xì)胞的標(biāo)記性分子之一。因此，本實(shí)驗(yàn)對(duì)分離出的成纖維細(xì)胞進(jìn)行鑒定時(shí)，采用實(shí)時(shí)定量PCR，Western blot和免疫熒光技術(shù)檢測(cè)α-SMA的基因和蛋白表達(dá)情況。結(jié)果顯示，分離的CAFs細(xì)胞中α-SMA的基因和蛋白質(zhì)的表達(dá)量明顯高于NFs細(xì)胞內(nèi)的分子表達(dá)量(t=3.89，P<0.01；t=4.01，P<0.01)，此外，可見(jiàn)CAFs胞質(zhì)內(nèi)α-SMA的熒光強(qiáng)度有明顯的配對(duì)NFs細(xì)胞，見(jiàn)表1，圖1、2。

2.2檢測(cè)Thy-1在各組細(xì)胞內(nèi)的表達(dá) 采用實(shí)時(shí)定量PCR和Western blot技術(shù)分析間質(zhì)成纖維細(xì)胞和胃癌細(xì)胞系內(nèi)Thy-1的mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)情況。結(jié)果顯示，胃癌細(xì)胞系中并未見(jiàn)明顯的Thy-1的表達(dá)，而間質(zhì)成纖維細(xì)胞CAFs/NFs高表達(dá)Thy-1；而且與臨近的NFs細(xì)胞相比，患者的CAFs中Thy-1的表達(dá)量均明顯升高，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表2、圖3。

2.3CAFs細(xì)胞內(nèi)Thy-1調(diào)控胃癌細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)移的相關(guān)研究 采用Western blot技術(shù)檢測(cè)共培養(yǎng)體系中胃癌細(xì)胞系上皮及間質(zhì)標(biāo)記分子的表達(dá)變化來(lái)分析Thy-1在間質(zhì)轉(zhuǎn)化中的生物學(xué)作用。結(jié)果顯示，與胃癌細(xì)胞組相比，共培養(yǎng)體系中胃癌細(xì)胞上皮細(xì)胞標(biāo)記分子表達(dá)明顯減少(P<0.01)，間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記分子的表達(dá)量卻明顯升高(P<0.01)；而與陰性對(duì)照組相比，Thy-1 Ab組卻能明顯減弱這種共培養(yǎng)體系的上皮細(xì)胞標(biāo)記分子下調(diào)和間質(zhì)標(biāo)記分子上調(diào)表達(dá)量的生物學(xué)作用，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見(jiàn)圖4。

GroupsExpressionofproteinExpressionofmRNA CAFs6 02±1 711)3 40±2 021) NFs3 52±1 031 13±3 19

Note：Compared to the NFs group,1)P<0.01.

圖1 胃癌組織中CAFs和NFs中α-SMA的mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)水平Fig.1 Protein and mRAN expression of α-SMA of CAFs and NFs from gastric cancerNote:Compared to the NFs group,*.P<0.01.

圖2 間接免疫熒光技術(shù)檢測(cè)CAFs和NFs中α-SMA蛋白的表達(dá)Fig.2 Protein content of α-SMA in CAFs/NFs by indirect immunofluorescence technique

GroupsExpressionofproteinExpressionofmRNA SNU?10 81±1 430 95±4 19 MKN450 63±2 941 11±2 14 CAFs?12 46±2 101)2 85±3 791) NFs?11 29±3 121 21±2 64 CAFs?23 25±1 261)4 51±3 841) NFs?22 46±2 912 39±3 51 CAFs?33 83±2 411)3 95±1 292) NFs?31 53±4 012 51±3 03

Note：Compared to the NFs group,1)P<0.01,2)P<0.01.

圖3 各組細(xì)胞內(nèi)Thy-1的蛋白和mRNA的表達(dá)Fig.3 Protein and mRAN expression of Thy-1 in individual groupsNote:Compared to the NFs group,*.P<0.01.

圖4 Thy-1調(diào)控胃癌細(xì)胞(SNU-1和MKN45)發(fā)生間質(zhì)轉(zhuǎn)化的相關(guān)分子蛋白表達(dá)Fig.4 Protein levels of molecules regarding to EMT mediating gastric cancer cells(SNU-1 and MKN45)Note:*.P<0.01.

圖5 Thy-1調(diào)控胃癌細(xì)胞(SNU-1和MKN45)發(fā)生遷移運(yùn)動(dòng)的細(xì)胞數(shù)Fig.5 Migration numbers from gastric cancer cells(SNU-1 and MKN45) regulated by Thy-1Note:*.P<0.01.

采用Transwell小室檢測(cè)共培養(yǎng)體系中細(xì)胞的遷移能力以分析CAFs對(duì)腫瘤細(xì)胞遷移作用的影響。結(jié)果顯示，與胃癌細(xì)胞相比，共培養(yǎng)體系明顯升高了細(xì)胞的遷移運(yùn)動(dòng)能力(P<0.01);而與陰性對(duì)照組相比，Thy-1 Ab組也能明顯拮抗共培養(yǎng)體系中細(xì)胞遷移運(yùn)動(dòng)的能力，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。具體見(jiàn)圖5。

3 討論

成纖維細(xì)胞是腫瘤微環(huán)境中存在的主要間質(zhì)細(xì)胞，但其在腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中具體的生物學(xué)作用尚不能完全明確，CAFs激活后可能通過(guò)旁分泌的方式促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移，研究已經(jīng)證實(shí)CAFs與相應(yīng)腫瘤細(xì)胞共培養(yǎng)，導(dǎo)致乳腺癌、結(jié)腸癌和鱗狀細(xì)胞癌中CAFs的活化，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的侵襲能力[8-10]。而對(duì)于CAFs相關(guān)分子生物學(xué)功能研究的前提是成功分離原代細(xì)胞。CAFs與NFs具有不同的生物學(xué)功能和表型特征，在原代細(xì)胞培養(yǎng)和分離鑒定中，本研究參照了國(guó)外學(xué)者對(duì)前列腺癌、乳腺癌和胃癌等腫瘤相關(guān)的CAFs的分離純化方法[11-13]。本研究通過(guò)對(duì)分離出的成纖維細(xì)胞進(jìn)行α-SMA蛋白質(zhì)和mRNA表達(dá)量的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，分離原代細(xì)胞具有典型的CAFs表型，可以作為后續(xù)的相關(guān)侵襲實(shí)驗(yàn)和EMT實(shí)驗(yàn)的相關(guān)研究。

Thy-1是相對(duì)分子質(zhì)量為25 000～37 000 Da的磷脂酰肌醇糖蛋白[14]，幾乎在表達(dá)目前研究過(guò)的所有類(lèi)型的成纖維細(xì)胞中調(diào)控多種生物學(xué)功能。不僅支持成纖維細(xì)胞的結(jié)構(gòu)，而且能平衡細(xì)胞增殖、遷移和調(diào)節(jié)免疫炎癥介質(zhì)合成。采用Western blot和實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)檢測(cè)不同組細(xì)胞內(nèi)Thy-1的蛋白質(zhì)和mRNA的表達(dá)量。Thy-1在單純的腫瘤細(xì)胞中表達(dá)較弱，主要在共培養(yǎng)體系的CAFs中高表達(dá)；分離患者組織的CAFs，發(fā)現(xiàn)其Thy-1的表達(dá)量比配對(duì)的NFs明顯升高，這些均提示Thy-1可能在CAFs中過(guò)度表達(dá)而調(diào)控一系列的生物學(xué)功能，但具體機(jī)制有待進(jìn)一步深入研究。

先前學(xué)者發(fā)現(xiàn)，單純的大鼠結(jié)腸癌細(xì)胞體外培養(yǎng)時(shí)侵襲力較弱，但當(dāng)它與CAFs共培養(yǎng)時(shí)，侵襲能力卻得到明顯的升高，而且CAFs的數(shù)量與腫瘤細(xì)胞對(duì)淋巴管和淋巴結(jié)的侵襲性呈正相關(guān)[15]。盡管多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)CAFs對(duì)腫瘤細(xì)胞的遷移能力有影響，但關(guān)于CAFs對(duì)胃癌細(xì)胞的影響卻較少報(bào)道。本研究將成功分離的CAFs與胃癌細(xì)胞系共同培養(yǎng)，并以配對(duì)的NFs作為對(duì)照，分析CAFs對(duì)胃癌細(xì)胞的遷移能力的影響。結(jié)果證實(shí)，與結(jié)腸癌細(xì)胞相類(lèi)似，單純的胃癌細(xì)胞系侵襲能力較弱，但共培養(yǎng)體系的CAFs卻能明顯增強(qiáng)胃癌細(xì)胞的遷移侵襲能力，這一生物學(xué)作用卻被抗Thy-1單克隆抗體明顯抑制。此外，本研究還涉及Thy-1調(diào)控腫瘤細(xì)胞發(fā)生EMT的生物學(xué)作用。腫瘤細(xì)胞發(fā)生浸潤(rùn)和遷移的主要原因是獲得某些表型特征從而導(dǎo)致上皮細(xì)胞失去極性，細(xì)胞之間的黏附能力減弱導(dǎo)致上皮細(xì)胞具有間質(zhì)細(xì)胞形態(tài)特征。其中E-cad的減少或丟失是EMT形成的最重要的標(biāo)志性變化。培養(yǎng)體系中EMT相關(guān)的蛋白分子E-cad、N-cad和ZEB2都發(fā)生明顯的改變，均提示腫瘤細(xì)胞在CAFs的作用下可能通過(guò)EMT增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的遷移能力。前期研究發(fā)現(xiàn)CAFs中存在過(guò)度表達(dá)的Thy-1，以此為切入點(diǎn)，阻斷Thy-1的表達(dá)后，一定程度上阻止上皮細(xì)胞E-cad的減弱或缺失以及間質(zhì)細(xì)胞表型的過(guò)度表達(dá)。

總之，CAFs可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生EMT使得細(xì)胞失去上皮細(xì)胞極性和與基底膜之間的連接而侵襲周?chē)M織。而Thy-1的過(guò)表達(dá)可能參與了胃癌細(xì)胞的EMT和侵襲效應(yīng)。但CAFs細(xì)胞內(nèi)Thy-1是如何參與調(diào)控這一系列的生物學(xué)功能以及調(diào)動(dòng)激活哪些下游分子等，這些均需進(jìn)一步探索。