李 霞 張鐵軍 封亞麗

(河北省中醫(yī)院心內(nèi)科,石家莊 050011)

心血管并發(fā)癥是糖尿病患者發(fā)病和死亡的主要原因，糖尿病性心肌病是糖尿病主要的心血管并發(fā)癥之一，其主要特征表現(xiàn)為心臟舒張功能障礙，心肌組織病變，氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)增強等[1,2]。由于糖尿病心肌病病因及發(fā)展的多因素性，目前還沒有專門針對糖尿病心肌病的有效治療方法。尋找有效的糖尿病性心肌病治療方法對人類健康醫(yī)療衛(wèi)生事業(yè)具有重要意義。莫諾苷(化學(xué)結(jié)構(gòu)式見圖1)是山茱萸和接骨木的主要活性物質(zhì)，屬于環(huán)烯醚萜苷類，具有抗病毒、抗氧化、抗癌及肝臟保護等活性，有利于神經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)和消化系統(tǒng)[3,4]。本研究主要目的是利用高糖飲食聯(lián)合鏈脲佐菌素(Streptozocin,STZ)誘導(dǎo)糖尿病大鼠模型，再對糖尿病大鼠進行冠狀動脈結(jié)扎建立糖尿病缺血再灌注模型，通過檢測大鼠心臟功能指標、心肌梗死面積、心肌損傷標記蛋白、氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)及AMPKα/PGC-1α/GLU4通路探究莫諾苷對糖尿病大鼠缺血再灌注損傷的影響及其分子機制。

1 材料與方法

1.1實驗動物及主要試劑 60只體重200～300 g雄性SD大鼠來源于中國科學(xué)院實驗動物中心。莫諾苷和STZ購自Sigma公司。ELISA試劑盒購自RD公司。超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)和丙二醛(Malondiadehyde,MDA)檢測試劑盒購自江蘇碧云天公司?？辜〖t蛋白(Myoglobin,Mb)抗體、抗肌酸激酶同工酶(Creatine kinase-MB,CK-MB)抗體、抗肌鈣蛋白I(Troponin-I,cTn I)抗體、抗AMPKα1抗體、抗PGC-1α抗體和抗GLUT4抗體購自Abcam公司。

圖1 莫諾苷化學(xué)結(jié)構(gòu)式Fig.1 Chemical structure of morroniside

1.2方法

1.2.1動物分組及模型建立 60只大鼠高糖飼養(yǎng)8周后，一次性腹腔注射STZ(60 mg/kg)建立糖尿病大鼠模型，72 h后血糖高于16.7 mmol/L為建模成功。隨機挑選40只糖尿病大鼠分為4組：對照組(DM)；對照加藥組(DM+莫諾苷)；模型組(I/R+DM)；加藥組(I/R+DM+莫諾苷)。對照加藥組和加藥組每天100 mg/kg 莫諾苷口服喂養(yǎng)大鼠，共25 d。對照組和模型組用生理鹽水代替莫諾苷。模型組和加藥組進行冠狀動脈結(jié)扎術(shù)建立缺血再灌注模型，對照組和對照加藥組進行假手術(shù)。

1.2.2蘇木素伊紅(Hematoxylin-eosin,HE)染色 頸椎脫臼法處死大鼠后取左心室心肌組織用PBS清洗8次，去掉壞死組織及血凝塊。用4% 的多聚甲醛在4℃下固定24 h。PBS清洗3次，再用30%、50% 和70% 的酒精依次脫水。去除酒精脫水機中脫水，然后進行石蠟包埋。切片后按照HE染色液說明書進行染色。光鏡下觀察心肌損傷情況。

1.2.3ELISA檢測 收集各組待測大鼠血清，按照ELISA試劑盒說明書進行檢測，樣品加入反應(yīng)孔后37℃孵育45 min后用洗滌液洗滌4次，然后加入生物素標記的抗體37℃反應(yīng)30 min，洗滌后加鏈霉親和素-HRP 混勻37℃反應(yīng)30 min。最后加入顯色劑避光顯色15 min后加終止液終止反應(yīng)，450 nm處檢測吸光值。

1.2.4蛋白印跡 首先用PBS將待測組織細胞清洗3次后，加入含蛋白酶抑制劑的細胞裂解液裂解進行總蛋白提取，100℃變性5 min。然后等量蛋白進行SDS-PAGE凝膠電泳分離并轉(zhuǎn)至PVDF膜，經(jīng)5%的BSA封閉1 h后加入相應(yīng)的一抗，4℃過夜孵育，第2天加入辣根過氧化物酶標記的二抗，室溫孵育1.5 h。最后加入發(fā)光液后于凝膠成像儀進行曝光拍照并統(tǒng)計灰度值計算相對表達量。

1.3統(tǒng)計學(xué)分析 用SPSS16.0軟件對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析，兩兩比較用獨立的t檢驗。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1莫諾苷對糖尿病缺血再灌注大鼠心臟功能的影響 通過檢測各項心臟功能指標和心肌梗死面積，探究莫諾苷對糖尿病缺血再灌注大鼠心臟功能的影響。圖2A～C顯示，糖尿病大鼠在缺血再灌注后平均動脈壓(Mean arterial pressure,MAP)，心率(Heart rate,HR)和左心室收縮壓(Left ventricular systolic pressure,LVSP)明顯降低(P<0.05)。莫諾苷處理會提高糖尿病缺血再灌注大鼠MAP、HR和LVSP水平(P<0.05)。由圖2D可知，糖尿病缺血再灌注大鼠心肌梗死面積明顯大于糖尿病大鼠(P<0.05)。莫諾苷可減少糖尿病缺血再灌注大鼠心肌梗死面積(P<0.05)。上述結(jié)果表明，莫諾苷會提高糖尿病缺血再灌注大鼠心臟功能。

2.2莫諾苷對糖尿病缺血再灌注大鼠心肌組織病變的影響 通過HE染色觀察莫諾苷對糖尿病缺血再灌注大鼠心肌組織病變的影響。如圖3所示，DM組大鼠心肌組織出現(xiàn)細胞排列輕度紊亂，少數(shù)心肌纖維斷裂；DM+莫諾苷組大鼠心肌組織結(jié)構(gòu)致密整齊，心肌纖維完整，無心肌纖維斷裂；I/R+DM模型組大鼠心肌組織出現(xiàn)嚴重的細胞排列紊亂，細胞腫脹，多數(shù)心肌纖維斷裂；I/R+DM+莫諾苷加藥組較I/R+DM組心肌組織病變程度明顯減輕。由此可見， 莫諾苷可改善糖尿病大鼠缺血再灌注導(dǎo)致的心肌組織病變。

圖2 心臟功能指標(A～C)和心肌梗死面積(D)Fig.2 Cardiac function index (A-C) and myocardial infarct area (D)Note:*.P<0.05 vs DM group；#.P<0.05 vs DM+I/R.

2.3莫諾苷對糖尿病大鼠缺血再灌注誘導(dǎo)的心肌損傷標記蛋白表達的影響 為分析莫諾苷對缺血再灌注誘導(dǎo)的心肌損傷的影響，蛋白印跡檢測心肌損傷標記蛋白Mb、CK-MB和cTn I的表達。由圖4可知，缺血再灌注會導(dǎo)致Mb、CK-MB和cTn I表達升高(P<0.05)。莫諾苷處理可降低缺血再灌誘導(dǎo)的Mb、CK-MB和cTn I表達的增強(P<0.05)。上述結(jié)果表明，莫諾苷可抑制糖尿病大鼠缺血再灌注誘導(dǎo)的心肌損傷標記蛋白Mb、CK-MB和cTn I表達的上升。

2.4莫諾苷可降低糖尿病大鼠缺血再灌注誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng) 通過ELISA檢測炎癥因子TNF-α、IL-6和IL-10水平，分析莫諾苷對缺血再灌注誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)的影響。圖5顯示，I/R+DM模型組促炎因子TNF-α和 IL-6水平明顯高于DM組，抗炎因子IL-10水平明顯低于DM組(P<0.05)。與I/R+DM模型組相比，加藥組TNF-α和 IL-6水平明顯下降，IL-10水平明顯升高(P<0.05)。由此可見，莫諾苷處理可減弱糖尿病大鼠缺血再灌注誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)的升高。

2.5莫諾苷會抑制糖尿病大鼠缺血再灌注誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激 利用ELISA檢測SOD和MDA水平探究莫諾苷對缺血再灌注誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激的影響。如圖6所示，I/R+DM模型組SOD水平明顯低于DM組，MDA水平則明顯高于DM組(P<0.05)。與I/R+DM模型組相比，莫諾苷處理可降低缺血再灌注誘導(dǎo)的SOD水平的下降和MDA水平的升高(P<0.05)。以上結(jié)果說明，莫諾苷會抑制糖尿病大鼠缺血再灌注誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激。

圖3 HE染色檢測心肌組織病變Fig.3 Pathological changes of liver tissues were observed by HE staining

圖4 蛋白印跡檢測心肌損傷標記蛋白表達Fig.4 Expression of myocardial injury marker proteins was detected by Western blotNote:*.P<0.05 vs DM group；#.P<0.05 vs DM+I/R.

圖5 ELISA檢測炎癥因子水平Fig.5 Levels of inflammatory factor were measured by ELISANote:*.P<0.05 vs DM group；#.P<0.05 vs DM+I/R.

圖6 ELISA檢測氧化應(yīng)激指標Fig.6 Indexes of oxidative stress were tested by ELISANote:*.P<0.05 vs DM group；#.P<0.05 vs DM+I/R.

圖7 蛋白印跡檢測AMPK通路相關(guān)蛋白表達Fig.7 Expression of AMPK pathway related proteins was detected by Western blotNote:*.P<0.05 vs DM group；#.P<0.05 vs DM+I/R.

2.6莫諾苷對AMPK通路相關(guān)蛋白表達的影響 為進一步分析莫諾苷保護糖尿病大鼠缺血再灌注損傷的分子機制，蛋白印跡檢測AMPK通路相關(guān)蛋白AMPKα1、PGC-1α和GLUT4表達。圖7顯示，I/R+DM模型組AMPKα1、PGC-1α和GLUT4表達水平明顯低于DM組(P<0.05)。加藥組AMPKα1、PGC-1α和GLUT4蛋白水平明顯高于I/R+DM模型組。由此可見，莫諾苷可降低缺糖尿病大鼠缺血再灌注誘導(dǎo)的AMPKα1、PGC-1α和GLUT4表達的增強。

3 討論

目前，糖尿病心血管并發(fā)癥的傳統(tǒng)治療藥物如抗糖尿病藥劑，以及細胞和線粒體脂肪酸吸收抑制劑等主要功效在于保持心臟代謝平衡，但還不能改善糖尿病心肌病其他的癥狀[5]。許多植物天然產(chǎn)物由于其多方面的生物活性而受到越來越多的關(guān)注。

心臟功能障礙是糖尿病大鼠心肌損傷的主要病征之一。多種天然產(chǎn)物具有提高心臟功能的作用。Diao等[6]發(fā)現(xiàn)在糖尿病大鼠缺血再灌注模型中，落新婦苷處理可提高LVSP水平，降低心肌梗死面積，改善心肌損傷組織病理學(xué)變化。據(jù)報道在糖尿病大鼠中，綠茶的主要活性物質(zhì)表沒食子兒茶素沒食子酸酯可抑制缺血再灌注導(dǎo)致的LVSP水平的降低，減少心肌梗死面積[7]。有數(shù)據(jù)顯示莫諾苷具有改善糖尿病大鼠肝臟組織病變的作用[8]。有研究發(fā)現(xiàn)在局灶性腦缺血再灌注大鼠模型中，莫諾苷可降低腦梗死面積[9]。本文結(jié)果顯示，莫諾苷會抑制糖尿病大鼠缺血再灌注導(dǎo)致的MAP、HR和LVSP水平的降低和心肌梗死面積的增大，提高心臟功能，改善心肌組織病變。

大量研究表明許多天然植物提取物可抑制心肌損傷標記物的釋放。有數(shù)據(jù)表明在糖尿病大鼠中，山柰黃酮醇可減輕缺血再灌注誘導(dǎo)的CK-MB水平的增加[10]。有研究發(fā)現(xiàn)在糖尿病大鼠缺血再灌注模型中沒食子酸具有降低CK-MB和cTn I水平的功效[11]。據(jù)報道在糖尿病大鼠中，淫羊藿苷可減輕缺血再灌注誘導(dǎo)的心肌受損，抑制CK-MB活性的增強[12]。Suchal等[13]發(fā)現(xiàn)在糖尿病缺血再灌注大鼠模型中，芒果苷可抑制CK-MB活性的增強。本研究結(jié)果表明，莫諾苷會減弱糖尿病大鼠缺血再灌注誘導(dǎo)的Mb、CK-MB和cTn I表達的上升。

炎癥反應(yīng)的增強是各類疾病的普遍現(xiàn)象，越來越多的研究表明多種植物提取物具有抗炎的作用。有數(shù)據(jù)顯示毛地黃黃酮會減少糖尿病大鼠缺血再灌注導(dǎo)致的TNF-α和 IL-6的釋放[14]。Duan等[15]發(fā)現(xiàn)竹節(jié)人參皂甙Ⅳa會減弱糖尿病大鼠缺血再灌注引起TNF-α和 IL-6水平的升高。據(jù)報道莫諾苷可降低糖尿病大鼠腎臟的炎癥反應(yīng)[16]。有研究發(fā)現(xiàn)莫諾苷可抑制大腦局部缺血大鼠IL-1β的釋放，減輕血腦屏障損傷導(dǎo)致的炎癥反應(yīng)[17]。本文結(jié)果顯示，在糖尿病大鼠中，莫諾苷會抑制缺血再灌注引發(fā)的TNF-α和 IL-6水平的上升及IL-10水平的下降。

氧化應(yīng)激是許多疾病的主要特征之一，許多植物提取物具有降低氧化應(yīng)激的功效。Silawat等[18]發(fā)現(xiàn)訶子次酸會減弱糖尿病大鼠缺血再灌注誘導(dǎo)的MDA水平的升高和SOD活性的降低。據(jù)報道毛地黃黃酮可抑制糖尿病大鼠缺血再灌注誘導(dǎo)的心臟MDA水平的上升[19]。有研究發(fā)現(xiàn)人參皂苷Rb1會減弱糖尿病大鼠中缺血再灌注引發(fā)的MDA水平的升高和SOD活性的下降[20]。有研究表明莫諾苷可降低糖尿病大鼠MDA水平，增強SOD活性[21]。據(jù)報道莫諾苷會抑制局灶性腦缺血導(dǎo)致MDA水平的上升和SOD活性的降低[22]。本研究結(jié)果表明，在糖尿病缺血再灌注大鼠中，莫諾苷可提高SOD活性，降低MDA水平。

AMPK/PGC-1α/GLU4信號通路在糖尿病性心肌病中起著重要的調(diào)控作用[23]。有研究發(fā)現(xiàn)來源于太白楤木的總皂苷可通過激活A(yù)MPK信號通路改善缺血再灌注誘導(dǎo)的心肌損傷[24]。有數(shù)據(jù)表明在糖尿病大鼠中，紫鉚黃酮可增強AMPK表達，通過AMPK通路減輕缺血再灌注導(dǎo)致的心肌損傷[25]。據(jù)報道姜黃素衍生物B06可降低高脂飲食大鼠和糖尿病大鼠AMPKα的表達，通過AMPK信號通路改善糖尿病心肌損傷[26]。Chen等[27]發(fā)現(xiàn)小檗堿可通過激活A(yù)MPK降低糖尿病大鼠缺血再灌注引起的心臟功能受損程度。本文結(jié)果顯示，莫諾苷可抑制AMPKα1、PGC-1α和GLUT4表達的增強，改善糖尿病缺血再灌注大鼠心肌損傷。

本研究表明，在糖尿病缺血再灌注大鼠中，莫諾苷可提高MAP、HR和LVSP水平；降低心肌梗死面積；改善心肌組織病變；減弱Mb、CK-MB和cTn I表達；抑制TNF-α和 IL-6水平的上升及IL-10水平的下降；提高SOD活性，降低MDA水平；增強AMPKα1、PGC-1α和GLUT4表達。綜上所述，莫諾苷可通過激活A(yù)MPKα/PGC-1α/GLUT4通路減輕糖尿病大鼠缺血再灌注心肌損傷。下一步計劃研究莫諾苷對其他糖尿病并發(fā)癥的影響，為開發(fā)糖尿病并發(fā)癥治療策略奠定基礎(chǔ)。