曾建梅 徐 輝

(西南醫(yī)科大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院消化內(nèi)科，瀘州 646000)

炎癥性腸病是一種病因未明的腸道炎癥疾病，主要包括潰瘍性結(jié)腸炎(Ulcerative colitis，UC)和克羅恩病(Crohn′s disease,CD)[1],UC的病理特征主要以結(jié)腸黏膜炎癥和潰瘍形成為主，患者常伴有腹痛腹瀉、膿血便[2]。UC是一種慢性進(jìn)行性疾病，目前對(duì)于UC的發(fā)病機(jī)制并不明確，可能原因有免疫失衡、環(huán)境和外界感染有關(guān)[3]。免疫失衡在UC進(jìn)程及預(yù)后中的作用已得到公認(rèn)[4]，細(xì)胞因子的大量釋放進(jìn)一步加劇了腸道炎癥反應(yīng)，已有研究證明經(jīng)典炎癥信號(hào)通路NF-κB在炎癥性腸病中處于顯著激活狀態(tài)，同時(shí)此信號(hào)通路調(diào)控的下游炎癥因子介質(zhì)參與疾病的發(fā)生與發(fā)展[5]。噁唑酮是一種半抗原，可以誘導(dǎo)小鼠接觸部位產(chǎn)生過(guò)敏性反應(yīng)[6]，目前已證明噁唑酮誘導(dǎo)的結(jié)腸炎是由IL-4介導(dǎo)的Th2型免疫反應(yīng)[7]，與臨床UC癥狀相似，可作為理想的人類(lèi)UC的動(dòng)物模型，探究藥物治療作用與機(jī)制，本研究旨在揭示臨床治療潰瘍性結(jié)腸炎一線藥物美沙拉嗪在噁唑酮誘導(dǎo)的UC模型中作用機(jī)制。

本研究中我們首次致敏采用3%噁唑酮乙醇溶液涂抹小鼠皮膚，24 h后使用同樣濃度的噁唑酮溶液涂抹小鼠皮膚進(jìn)行二次致敏，5 d后采用硅膠管經(jīng)肛門(mén)插入小鼠腸道，灌注1%的噁唑酮乙醇溶液誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生UC，選擇經(jīng)典炎癥信號(hào)通路NF-κB及其臨床UC治療一線藥物美沙拉嗪為研究對(duì)象。研究美沙拉嗪在治療噁唑酮誘導(dǎo)的小鼠UC中的作用與機(jī)制。

1 材料與方法

1.1動(dòng)物 于揚(yáng)州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心購(gòu)買(mǎi)60只7～8周齡的BALB/c雌性小鼠，體重26～28 g，按SPF動(dòng)物飼養(yǎng)要求飼養(yǎng)，自購(gòu)買(mǎi)之日起適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。

1.2方法

1.2.1造模 結(jié)束適應(yīng)性飼養(yǎng)后小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、美沙拉嗪低劑量給藥組和高劑量給藥組，每組15只小鼠。劑量給藥組和所有小鼠在腹部去毛產(chǎn)生2 cm×2 cm大小區(qū)域，采用關(guān)麗華等[8]的實(shí)驗(yàn)操作方法，第一次致敏：在此無(wú)毛區(qū)對(duì)照組涂抹0.2 ml純乙醇，模型組和給藥組涂抹2 ml 3%的噁唑酮乙醇溶液；第二次致敏：在第一次致敏結(jié)束后24 h，所有組小鼠按第一次致敏劑量重復(fù)致敏操作；第二次致敏結(jié)束5 d后，所有小鼠禁食不禁水24 h，使用10%水合氯醛水溶液按3 μl/g體重腹腔注射麻醉小鼠，對(duì)照組小鼠按0.15 ml/g體重使用硅膠管經(jīng)腸灌注50%乙醇水溶液，灌注結(jié)束后倒置小鼠30 s，同時(shí)給藥組和模型組小鼠按相等劑量相同操作灌腸1%噁唑酮乙醇(50%)溶液。造模結(jié)束后給予小鼠正常飲食和自由飲水。

1.2.2治療 本研究采用治療給藥方式，灌腸造模后分別給予低高劑量給藥組小鼠灌胃100、200 mg/kg 體重的美沙拉嗪0.5%的羧甲基纖維素鈉懸濁液，對(duì)照組和模型組分別按體重灌胃相同體積的0.5%羧甲基纖維素鈉。每天定時(shí)灌胃1次，記錄小鼠體重變化，連續(xù)治療7 d。

1.2.3體重變化情況 結(jié)束適應(yīng)性喂養(yǎng)后，整理所有小鼠在造模治療期間體重變化趨勢(shì)。

1.2.4結(jié)腸病理學(xué)損傷程度評(píng)估 給藥治療結(jié)束后，所有小鼠摘眼球取血后處死。保留小鼠結(jié)腸部位做后續(xù)研究，切取同一部位結(jié)腸進(jìn)行石蠟包埋和HE染色，在組織學(xué)水平綜合評(píng)價(jià)結(jié)腸病理學(xué)損傷程度。

1.2.5小鼠機(jī)體炎癥反應(yīng)程度 ELISA法測(cè)定小鼠血清中炎癥因子IL-4和IL-13水平，檢測(cè)機(jī)體Th2型炎癥反應(yīng)程度。

1.2.6生理生化指標(biāo)檢測(cè) 取小鼠同一部位結(jié)腸組織，勻漿后取上清測(cè)定組織髓過(guò)氧化物酶(Myeloperoxidase，MPO)。

1.2.7小鼠組織NF-κB通路關(guān)鍵蛋白表達(dá)情況 Western blot法檢測(cè)NF-κB信號(hào)通路中關(guān)鍵調(diào)控蛋白的表達(dá)水平，研究NF-κB信號(hào)通路在噁唑酮誘導(dǎo)的小鼠潰瘍性結(jié)腸炎模型中的作用。

2 結(jié)果

2.1每組小鼠體重變化比較 小鼠體重是一個(gè)直觀表示小鼠機(jī)體生長(zhǎng)發(fā)育水平的關(guān)鍵指標(biāo)，能夠準(zhǔn)確反映小鼠生理和病理狀態(tài)。模型組小鼠造模后體重明顯下降，同時(shí)小鼠活動(dòng)狀態(tài)明顯弱于正常對(duì)照組，差異明顯，給藥組小鼠總體體重有所恢復(fù)，表明美沙拉嗪在一定程度上有助于改善小鼠UC，結(jié)果見(jiàn)圖1。

2.2小鼠結(jié)腸組織HE染色 在組織學(xué)水平進(jìn)行石蠟包埋切片之后，HE染色檢測(cè)小鼠結(jié)腸病變情況以及給藥治療后小鼠結(jié)腸組織病變恢復(fù)狀態(tài)。從結(jié)腸形態(tài)結(jié)構(gòu)圖可知：模型組小鼠結(jié)腸組織基本結(jié)構(gòu)損傷嚴(yán)重，隱窩消失，伴有明顯的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。給藥組能夠有效地緩解結(jié)腸損傷，能夠明顯恢復(fù)小鼠腸道結(jié)構(gòu)。結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖1 每組小鼠體重變化趨勢(shì)Fig.1 Trend of weight change in each group of mice

圖2 小鼠結(jié)腸組織HE染色Fig.2 HE staining of colonic tissue in mice

GroupsDose(mg/kg)MPO(U/g) Controlgroup0 77±0 25 Modelgroup2 02±0 721) Lowdosegroup1001 54±0 442) Highdosegroup2001 37±0 622)

Note：Compared with control group,1)P<0.01;compared with model group,2)P<0.001.

表2美沙拉嗪對(duì)噁唑酮誘導(dǎo)的結(jié)腸炎小鼠血清Th2細(xì)胞因子水平的影響

Tab.2EffectofmesalazineonserumTh2cytokinesinoxazoloneinducedcolitismice

GroupsIL?4(ng/L)IL?13(ng/L) Controlgroup46 38±7 62 19 86±3 47 Modelgroup179 67±11 381)52 51±5 371) Lowdosegroup89 42±9 282)31 49±4 662) Highdosegroup93 41±9 652)34 33±5 192)

Note：Compared with control group,1)P<0.01;compared with model group,2)P<0.001.

圖3 美沙拉嗪對(duì)小鼠結(jié)腸組織經(jīng)典炎性信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白的影響Fig.3 Effect of mesalazine on key proteins of classical inflammatory signaling pathway in colon tissue of miceNote:1.Control group;2.Model group;3.Low dose group;4.High dose group.

2.3美沙拉嗪對(duì)噁唑酮誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎結(jié)腸組織中MPO含量的影響 MPO作為中性粒細(xì)胞的產(chǎn)物，可用于評(píng)價(jià)中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)水平。與對(duì)照組相比模型組結(jié)腸組織MPO顯著增高(P<0.05)；與模型組相比，給藥治療后小鼠的結(jié)腸組織MPO含量顯著下降(P<0.05)。結(jié)果見(jiàn)表1。

2.4美沙拉嗪對(duì)噁唑酮誘導(dǎo)的結(jié)腸炎小鼠血清Th2細(xì)胞因子水平的影響 噁唑酮誘導(dǎo)的小鼠UC病癥接近于人UC，屬于Th2型免疫反應(yīng)。使用ELISA法檢測(cè)小鼠血清中Th2型炎癥因子的表達(dá)水平。與對(duì)照組相比，模型組小鼠血清中IL-4、IL-13水平顯著升高(P<0.05),與模型組比較，給藥治療組小鼠血清中IL-4、IL-13表達(dá)顯著下降(P<0.05)，說(shuō)明美沙拉嗪能在一定程度上抑制Th2型細(xì)胞免疫反應(yīng)。結(jié)果見(jiàn)表2。

2.5小鼠結(jié)腸組織中NF-κB通路中關(guān)鍵蛋白的變化 與對(duì)照組相比，模型組小鼠結(jié)腸組織中p-p65、p-IκB蛋白的表達(dá)顯著增加，同時(shí)p65、IκB蛋白的降低，表明在噁唑酮誘導(dǎo)的UC中經(jīng)典炎癥信號(hào)通路處于激活狀態(tài)；與模型組比較，各給藥治療組小鼠結(jié)腸組織p-p65、p-IκB蛋白下調(diào)，說(shuō)明美沙拉嗪可以抑制NF-κB通路的激活，從而經(jīng)經(jīng)典炎癥通路發(fā)揮抗炎作用。結(jié)果見(jiàn)圖3。

3 討論

UC作為炎癥性腸病中的一大類(lèi)，其病變主要位于結(jié)腸黏膜及黏膜下層，易出現(xiàn)黏膜水腫、糜爛和潰瘍[2]。目前UC發(fā)病機(jī)制尚未明確，研究者認(rèn)為其與環(huán)境、免疫、遺傳等均具有密切關(guān)系[3]。免疫失衡在UC進(jìn)程及預(yù)后中的作用已得到公認(rèn)[4]，細(xì)胞因子的大量釋放進(jìn)一步加劇腸道炎癥損傷。研究者常利用動(dòng)物模型模擬人UC[9-11]，探究UC發(fā)病機(jī)制和藥物干預(yù)治療效果和治療機(jī)制。噁唑酮作為一種半抗原，能夠誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生過(guò)敏反應(yīng)，最終導(dǎo)致小鼠出現(xiàn)UC癥狀[6]，此種模型類(lèi)似于人UC，常被用于研究使用。經(jīng)典炎癥信號(hào)通路NF-κB與機(jī)體免疫和炎癥密切相關(guān)，在其余小鼠結(jié)腸炎模型組已驗(yàn)證其處于顯著激活狀態(tài)[5]，這與我們構(gòu)建的噁唑酮UC模型研究具有相似之處。同時(shí)已有報(bào)道稱(chēng)噁唑酮誘導(dǎo)的小鼠UC屬Th2型免疫反應(yīng)，我們研究發(fā)現(xiàn)Th2型細(xì)胞因子IL-4、IL-13在噁唑酮模型中處于上調(diào)狀態(tài)，這與關(guān)麗華等[8]的研究一致，證明了噁唑酮模型的有效性和特異性。

本次研究中我們選取了臨床上用于治療UC的一線藥物美沙拉嗪，通過(guò)建立有效的動(dòng)物模型，并且給予不同劑量的藥物治療誘導(dǎo)型結(jié)腸炎，通過(guò)組織學(xué)和生理水平評(píng)價(jià)機(jī)體損傷和抗損傷機(jī)制，可以為臨床常用藥物治療結(jié)腸炎提供系統(tǒng)有效的系統(tǒng)性實(shí)驗(yàn)資料[12，13]。本研究中采用不同劑量的噁唑酮乙醇溶液經(jīng)2次皮膚致敏和一次肛門(mén)灌腸誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎模型，同時(shí)在治療中灌胃給予市售藥物美沙拉嗪，已有研究表明美沙拉嗪可以抑制引起炎癥的前列腺素的合成和炎性介質(zhì)白三烯的形成,從而對(duì)腸黏膜的炎癥起顯著抑制作用[14-16]，同時(shí)我們研究發(fā)現(xiàn)噁唑酮誘導(dǎo)的UC小鼠結(jié)腸組織中經(jīng)典炎癥信號(hào)通路處于顯著激活狀態(tài)，同時(shí)美沙拉嗪對(duì)該通路具有顯著的抑制效果，這有助于治療噁唑酮誘導(dǎo)產(chǎn)生的機(jī)體炎性反應(yīng)，同時(shí)美沙拉嗪對(duì)于噁唑酮引起的機(jī)體免疫失衡具有很好的調(diào)節(jié)作用，能夠顯著下調(diào)血清中Th2型細(xì)胞因子水平，進(jìn)一步說(shuō)明美沙拉嗪可以通過(guò)促進(jìn)免疫平衡治療潰瘍性結(jié)腸炎。