鄭浩鋒 孫啟全

(中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院廣東省器官移植中心，廣州 510630)

腎移植是目前終末期腎臟病患者的最佳治療方式[1]。對于腎移植術(shù)后受者而言，免疫排斥反應(yīng)程度嚴(yán)重影響移植腎存活時間，從而進(jìn)一步影響受者生活質(zhì)量[2]。應(yīng)用免疫抑制劑雖可一定程度上延長移植腎的存活時間，然而移植腎遠(yuǎn)期存活仍不理想，移植腎十年存活率僅為50%[3,4]。晚期移植腎失功仍是目前腎移植術(shù)后所面臨的最重大的臨床問題[5,6]。對于腎移植的研究，目前主要集中于排斥反應(yīng)、免疫抑制劑的并發(fā)癥、缺血再灌注和供體評估等幾方面，而這些研究中，排斥反應(yīng)尤為重要，也是目前研究最為集中的領(lǐng)域(見圖1)。對于排斥反應(yīng)而言，免疫系統(tǒng)在其中發(fā)揮著核心作用[7,8]。腎移植移植免疫研究，主要包括兩方面，即天然免疫和特異性免疫，其中特異性免疫在移植免疫中發(fā)揮著重要作用。特異性免疫，主要包括T細(xì)胞與B細(xì)胞，其分別造成腎移植后T細(xì)胞介導(dǎo)的排斥反應(yīng)(T cell-mediated rejection，TCMR)和抗體介導(dǎo)的排斥反應(yīng)(Antibody-mediated rejection,ABMR)[2]。而天然免疫中包括抗原提呈細(xì)胞、損傷相關(guān)的分子模式(Damage-associated molecular patterns,DAMPS)等也在腎移植移植免疫中發(fā)揮重要作用[9]。

對于腎移植移植免疫研究，目前我國研究水平與世界一流水平仍存在較大差距。近10年全球發(fā)表高質(zhì)量(影響因子大于5)腎移植論文共3 065篇(截至2018年1月)，而我國僅發(fā)表46篇，并且僅有不到半數(shù)是在國內(nèi)獨(dú)立完成。因此，中國腎移植移植免疫仍有較大發(fā)展空間。本文將從腎移植移植免疫角度出發(fā)，詳細(xì)闡述免疫細(xì)胞包括T細(xì)胞、B細(xì)胞和天然免疫細(xì)胞在腎移植移植免疫中的作用，為腎移植移植免疫研究奠定基礎(chǔ)，為今后研究指明方向。

1 T細(xì)胞與腎移植

T細(xì)胞在腎移植移植免疫中的作用，主要體現(xiàn)其介導(dǎo)的細(xì)胞性排斥反應(yīng)(即TCMR)，其發(fā)生機(jī)制主要與人類白細(xì)胞抗原(Human leukocyte antigen,HLA-1)有關(guān)，外來抗原(主要為移植腎抗原)刺激受者體內(nèi)免疫系統(tǒng)，激活T細(xì)胞(主要是效應(yīng)T細(xì)胞)，在其他炎癥因子包括IL-2等刺激下，導(dǎo)致移植腎局部嚴(yán)重免疫排斥反應(yīng)[10]。TCMR可分為間質(zhì)性和血管性兩種，而根據(jù)病程及發(fā)病時間情況，TCMR又可分為急性和慢性排斥反應(yīng)。早期發(fā)生TCMR是移植腎預(yù)后不良的危險因素之一[11]。

圖1 近10年我國高質(zhì)量(影響因子大于5分)移植免疫研究論文熱點(diǎn)分布圖Fig.1 Distribution map of high quality kidney transplant research articles (impact factor >5.0) in China within 10 years

移植腎發(fā)生TCMR后，其常見病理表現(xiàn)主要為顆粒狀補(bǔ)體沉積、多形核細(xì)胞浸潤和微循環(huán)內(nèi)皮細(xì)胞損傷，伴或不伴單核細(xì)胞浸潤，而小管炎及間質(zhì)炎則較為少見[12,13]。

對于腎臟TCMR的診斷，目前主要依賴于傳統(tǒng)Banff病理學(xué)分級，其分級主要根據(jù)間質(zhì)炎癥程度、動脈炎嚴(yán)重程度及腎小管萎縮情況進(jìn)行分級[14]。Banff分級診斷標(biāo)準(zhǔn)大大提高了腎移植術(shù)后診斷及治療判斷水平，然而其也存在局限性。其最大的局限在于Banff分級仍是主觀判別，由于病理學(xué)家水平參差不齊，因此往往難以達(dá)到一致的診斷。同時，Banff分級與腎移植術(shù)后移植腎預(yù)后的相關(guān)程度也是一個問題[15]。Krisl等[16]對182例TCMR受者進(jìn)行長達(dá)527 d(中位數(shù))隨訪后發(fā)現(xiàn)，在移植腎失功上時間上，不同Banff分級包括ⅠA、ⅠB、ⅡA和ⅡB受者，其失功時間并無顯著性差異。同時，Wu等[17]學(xué)者也做了類似研究，對270例TCMR受者，包括TCMRⅠ、Ⅱ和Ⅲ級，結(jié)果表明不同分級移植腎生存時間無顯著差異，而內(nèi)膜動脈炎嚴(yán)重程度則與TCMR預(yù)后高度相關(guān)。由于Banff分級的局限性，近年來亦有不少研究嘗試?yán)闷渌椒▉碓\斷TCMR，包括改進(jìn)版的Banff TCMR量表，基因及轉(zhuǎn)錄組等分子水平等對TCMR診斷進(jìn)行研究，亦取得較大成就[15,18,19]。

對于TCMR的治療，由于其主要與腎移植術(shù)后急性排斥相關(guān)，因此其治療要點(diǎn)在于早期足量使用糖皮質(zhì)激素。TCMR典型情況表現(xiàn)為腎實(shí)質(zhì)出現(xiàn)明顯急性排斥反應(yīng)、動脈及小動脈栓塞、腎實(shí)質(zhì)梗死。對于此類情況，移植腎往往在1年內(nèi)會出現(xiàn)腎失功。當(dāng)發(fā)生嚴(yán)重TCMR，糖皮質(zhì)沖擊療法仍是一線療法，對于輕中度TCMR，如對激素沖擊治療有效，則可口服維持，而對于重度或難治性TCMR，則需持續(xù)靜脈滴注，同時沖擊后予以抗生素以預(yù)防感染，并根據(jù)血藥濃度優(yōu)化免疫抑制劑治療方案[20]。

2 B細(xì)胞與腎移植

B細(xì)胞在腎移植移植免疫中發(fā)揮著重要作用。B細(xì)胞介導(dǎo)的排斥反應(yīng)，又稱為抗體介導(dǎo)的排斥反應(yīng)或體液性排斥反應(yīng)。ABMR是腎移植術(shù)后免疫排斥反應(yīng)中存在的最大臨床問題[21]。發(fā)生ABMR后，若不及時治療，將會有20%～30%移植腎在一年內(nèi)失功[22]。其發(fā)生機(jī)制主要是由于機(jī)體抗原提呈細(xì)胞提呈移植腎抗原后，刺激B細(xì)胞產(chǎn)生抗移植腎主要組織相容性復(fù)合體MHC復(fù)合物抗體(Donor-specific antibody,DSA)，DSA與抗原結(jié)合反應(yīng)后進(jìn)一步激活補(bǔ)體反應(yīng)，從而造成移植腎損傷[23]。MHC復(fù)合分子，在人類其主要指HLAs。至今為止，已發(fā)現(xiàn)的HLAs超過1 600種，其大體分為兩類，即HLA Ⅰ類和HLAⅡ類分子。HLA Ⅰ類分子(包括HLA-A、HLA-B和HLA-C等)分布在所有有核細(xì)胞，而HLAⅡ類分子(包括HLA-DP、HLA-DQ和HLA-DR等)則只在抗原提呈細(xì)胞上表達(dá)。除HLAs抗原外，其他抗原包括ABO血型抗原、微小組織復(fù)相容性復(fù)合體抗原、內(nèi)皮細(xì)胞抗原等也可刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體，從而導(dǎo)致ABMR的發(fā)生[23-25]。在ABMR的發(fā)生發(fā)展中，抗原抗體結(jié)合反應(yīng)并不能直接造成移植腎的損傷，其最大的損傷機(jī)制在于抗原抗體結(jié)合后引起的補(bǔ)體反應(yīng)。補(bǔ)體分子，尤其是C1q可結(jié)合移植腎內(nèi)皮細(xì)胞上的抗原抗體復(fù)合物，形成膜攻擊復(fù)合物，從而引起補(bǔ)體系統(tǒng)的激活，造成細(xì)胞損傷，甚至死亡。而在此過程中，補(bǔ)體反應(yīng)的激活也會產(chǎn)生部分趨化因子，從而導(dǎo)致移植腎免疫細(xì)胞的浸潤，包括中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等，從而造成移植腎進(jìn)一步損傷[26-29]。在補(bǔ)體反應(yīng)后，常常會殘留補(bǔ)體片段C4d，因此其也成為ABMR發(fā)生的重要標(biāo)志之一[30]。

移植腎發(fā)生ABMR后，其病理改變與TCMR截然不同。在ABMR中，其受損部位主要為腎小管與內(nèi)皮細(xì)胞。在管周毛細(xì)血管可見明顯中性粒細(xì)胞與巨噬細(xì)胞浸潤，同時腎小球與毛細(xì)血管可見明顯炎癥[31]。而在我們前期研究中發(fā)現(xiàn)，ABMR中毛細(xì)血管炎的發(fā)生發(fā)展主要與T-bet有關(guān)。在Th1的調(diào)控下，T-bet的產(chǎn)生與炎癥細(xì)胞浸潤及毛細(xì)血管炎呈正相關(guān)[32]。

根據(jù)發(fā)病時間和嚴(yán)重程度，ABMR可分為超急性、急性和慢性排斥反應(yīng)，而不同排斥反應(yīng)其病理表現(xiàn)不一。對于超急性ABMR，其主要表現(xiàn)為內(nèi)皮細(xì)胞表面大量免疫球蛋白沉積與內(nèi)皮細(xì)胞溶解，從而導(dǎo)致血栓形成與組織梗死?；顧z可發(fā)現(xiàn)炎癥細(xì)胞浸潤、紅細(xì)胞停滯、纖維素沉積以及廣泛腎小管損傷壞死等。對于急性ABMR，其主要表現(xiàn)為中性粒細(xì)胞遷徙到腎小管周圍毛細(xì)血管內(nèi)，從而造成腎小管壞死及動脈纖維素樣壞死。慢性ABMR則主要表現(xiàn)為微血管的慢性病變，包括動脈內(nèi)膜纖維化、腎小管周圍毛細(xì)血管基膜分層等[33,34]。

對于ABMR的診斷，目前也主要依賴于傳統(tǒng)Banff病理分級診斷[35]。1990年，ABMR由于其獨(dú)特的病理學(xué)表現(xiàn)而從TCMR中區(qū)分而來[36]。由于C4d為補(bǔ)體反應(yīng)激活的標(biāo)志，其長期作為ABMR標(biāo)志物，直至2009年加拿大大型腎移植術(shù)后排斥反應(yīng)研究才發(fā)現(xiàn)，大部分ABMR受者腎臟病理染色C4d陰性，自此，ABMR的診斷才得以進(jìn)一步完善[5]。在Banff診斷標(biāo)準(zhǔn)中，ABMR根據(jù)其病程長短，可分為急性和慢性ABMR，其診斷依據(jù)主要包括三方面，即DSA檢測、C4d檢測以及管周毛細(xì)血管炎和腎小球炎[35]。對于DSA檢測，目前主要依賴細(xì)胞毒試驗(yàn)或ELISA，然而其僅能檢測出抗HLA類抗原，對于非HLA抗原等缺乏標(biāo)準(zhǔn)化篩查手段。我們前期利用商品化人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，建立抗內(nèi)皮細(xì)胞抗體篩查方法，解決了抗內(nèi)皮細(xì)胞抗體的檢測問題，并進(jìn)一步揭示抗內(nèi)皮細(xì)胞抗體所致的體液性排斥的臨床特征，研究成果也被國際指南采納，成為全球唯一的篩查手段[37-39]。由于臨床上存在部分受者DSA陽性而不發(fā)生排斥反應(yīng)，因此單獨(dú)DSA檢測并不能成為ABMR確診的唯一依據(jù)。而對于C4d的檢測，目前主要依賴免疫熒光或免疫組化。C4d陽性是ABMR預(yù)后不良的獨(dú)立危險因素之一。對于C4d陰性的受者，其如果腎小管周圍毛細(xì)血管存在較多炎癥細(xì)胞浸潤，則可結(jié)合其他提示ABMR的分析生物學(xué)指標(biāo)，包括C1q和C3d等進(jìn)行協(xié)助診斷[40]。此外，對于ABMR的診斷，近年來在基因分子水平及體外無創(chuàng)診斷亦取得十分顯著成就[41-43]?；谇捌谘芯堪l(fā)現(xiàn)T-bet在ABMR中的重要作用，我們進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，利用T-bet與GATA3這兩種在ABMR中起重要作用的分子，其比值可作為ABMR診斷的重要指標(biāo)，相比于傳統(tǒng)C4d診斷ABMR，其可顯著提高體液性排斥診斷的臨床敏感性，而聯(lián)合C4d與T-bet/GATA3診斷ABMR，可在不減少C4d診斷特異性的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步提高ABMR診斷的靈敏度，為臨床ABMR早發(fā)現(xiàn)提供可靠檢測手段[44]。

ABMR的治療一直是腎移植術(shù)后所面臨的最重大難題。近年來，大量研究集中于新型免疫抑制劑，包括CD20單抗、IL-6受體拮抗劑、蛋白酶體抑制劑等的開發(fā)使用。然而ABMR為持續(xù)進(jìn)展性疾病，不同時期ABMR由于其癥狀表現(xiàn)不一，其治療策略應(yīng)有所差異[25]。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，ABMR可分為早期及晚期，其分期標(biāo)準(zhǔn)主要根據(jù)時間，即6個月內(nèi)為早期ABMR，而6個月后為晚期ABMR。對于早期ABMR，聯(lián)合霉酚酸酯與他克莫司可有效對ABMR進(jìn)行治療。該方案在減少免疫抑制劑感染等副作用前提下，安全有效治療ABMR，且進(jìn)一步降低受者醫(yī)療支出[44,45]。而在后期研究中，我們發(fā)現(xiàn)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞及傳統(tǒng)中藥雷公藤亦可有效減輕ABMR受者排斥情況[46,47]。

3 天然免疫與腎移植

天然免疫是腎移植術(shù)后排斥的必經(jīng)階段，也是適應(yīng)性免疫的必要條件。長期以來，腎移植移植免疫聚焦于T細(xì)胞和B細(xì)胞所介導(dǎo)的適應(yīng)性免疫，而天然免疫細(xì)胞所介導(dǎo)的天然免疫鮮有涉足。對于天然免疫在移植免疫中的作用，目前主要集中于腎臟缺血-再灌注損傷研究，而在腎臟移植免疫耐受方面，其也有少量研究。

在腎移植免疫中，天然免疫細(xì)胞通過模式識別受體識別病原體相關(guān)模式分子，例如脂多糖和肽聚糖等，產(chǎn)生促炎因子造成炎癥損傷，同時激活適應(yīng)性免疫。模式識別受體種類多樣，大體可分為兩類，即細(xì)胞受體和可溶性受體。細(xì)胞受體包括Toll樣受體(Toll like receptor,TLR)、NOD樣受體和RIG-I樣受體，而可溶性受體則主要為補(bǔ)體[48,49]。

DAMPs是天然免疫識別的重要損傷物質(zhì)，其主要由損傷或衰老細(xì)胞產(chǎn)生，經(jīng)樹突狀細(xì)胞等抗原提呈細(xì)胞識別后，可通過抗原提呈細(xì)胞上的細(xì)胞受體，尤其是TLR受體，進(jìn)一步產(chǎn)生炎癥因子，誘導(dǎo)炎癥的發(fā)生，從而在腎移植天然免疫中起重要作用[50-52]。線粒體DNA是DAMP重要組成成分，近年來，其在移植物炎癥中的作用也越來越被人們所重視。研究表明，線粒體可通過釋放線粒體DNA，作用于TLRs和Ⅰ型干擾素而激活炎癥反應(yīng)。而在心臟移植研究中發(fā)現(xiàn)，線粒體可以打破共刺激阻滯所引起的免疫耐受[53]。天然免疫是機(jī)體免疫中的重要組成部分，而其在腎移植免疫中的作用，仍需進(jìn)一步挖掘研究。

4 異種移植與腎移植

供體數(shù)量短缺是腎移植及器官移植所面臨的最大難題之一。針對供體數(shù)量的短缺，大量科學(xué)家集中于異種移植研究。長期以來，異種移植面臨的最大問題包括以下四方面，即免疫排斥反應(yīng)、凝血調(diào)節(jié)功能障礙、中間交叉感染及倫理問題。靈長類動物由于與人類血緣相近，無疑為異種移植的潛在對象，然而由于其常常攜帶有人類易感病毒，且來源少、繁育周期長，在實(shí)際應(yīng)用中反而較為困難。相比之下，基因修飾豬似乎是異種移植的最佳來源，其腎臟具有與人類相似的大小與解剖，而腎功能亦相近[54]。近年來，大量研究集中于豬的基因改造，而CRISPR/Cas9技術(shù)的出現(xiàn)，為腎移植異種移植翻開了新的篇章[55]。經(jīng)CRISPR/Cas9技術(shù)，基因修飾豬可一次性敲除超過40個基因，其不僅解決了異種移植中存在的交叉感染及凝血調(diào)節(jié)功能障礙問題，而且在CD55等補(bǔ)體調(diào)節(jié)蛋白輔助下，天然抗體介導(dǎo)的免疫排斥反應(yīng)亦可顯著降低[56]。基因修飾豬的出現(xiàn)將異種移植帶上了新的高峰，然而其距離臨床應(yīng)用仍有漫長的路程。遲發(fā)的排斥反應(yīng)、移植物術(shù)后長期功能及倫理認(rèn)可，仍是異種移植所面臨的重大難題。

5 免疫耐受與腎移植

免疫耐受，主要分為兩大類，即自發(fā)耐受和誘導(dǎo)耐受，其最早于1953年由Billingham等[57]發(fā)現(xiàn)，在小鼠胎兒期接種外來組織，則可誘導(dǎo)小鼠皮膚移植免疫耐受。對于免疫耐受的機(jī)制，目前主要認(rèn)為其由B細(xì)胞和T細(xì)胞介導(dǎo)的中樞耐受及天然免疫細(xì)胞介導(dǎo)的外周耐受兩部分組成。長期以來，免疫耐受的研究主要集中于動物體內(nèi)研究，然而由于種屬差異，大部分動物實(shí)驗(yàn)結(jié)果無法在人類身上進(jìn)行重復(fù)[58]。在腎移植中，至今已有報道超過100例免疫耐受患者，而最新研究發(fā)現(xiàn)，除已存在的天然免疫耐受患者，亦可人工誘導(dǎo)腎移植免疫耐受[58,59]。國內(nèi)外多所醫(yī)院包括美國麻省總院、美國西北大學(xué)、斯坦福大學(xué)和復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院腎移植?？品謩e進(jìn)行了造血干細(xì)胞輸注聯(lián)合腎移植誘導(dǎo)免疫耐受的臨床研究。其于術(shù)前對腎移植受者進(jìn)行全淋巴放射預(yù)處理，同時輸注供者的造血干細(xì)胞。結(jié)果表明，部分患者術(shù)后可完全停用免疫抑制劑，成功誘導(dǎo)免疫耐受。而在后期研究中發(fā)現(xiàn)，輸注造血干細(xì)胞后受者體內(nèi)長期存在“供-受者嵌合體”，其可保持受者免疫系統(tǒng)對移植腎呈低免疫反應(yīng)或無反應(yīng)，大大降低或減少術(shù)后免疫抑制劑使用量，極有可能成為腎移植免疫耐受的新治療方案[60-62]。

6 總結(jié)

腎移植移植免疫為復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)免疫調(diào)控系統(tǒng)，各種免疫在發(fā)揮其單獨(dú)作用時，彼此之間也相互作用。天然免疫作為機(jī)體免疫的第一道防線，在發(fā)揮其免疫效應(yīng)的同時，也可激活適應(yīng)性免疫；而適應(yīng)性免疫發(fā)揮作用時，也可通過釋放趨化因子等進(jìn)一步加強(qiáng)天然免疫效應(yīng)，從而起到正反饋?zhàn)饔?。移植免疫研究是解決腎移植術(shù)后排斥、延長受者生存時間、提高受者生存質(zhì)量的重要手段，而免疫耐受研究則是解決腎移植術(shù)后排斥的明日之星。然而目前腎移植免疫研究仍有較大發(fā)展空間，高新技術(shù)的開發(fā)與應(yīng)用，如單細(xì)胞測序、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、代謝組學(xué)等，將使腎移植移植免疫走向一個新的時代。