王宏信， 冷 凝， 劇春暉， 陳 博， 陳文術(shù)， 李向林， 冉 旭

(1.三亞學(xué)院，海南三亞 57200； 2.西南大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院，重慶 400715；3.北華大學(xué)東北紅豆杉繁育技術(shù)研究所，吉林吉林 132013)

降香黃檀(DalbergiaodoriferaT. Chen)為蝶形花科降香黃檀屬落葉喬木，是海南特有的珍稀瀕危樹種，具有較高的經(jīng)濟(jì)價值和生態(tài)價值[1-2]。植物的根系構(gòu)型，例如根系分枝數(shù)量、根生長角度、根長、根表面積、根體積、根尖數(shù)以及不同徑級間的長度、面積、體積、根尖數(shù)等對水分及營養(yǎng)物質(zhì)的吸收起著關(guān)鍵的作用[3]。土壤根際微生物是土壤中各種生物學(xué)和生物化學(xué)過程的重要構(gòu)成因子，它對植物的根系構(gòu)型有重要的影響，同時植物根系構(gòu)型的改變也會影響微生物群落的構(gòu)成與分布[4]。目前，研究較多的是叢枝菌根真菌(arbuscular mycorrhizal fungi，AMF)、根瘤菌(Rhizobiumleguminosarum)等根際微生物如何有效地調(diào)控植物根系構(gòu)型[5-6]。AMF能與陸地上90%的開花植物形成共菌根生體，能夠改變宿主植物的根系構(gòu)型、增加植物對土壤礦質(zhì)元素和水分的吸收利用，提高植物抗旱性和抗逆性[7-9]。根瘤菌與根系形成的共生體，通過固氮作用為植物生長提供所需的氮源[10]。研究表明，根瘤菌可以促進(jìn)蒺藜狀苜蓿的根毛卷曲及增加分枝程度，進(jìn)而側(cè)根數(shù)量增多[11]，且能夠有效提高棉花根干質(zhì)量、根生物量和根表面積等根系生物指標(biāo)[12]。在豆科植物的根際生態(tài)系統(tǒng)中，存在AMF-豆科植物-根瘤菌的共生體系[13]，研究表明，干旱條件下，同時接種摩西球囊霉(Glomusmosseae)和大豆慢生根瘤菌(BradyrhizobiumjaponicumJordan)，能夠提高大豆的結(jié)瘤量，避免大豆根瘤過早衰老[14]。更多的研究表明，AMF與根瘤菌的雙接種可以強(qiáng)烈地刺激豆科植物的生長和根瘤的形成，使AMF侵染率增加，從而達(dá)到對養(yǎng)分吸收的協(xié)同促進(jìn)作用，其優(yōu)越性遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于它們的單獨(dú)接種[15-16]。

有研究表明，接種珠狀球囊霉(Glomusmargarita)和幼套球囊霉(Glomusetunicatum)可促進(jìn)滅菌土中生長的降香黃檀幼苗生長[17]，另研究表明混合接種摩西球囊霉和疣狀無梗囊霉(Acaulosporatuberculata)能促進(jìn)滅菌土中降香黃檀幼苗的生長發(fā)育并提高其抗逆性[18]。慢生根瘤菌屬(Bradyrhizobium)、根瘤菌屬(Rhizobium)、中華根瘤菌屬(Sinorhizobium)等多種根瘤菌能夠與降香黃檀形成穩(wěn)定的共生關(guān)系，從而形成根瘤固氮，提高其抗逆性[19]。然而目前，接種AMF和根瘤菌如何影響幼齡降香黃檀幼苗的生物量和根系形態(tài)特征及其能否促進(jìn)根系生長和養(yǎng)分吸收等相關(guān)研究較少。

本研究通過為幼齡降香黃檀實(shí)施AMF、根瘤菌和混合接種的方式來探討AMF和根瘤菌對根系生長和養(yǎng)分吸收的影響，為降香黃檀大面積推廣栽培提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)土壤采自三亞學(xué)院園林試驗(yàn)基地林下表層土。土壤類型為磚紅壤，土壤pH值4.56，全氮含量為0.73 g/kg，有機(jī)質(zhì)含量為11.118 g/kg，全磷含量為0.182 g/kg，全鉀含量為4.135 g/kg，田間持水量為21.8%。土壤過2 mm篩，在 0.14 MPa、121 ℃下連續(xù)滅菌2 h備用。試驗(yàn)種子采自海南省三亞市熱帶珍稀苗木種植場，降香黃檀樹齡20年，其種子用5%次氯酸鈉溶液消毒20 min，然后用無菌水沖洗備用。經(jīng)過前期試驗(yàn)篩選，供試菌根真菌種為幼套球囊霉(G.etunicatum，GE)，由中國農(nóng)林科學(xué)院植物營養(yǎng)與資源研究所提供，菌根真菌采用高粱苗為宿主進(jìn)行盆栽擴(kuò)繁，以含有宿主植物侵染根段、菌絲片段、菌根真菌孢子的根際土為接種劑。供試根瘤菌為慢生根瘤菌(B.japonicum，BJ)，購自中國農(nóng)業(yè)大學(xué)根瘤中心。

盆栽容器為45 cm×32 cm×25 cm(盆高×盆口直徑×盆底直徑)紅色塑料盆，使用前用95%乙醇消毒，自來水沖洗干凈后備用。每盆裝土4.8 kg。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計

試驗(yàn)在三亞學(xué)院園林試驗(yàn)大棚中進(jìn)行，該地塊位于海南省三亞市吉陽區(qū)，地處109°53′92″E、18°32′72″N，海拔200 m。大棚四周與外界溫度、濕度、光照相對一致，年平均降水量為1 755 mm，年平均相對濕度為78%，年平均氣溫為25 ℃。試驗(yàn)時間為2016年7月17日至2017年7月17日，試驗(yàn)設(shè)4個處理：不接種(對照CK)、單接種幼套球囊霉(GE)、單接慢生根瘤菌(BJ)、雙接種幼套球囊霉與慢生根瘤菌(GE+BJ)，每個處理6個重復(fù)，共計24盆。培養(yǎng)土裝盆時，在基質(zhì)的2/3處平鋪菌劑100 g，接種AMF的處理加入含有孢子、菌絲的土壤及其寄主植物的根段混合物作為接種物，同時播入消毒并催芽的降香黃檀種子，未接種的處理加入等量滅活菌劑和滅菌的沙子作為對照。接種根瘤菌的方法是將供試菌株先接種到Y(jié)MA斜面活化，25 ℃恒溫培養(yǎng)3 d，然后轉(zhuǎn)接于YMA培養(yǎng)液(1 000 mL)的三角瓶中，振蕩30 h，培養(yǎng)至對數(shù)生長期(D600 nm=0.812)，離心濃縮并用無菌水重懸，配制成菌懸液(菌數(shù)約104CUF/mL)，每盆接種100 mL根瘤菌劑，不接種的對照注射100 mL無菌水。2016年7月7日播種，1個月后定苗至6株并施肥(硝酸銨200 mg/kg、磷酸二氫鉀50 mg/kg、硝酸鉀300 mg/kg)。

1.3 指標(biāo)測定

1.3.1 生長發(fā)育測定 播種2個月后，用卷尺和游標(biāo)卡尺測量株高和地徑，每個月測定1次。

1.3.2 根系形態(tài)測定 2017年7月17日收獲，將植株連同塑料盆同時浸入水中，沖洗掉根部土壤，獲取完整根系，用根系掃描儀Epson Perfection 4990 PHOTO進(jìn)行掃描測定總根長、根系總表面積、根體積、根尖數(shù)、根分枝數(shù)，分析軟件為Regentinstruments公司提供的WinRHIZO。

1.3.3 地下根瘤數(shù)量及根瘤質(zhì)量測定 根系掃描完畢后，計算每株根瘤數(shù)并用游標(biāo)卡尺隨機(jī)測定30個根瘤的直徑，取平均值。

1.3.4 生物量測定 測定后的植株從基徑處分開，地上部稱鮮質(zhì)量，105 ℃殺青30 min后置于70 ℃烘干，稱干質(zhì)量，計算干鮮比，換算出地上生物量；地下部分分成2份：一份用來測定AMF侵染率，另一份105 ℃殺青30 min后置于70 ℃烘干，稱干質(zhì)量，計算干鮮比，換算出地下生物量。

根冠比=地上干質(zhì)量/地下干質(zhì)量。

1.3.5 主根長度、側(cè)根長度測定 長度測定精確到0.01 cm。

1.3.6 AMF侵染率測定 參照Phillips等方法進(jìn)行染色觀察菌根侵染情況，稱取約0.1 g的根，剪成約1 cm的小段，放入裝有10% KOH的試管中，80 ℃水浴20 min，用1% HCl洗滌，再用蒸餾水沖洗干凈；用0.065%苯胺藍(lán)染液在80 ℃水浴中染色10 min，洗凈后用甘油保存并在解剖鏡下鏡檢[20]。

1.3.7 植物養(yǎng)分含量測定 植物組織中氮(N)、磷(P)經(jīng)濃硫酸-雙氧水消解后分別用凱氏定氮法、釩鉬黃比色法、火焰光度計法測定含量[21]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 18.0軟件單因素完全隨機(jī)法進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計，檢驗(yàn)處理間的差異顯著性。采用Excel 2007軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同接種方式對降香黃檀幼苗植株株高、地徑的影響

如圖1、圖2所示，接種AMF和根瘤菌均對降香黃檀幼苗株高和地徑產(chǎn)生顯著影響。2016年9月17日至2017年6月17日，連續(xù)測量10個月后，GE、BJ、GE+BJ處理株高分別比CK增加19.84%、6.81%、19.69%，其中GE處理與 GE+BJ處理差異不顯著，其余各處理間差異顯著(P<0.05)。GE、BJ、GE+BJ處理地徑分別比CK增加25.62%、5.66%、24.85%，其中GE處理與GE+BJ處理差異不顯著，其余各處理間差異顯著(P<0.05)。說明接種AMF和根瘤菌顯著促進(jìn)了降香黃檀幼苗株高和地徑的生長，單獨(dú)接種AMF的效果優(yōu)于單獨(dú)接種根瘤菌效果，而雙接種產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)。10個月后，CK、GE、BJ、GE+BJ處理株高與地徑的凈增長量分別為8.45、11.23、9.35、11.03 cm和2.85、3.85、3.07、3.79 mm。

2.2 不同接種方式對降香黃檀幼苗植株的菌根侵染率、根瘤數(shù)量、根瘤質(zhì)量、生物量及根冠比影響

如表1所示，雙接種GE+BJ處理的降香黃檀幼苗菌根侵染率比單獨(dú)接種AMF的GE處理略高，但差異不顯著。雙接種GE+BJ處理的降香黃檀根瘤數(shù)量和根瘤質(zhì)量比單獨(dú)接種根瘤菌的BJ處理增加15.92%和32.35%，且差異顯著(P<0.05)。苗木的生物量及其根冠比是苗木生長狀況的重要指標(biāo)。由表2可知，接種AMF和根瘤菌均可以增加降香黃檀幼苗的生物量及其根冠比，而且各處理與CK處理相比差異均顯著(P<0.05)。GE、BJ、GE+BJ處理的總干質(zhì)量、總鮮質(zhì)量、地上部干質(zhì)量、地上部鮮質(zhì)量、地下部干質(zhì)量、地下部鮮質(zhì)量分別比CK處理增大125.3%、61.9%、130.8%，125.5%、61.9%、131.2%，112.1%、56.7%、117.7%，112.5%、57.0%、117.8%，149.6%、70.8%、156.6%，150.0%、71.4%、156.6%。根冠比是表征植物地上和地下生物量分配的重要指標(biāo)。單獨(dú)接種AMF和根瘤菌以雙接種的處理根冠比均顯著高于CK對照處理(P<0.05)，說明AMF和根瘤菌對降香黃檀幼苗的地上部、地下部生物量產(chǎn)生了顯著的影響，調(diào)節(jié)了植物體內(nèi)碳庫-碳源的流通分配過程。

表1 不同處理對降香黃檀幼苗的菌根侵染率、根瘤數(shù)量、根瘤質(zhì)量的影響

注：表中同列數(shù)據(jù)后不同小寫字母表示不同處理間達(dá)顯著差異(P<0.05)。下同。

表2 不同處理對降香黃檀幼苗的生物量的影響

2.3 不同接種方式對降香黃檀幼苗植株的根系構(gòu)型的影響

植物根系構(gòu)型是植物重要的植物學(xué)性狀和生態(tài)學(xué)指標(biāo)，除受植物的遺傳因素調(diào)控外，還受環(huán)境因子的調(diào)控，而環(huán)境因子往往通過影響側(cè)根的發(fā)生來影響根系構(gòu)型[22]。如表3所示，3個處理GE、BJ、GE+BJ總根長分別比CK處理增加41.54%、13.80%、38.19%，其中GE和GE+BJ處理與CK處理差異顯著(P<0.05)；4個處理間主根長差異并不顯著；GE、BJ、GE+BJ處理的一級側(cè)根長度分別比CK處理增加43.65%、13.62%、50.27%，其中GE、GE+BJ處理均與CK處理差異顯著(P<0.05)；GE、BJ、GE+BJ處理的二級側(cè)根長分別比CK處理增加53.94%、22.23%、7.82%，其中只有GE處理與CK處理差異顯著(P<0.05)；4個處理的三級側(cè)根長差異均不顯著。

表3 不同處理對降香黃檀幼苗的主側(cè)根根長的影響

如表4所示，GE、BJ、GE+BJ處理與CK相比，根表面積分別增加64.42%、42.17%、89.56%；根體積分別增加 35.54%、10.74%、40.77；平均根系直徑分別增加46.61%、25.42%、51.69%；根尖數(shù)分別增加40.37、12.48%、45.94%；根分枝數(shù)分別增加64.33%、28.73%、74.78%。根系表面積和根系體積是根系在土壤中分布范圍的重要指標(biāo)，3個接種處理根系表面積和根系體積與CK處理差異顯著(P<0.05)，說明接種AMF和根瘤菌明顯擴(kuò)展了降香黃檀幼苗根系的分布范圍。平均根系直徑、根尖數(shù)、根分枝數(shù)則反映植物根系的吸收能力，3個接種處理平均根系直徑、根尖數(shù)、根分枝數(shù)與CK處理差異顯著(P<0.05)，說明接種AMF和根瘤菌明顯增加了降香黃檀幼苗根系的吸收能力。

表4 不同處理對降香黃檀幼苗的根系構(gòu)型的影響

2.4 不同接種方式對降香黃檀幼苗植株N、P含量的影響

如表5所示，降香黃檀幼苗地上部、地下部N、P含量均表現(xiàn)為GE+BJ>GE>BJ>CK。與CK相比，3個處理GE、BJ、GE+BJ地上部和地下部的N含量分別增加53.87%、8.53%、56.27%和79.17%、24.17%、95.00%，且GE和GE+BJ處理與其他2個處理之間差異顯著(P<0.05)；與CK相比，3個處理GE、BJ、GE+BJ地上部和地下部的P含量分別增加92.68%、12.20%、95.12%和66.67%、6.67%、100.00%，其中GE和GE+BJ處理的地上部P含量與其他2個處理之間差異顯著(P<0.05)，GE、GE+BJ處理的地下部P含量與其他2個處理之間差異顯著(P<0.05)。

表5 不同處理對降香黃檀幼苗的N、P含量的影響

3 結(jié)論與討論

前人研究結(jié)果表明，AMF和根瘤菌對宿主植物根的識別、侵入、誘導(dǎo)，使植物根系發(fā)生形態(tài)和生理上的變化，并與植物建立共生關(guān)系，這一過程與根系分泌的信號分子的誘導(dǎo)有關(guān)[23]。接種AMF能夠提高對宿主植物葉片的蒸騰速率和氣孔導(dǎo)度，進(jìn)而影響宿主植物的生物量和一些生理指標(biāo)[24-25]。本試驗(yàn)以降香黃檀幼苗為材料，研究雙接種AMF和根瘤菌對降香黃檀幼苗生長的影響。結(jié)果表明，接種AMF和根瘤菌均可以增加降香黃檀幼苗的地上、地下生物量、株高、地徑及其根冠比，其中雙接種GE+BJ處理增加幅度最大。李雅慧等研究也發(fā)現(xiàn)，雙接種AMF和根瘤菌顯著促進(jìn)菜豆的生長[26]。吳福勇等研究發(fā)現(xiàn)，雙接根瘤菌與摩西球囊霉處理對沙打旺生長效應(yīng)顯著高于單接菌處理[15]。這表明AMF和根瘤菌聯(lián)合作用，能促進(jìn)植物生長發(fā)育。

前人研究結(jié)果表明，AMF分泌物對宿主植物的根瘤形成具有促進(jìn)作用，對根瘤呈現(xiàn)正趨化作用[27]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，幼套球囊霉能夠和降香黃檀幼苗根系形成良好的共生關(guān)系，侵染率達(dá)到80.93%，而在根瘤菌的作用下，AMF侵染率略有提高，達(dá)到85.13%。同樣，在AMF作用下，降香黃檀幼苗根系產(chǎn)生的根瘤數(shù)量和根瘤質(zhì)量比單接種根瘤菌處理都有提高，并達(dá)到顯著水平，這與前人的研究結(jié)果[28-29]是相似的。這也表明AMF和根瘤菌在侵染降香黃檀幼苗過程中是相互促進(jìn)的。

植物的根系構(gòu)型直接決定植物的固土能力和養(yǎng)分吸收空間的大小，同時反映了植物根系的生長狀況及其對養(yǎng)分和水分吸收的能力。側(cè)根的生長狀況是植物根系發(fā)育的重要指標(biāo)。本試驗(yàn)結(jié)果表明，雙接種AMF和根瘤菌顯著促進(jìn)降香黃檀幼苗總根長、主根長和一級側(cè)根長，同時提高了根系的根表面積、根體積、平均根系直徑、根尖數(shù)量和根分枝數(shù)。這表明雙接種AMF和根瘤菌大幅提高降香黃檀幼苗的根系的分布范圍，增加了植株對營養(yǎng)物質(zhì)和水分的吸收面積，這與前人的研究結(jié)果[30]是一致的。

根瘤菌通過生物固氮為寄主植物提供有效的氮源，促進(jìn)寄主植物生物量增加，寄主植物為AMF生長提供充足的氮素，提高AMF侵染率，而AMF為宿主植物提供有效的磷營養(yǎng)，促進(jìn)其生物量的提高。本試驗(yàn)結(jié)果表明，雙接種AMF和根瘤菌促進(jìn)降香黃檀幼苗地上部、地下部N、P含量作用最為明顯。前人研究顯示，雙接種AMF與根瘤菌處理根瘤干質(zhì)量、N吸收量及固氮速率均顯著高于單接AMF或單接根瘤菌處理[31]。

綜上所述，AMF及根瘤菌在侵染降香黃檀幼苗的過程中，能夠相互促進(jìn)彼此對降香黃檀幼苗的侵染。AMF侵染率的提高，增加了降香黃檀對土壤中P的吸收，而根瘤菌的侵染能力增強(qiáng)，也加大了其對降香黃檀N營養(yǎng)的供應(yīng)能力。N、P營養(yǎng)供應(yīng)充足，使得植株生長發(fā)育得更好。因此，與單接種AMF或者根瘤菌相比，雙接種技術(shù)具有更明顯的優(yōu)勢。