張 盼，沈振華，張燕華，劉興暉，李向陽

（1. 上海市浦東新區(qū)公利醫(yī)院檢驗科，上海 200135；2. 溫州醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院 育英兒童醫(yī)院檢驗科，浙江 溫州 325000）

碳青霉烯類抗菌藥物具有較廣的抗菌譜和較強的抗菌活性，已經成為治療細菌感染，尤其是產超廣譜β-內酰胺酶（extended-spectrum betalactamase，ESBL）和頭孢菌素酶（AmpC β-內酰胺酶）細菌的首選藥物[1]。但隨著人們對抗菌藥物的過度使用，各種耐藥的“超級細菌”不斷出現(xiàn)并成為一個日益嚴重的世界性公共衛(wèi)生問題。2009年，Yong等在1例印度裔瑞典尿路感染患者體內檢出產新德里金屬β-內酰胺酶1（New Delhi metallo-β-lactamase 1，NDM-1）的肺炎克雷伯菌[2]，隨后該菌向歐洲各國家蔓延。目前，中國、英國、美國、法國、日本、德國、澳大利亞等多個國家均有產NDM-1細菌感染的報道。NDM-1是一種新型B類β-內酰胺酶，能夠水解碳青霉烯類抗菌藥物，目前由于缺乏更為高效的抗菌藥物，給臨床治療帶來極大困難，造成嚴重的危害。NDM-1在我國是從革蘭陽性菌中被首次檢測出來的[3]，且最初多檢出于鮑曼不動桿菌，而目前也有不少從腸桿菌科細菌中檢出NDM-1的報道，但各個地區(qū)耐藥菌株的流行情況不明確。為此，本研究擬對8株產NDM-1菌株進行耐藥性、分子生物學特點分析。

1 材料和方法

1.1 菌株來源

收集2013年1—12月溫州醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院臨床分離的非重復碳青霉烯類耐藥的腸桿菌科細菌67株。藥物敏感性試驗質控菌株為銅綠假單胞菌（ATCC 27853），改良Hodge試驗陰性對照菌為肺炎克雷伯菌（ATCC 700603）。接合轉移受體菌為大腸埃希菌J53，脈沖場凝膠電泳（pulsed-field gel electrophoresis，PFGE）分型標準相對分子質量菌株為沙門菌H9812。

1.2 儀器與試劑

Vitek 2 Compact全自動微生物分析系統(tǒng)及配套GN鑒定卡和GN13藥物敏感性試驗卡（法國生物梅里埃公司），S100 Thermal Cycler PCR儀（美國伯樂公司），Power Pac Basic 穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀（美國伯樂公司），Gel Doc XR型凝膠成像分析儀（美國伯樂公司），CHEF-Mapper XA PFGE系統(tǒng)（美國伯樂公司）等；聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增引物由上海桑尼生物有限公司合成。PCR反應試劑、100 bp DNA Marker（日本Takara公司），瓊脂糖凝膠干粉（法國Biowest公司）；XbaⅠ限制性內切酶（日本Takara公司），蛋白酶K（德國Roche生物公司），PFGE 低熔點瓊脂糖凝膠干粉（美國伯樂公司），SeaKem Gold Agarose（美國Lonza公司）等。

1.2 方法

1.2.1 菌株鑒定和體外藥物敏感性試驗 采用Vitek 2 Compact全自動微生物分析系統(tǒng)進行菌株鑒定和體外藥物敏感性試驗，藥物敏感性試驗結果按照美國臨床實驗室標準化協(xié)會（the Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）2013年的標準[4]進行判斷。

1.2.2 改良Hodge試驗 參照CLSI的方法操作，被測菌株與大腸埃希菌（ATCC 25922）抑菌圈交匯處大腸埃希菌生長增強即為陽性。

1.2.3 耐藥基因的檢測 采用BioFlux細菌全基因組DNA提取試劑盒提取細菌基因組總DNA，PCR擴增碳青霉烯酶基因blaNDM-1[5]、ESBL基因和ampC基因。擴增產物經含溴化乙錠（ethidium bromide，EB）的1.5 %瓊脂糖凝膠110 V電泳30 min，在凝膠成像分析系統(tǒng)上觀察并記錄結果。陽性擴增產物送上海桑尼生物有限公司測序，在美國國立生物技術信息中心網(wǎng)站上進行Blast比對分析。

1.2.4 接合轉移試驗 疊氮鈉耐藥的受體菌大腸埃希菌J53與試驗菌株經LB肉湯培養(yǎng)接合后，用含抗菌藥物（1 μg/mL亞胺培南和200 μg/mL疊氮鈉）的復合水解酪蛋白胨平板篩選接合子。對疑似接合子進行生化、藥物敏感性試驗和NDM-1基因擴增試驗以證實接合子。

1.2.5 PFGE菌株同源性分析 2 %的低熔點膠包埋細菌基因組DNA，經溶菌酶、蛋白酶K裂解消化，37 ℃ XbaⅠ酶切14 h。于PFGE電泳槽內電泳18～22 h。經EB染色后在成像儀中觀察結果。

2 結果

2.1 菌株分布

在67株腸桿菌科細菌中共檢出8株攜帶NDM-1基因的菌株，其中肺炎克雷伯菌2株、陰溝腸桿菌3株、弗氏檸檬酸桿菌1株、大腸埃希菌2株。

2.2 患者病例資料

8株菌株分別分離自8例患者，其中5株來自兒童，3株來自成人，科室來源較為廣泛，無明顯聚集性。對這8例患者進行回顧性分析發(fā)現(xiàn)，有6例同時伴有其他菌株的混合感染，6例患者在菌株檢出前均單獨或聯(lián)合使用過多種抗菌藥物進行預防或抗感染治療。8例患者的具體診斷、治療情況見表1。

2.3 體外藥物敏感性試驗

8株菌株對頭孢菌素類、單環(huán)內酰胺類、β-內酰胺酶抑制劑復合物和呋喃妥因等抗菌藥物均表現(xiàn)出較高的耐藥性，但對氨基糖苷類（阿米卡星、慶大霉素）和氟喹諾酮類（左氧氟沙星）藥物的敏感性較好。見表2。

2.4 改良Hodge試驗及耐藥基因的檢測

8株菌株中有7株改良Hodge試驗陽性，另外1株肺炎克雷伯菌為陰性。8株菌株中有5株攜帶SHV基因、2株攜帶CTX-M-1基因、1株攜帶DHA-1基因。各菌株多同時攜帶2種及以上的耐藥基因。測序結果顯示，所有NDM-1陽性擴增序列與NDM-1（GenBank：FN396876.1）同源性為100%。耐藥基因檢出結果見表3，PCR擴增產物電泳結果見圖1。

表1 8例患者的診斷和治療情況

表2 8株菌株抗菌藥物敏感性試驗結果

2.5 接合轉移試驗

6株產NDM-1菌株（2株大腸埃希菌除外）與大腸埃希菌J53接合成功。陽性接合子對β-內酰胺類藥物的耐藥性較高，但對氨基糖苷類、氟喹諾酮類、復方磺胺甲噁唑和呋喃妥因幾乎全部敏感。

2.6 PFGE同源性分析

2株大腸埃希菌無同源性，3株陰溝腸桿菌中3號與4號菌株PFGE譜帶相同，可視為同一克隆株。見圖2。

表3 菌株表型和耐藥基因攜帶情況

圖1 8株產NDM-1 菌株PCR陽性擴增產物電泳圖

圖2 2株大腸埃希菌和3株陰溝腸桿菌PFGE電泳圖

3 討論

blaNDM-1于2009年被首次報道，先后從分離自同一例患者尿液樣本的肺炎克雷伯菌和糞便樣本分離的大腸埃希菌中檢測出[2]。有研究結果顯示，blaNDM-1位于大小不同的可轉移質粒上，編碼NDM-1酶的blaNDM-1基因包含813 bp的開放讀碼框，GC含量為57%，低于周圍相鄰基因片段GC含量（62%～65%），所以推測blaNDM-1基因片段屬于外源轉移獲得的新DNA片段，該基因進入細菌基因組并發(fā)生了重組[2，6-7]。這種方式給耐藥基因的傳播提供了基礎，從而增加了耐藥基因傳播的概率，也促進了耐藥菌株的變異。在此基因片段的上游還檢測到其他多種耐藥基因，如抗利福平、氯霉素、鏈霉素、磺胺類等，使得攜帶此類質粒的細菌對除多黏菌素和替加環(huán)素外的幾乎所有抗菌藥物耐藥。本研究中的菌株對β-內酰胺類藥物及β-內酰胺酶抑制劑復合物均表現(xiàn)出較高的耐藥性，而對氨基糖苷類和氟喹諾酮類藥物敏感性較好，因此可根據(jù)藥物敏感性試驗結果選擇臨床抗感染的主要治療藥物。本研究通過對耐藥基因的檢測發(fā)現(xiàn)，各菌株多攜帶多種耐藥基因，這也是細菌對多種β-內酰胺類藥物耐藥的一個原因。試驗菌株可通過接合轉移試驗將耐藥基因轉移到受體菌中，證明了blaNDM-1基因的可轉移性，而陽性接合子對β-內酰胺類藥物的耐藥性較高，但對氨基糖苷類、氟喹諾酮類、復方磺胺甲噁唑和呋喃妥因幾乎全部敏感。PFGE結果分析發(fā)現(xiàn)，2株大腸埃希菌沒有同源性，而3株陰溝腸桿菌中有2株譜帶相同，視為同一克隆株，但與另外1株屬于不同克隆株，這反映出本研究的菌株既存在耐藥基因在不同菌株間的水平傳播，也存在同一菌株在不同患者間的克隆傳播，提示臨床需加強病區(qū)衛(wèi)生消毒管理，提高醫(yī)護人員的衛(wèi)生防范意識。

在病原菌與抗菌藥物的相互斗爭中，耐藥菌株不斷被篩選出來，新的耐藥基因不斷被發(fā)現(xiàn)。本研究從多種腸桿菌科細菌中檢出blaNDM-1基因，而本實驗室先前的研究中僅檢測出blaKPC及blaIMP基因[8]，說明菌株的耐藥表型、耐藥基因型及流行分布情況等會因時間、地區(qū)等的差異而有所不同。改良Hodge試驗是CLSI推薦的碳青霉烯酶表型確證試驗，僅適用于腸桿菌科細菌，對于伴隨孔蛋白丟失，產ESBL或AmpC β-內酰胺酶的菌株會出現(xiàn)假陽性結果，偶爾會出現(xiàn)假陰性，尤其是產金屬酶菌株。本研究中1株肺炎克雷伯菌改良Hodge試驗為陰性，可以通過聯(lián)合乙二胺四乙酸-雙紙片協(xié)同試驗或進行Carba NP 試驗，提高對金屬酶檢出的敏感性。本研究的8株菌株中，有5株分離自兒童，3株分離自成人，這些患者大多具有嚴重的基礎疾病及并發(fā)癥，接受過外科手術及一些侵入性操作，在耐藥菌檢出前單獨或聯(lián)合使用過多種抗菌藥物進行預防或抗感染治療，這些均是導致耐藥菌株感染的高危因素。

目前，國內也有產NDM-1細菌感染的報道，但不同地區(qū)有所差異，我國首次報道是在2010年，寧夏和福建分別發(fā)現(xiàn)了2株攜帶該耐藥基因的屎腸球菌和1株鮑曼不動桿菌[3，9]。繼而海南、福建、浙江、云南、江西、河北等地均有耐藥菌株的出現(xiàn)[10-14]。HO等[15]在2011年對18個省57家醫(yī)院的11 298株腸桿菌blaNDM-1抗性基因的流行情況進行調查，結果顯示我國具有不同的抗性菌株和攜帶質粒的流行現(xiàn)象。相關的研究中攜帶blaNDM-1基因進行傳播的質粒有IncL/M、IncA/C、IncN2、IncFII、IncH、IncHI1、pNDM-BJ01以及IncX等[16-22]，這些不同的質粒具有相似的NDM-1核心區(qū)域，且該基因上下游序列比較保守。

細菌耐藥基因的出現(xiàn)是細菌在不同環(huán)境中增殖變異的產物，但由于長時間受不合理抗菌藥物環(huán)境的刺激，使敏感菌被抑制而耐藥菌得以被篩選，從而導致耐藥菌的比例增加。我們應通過抗菌藥物管理部門規(guī)范臨床醫(yī)生抗菌藥物的使用，加強臨床醫(yī)生與實驗室間的協(xié)作，減少抗菌藥物濫用；加強監(jiān)測，及時發(fā)現(xiàn)耐藥菌株，并采取有效措施控制耐藥菌株傳播，從而最大程度地減少耐藥菌株的增加。