鄧 芳，楊學軍，羅 準

（湖南省衡陽市食品藥品檢驗檢測中心，湖南 衡陽 421000）

附子為毛茛科植物烏頭 Aconitum carmichaelii Debx.子根的加工品，為回陽救逆之要藥，有補火助陽、散寒止痛功效。因其含有毒性較大的烏頭堿、新烏頭堿及次烏頭堿雙酯型生物堿，2015年版《中國藥典（一部）》[1]規(guī)定了雙酯型生物堿的上限量。按《中國藥典》采用高效液相色譜（HPLC）法測定含量，檢驗周期長，效率低，且對照品價格昂貴，試劑消耗量大，成本高。本試驗中通過采集附子及其炮制品的近紅外光譜，采用一階導數(shù)加矢量歸一法快速測定附子及其炮制品中的毒性成分，進行快捷、準確地初篩，從而提高檢驗效率。現(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

MPA近紅外光譜儀（德國布魯克公司）；Agilent 1260系列高效液相色譜儀（美國Agilent公司）；Mettler AE240型電子分析天平（瑞士梅特勒公司）；TTL-DCⅡ型氮吹儀（北京同泰聯(lián)科技發(fā)展有限公司）；DK410HT型超聲儀（深圳市得康洗凈電器有限公司）；泰斯特F80W型高速萬能粉碎機（天津市泰斯特儀器有限公司）。

1.2 試藥

烏頭堿對照品（批號為110720-201312，純度為98.9%），新烏頭堿對照品（批號為110799-201307，純度為 98.3%），次烏頭堿對照品（批號為 110798-201308，純度為98.6%），均購自中國食品藥品檢定研究院；乙腈、四氫呋喃為色譜純；水為超純水；其他試劑均為分析純。50批附子及炮制品樣品購自四川江油和陜西[2]2個主產(chǎn)區(qū)，經(jīng)我中心傅黎春主任中藥師鑒定為毛茛科植物烏頭 Aconitum carmichaelii Debx.的子根與加工品。

2 方法與結(jié)果

2.1 HPLC法測定含量

色譜條件：色譜柱為Agilent XDB-C18柱（250 mm×4.6mm，5μm，編號為 990967-902）；檢測波長為 235nm；柱溫為 30℃；進樣量為10 μL；流速為1.00 mL/min；流動相以乙腈-四氫呋喃（25∶15）為流動相 A，以0.1 mol/L醋酸銨溶液（每1 000 mL加冰醋酸0.5 mL）為流動相B，按表1條件進行梯度洗脫。

表1 流動相梯度洗脫條件

溶液制備：稱取新烏頭堿對照品0.009 46 g、次烏頭堿對照品0.009 96 g、烏頭堿對照品0.011 30 g，精密稱定，分別置100 mL容量瓶中，加異丙醇-二氯甲烷（1∶1）混合溶液 40 mL，超聲處理（功率 300 W，頻率40 kHz，水溫在25℃以下）使溶解，定容至刻度，作為貯備液。精密量取貯備液5 mL，置100 mL容量瓶中，加異丙醇-二氯甲烷（1∶1）混合溶液并定容至刻度，搖勻，即得混合對照品溶液。取本品粉末（過3號篩）約2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加氨試液3 mL，精密加入異丙醇-乙酸乙酯（1∶1）混合溶液50 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理（功率300 W，頻率40 kHz，水溫在25℃以下）30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用異丙醇-乙酸乙酯（1∶1）混合溶液補足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液25 mL，40℃以下減壓回收溶劑至干，殘渣精密加入異丙醇-二氯甲烷（1∶1）混合溶液3 mL溶解，濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

系統(tǒng)適用性試驗：理論板數(shù)以新烏頭堿計為42 700，分離度大于1.5。重復進樣5次，計算含量的 RSD，結(jié)果新烏頭堿為1.2%，次烏頭堿為1.3%，烏頭堿為1.2%（n=5）。

樣品含量測定：分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，測定。色譜圖見圖1。

圖1 混合對照品溶液高效液相色譜圖

結(jié)果計算：根據(jù)測得的峰面積，按外標法計算供試品中雙酯型生物堿含量，以新烏頭堿（C33H45NO11）、次烏頭堿（C33H45NO10）和烏頭堿（C34H47NO11）的總量計。結(jié)果見表2。

2.2 樣品的NIR光譜采集

將收集的43批附子及炮制品，粉碎，過3號篩[3-4]，每份5 g，分裝入樣品瓶中，混合均勻。光譜采樣條件：環(huán)境溫度25℃，相對濕度45% ～70%，積分球漫反射，分辨率8cm-1，光譜掃描范圍4000～10000cm-1。原始光譜圖見圖2。

圖2 43批附子及炮制品的近紅外光譜圖

2.3 定量模型的建立和優(yōu)化

光譜預處理方法選擇[5-10]：為消除噪聲和基線漂移對測定結(jié)果可靠性與準確性的影響，對收集到的近紅外光譜進行預處理。以模型的交叉檢驗決定系數(shù)（R2）和校正均方根差（RMSEC）作為參數(shù)來評價模型，通過比較，最終確定一階導數(shù)光譜+矢量歸一化法對光譜進行預處理。預處理方法對RMSEC和 R2的影響見表3。

譜段選擇：手動優(yōu)選最佳波段，輔以交叉驗證均方差（RMSECV）作為模型性能的評價指標，選取常用的偏最小二乘法（PLS）進行數(shù)據(jù)回歸分析。在6 101.8～4 597.6 cm-1譜段范圍內(nèi)特征性較強，作為建模的區(qū)域。詳見表4。

主因子數(shù)選擇：建立模型時所選的主因子數(shù)對預測結(jié)果會產(chǎn)生較大影響，所以在相同預處理方法及波段條件下，對其主因子數(shù)進行選擇。因子數(shù)太小，樣品模型代表性不強，模型覆蓋面窄；因子數(shù)太大，則模型樣品代表性雜亂。采用內(nèi)部驗證法，根據(jù)內(nèi)部RMSECV、R2隨主因子數(shù)的變化圖，當因子數(shù)為10時，可得到最小驗證集RMSECV和最大驗證集 R2，故選擇因子數(shù)為10。詳見圖3和圖4。

表2 43批附子藥材及炮制品的雙酯型生物堿含量（HPLC法和近紅外光譜法比較）

表3 雙酯型生物堿光譜預處理方法選擇

表4 雙酯型生物堿譜段選擇

2.4 定量模型的建立與驗證

從50份樣品中選擇43個樣品作為校正集、內(nèi)部驗證集，7個樣品作為外部驗證集，使驗證集樣品中的雙酯型生物堿的含量在校正集含量之間，結(jié)果見表2。用樣品的校正集建立校正模型，再作交叉驗證。最后用驗證集樣品對模型進行外部驗證，結(jié)果見表5。結(jié)果雙酯型生物堿的 R2=98.24，RMSECV=8.18，說明該模型具有良好的線性和預測能力。

表5 7批附子藥材及炮制品的雙酯型生物堿含量（HPLC法與近紅外光譜法比較）

圖4 因子選擇與驗證集決定系數(shù)關(guān)系圖

3 討論

在研究中對樣品粒度進行控制，可獲得與HPLC法測量值接近的紅外光譜圖，使用附子及炮制品的原片與粉碎后樣品的近紅外光譜圖有較大區(qū)別，附子及炮制品的粒度越大，光的折射就越多，光的漫反射就越小；反之，粒子越小，光就多為透射與折射，對樣品特征信息的反映就越多。因附子及其炮制品在粉碎過程中易粘結(jié)，不易獲得更細粉，選擇過3號篩的粉能獲得較好的NIR圖譜。為使近紅外收集到的信號平滑，消除偶然誤差與噪聲帶來的影響，對收集到的樣品掃描6次，取平均值參與建模。

附子炮制工藝不同，雙酯型生物堿含量的差異較大。炮制不到位，臨床用藥安全難以保證；炮制過度，藥效難以發(fā)揮。通過對四川與陜西兩大產(chǎn)地的調(diào)研發(fā)現(xiàn)，附子的炮制加工方法不盡相同，在本地區(qū)時有毒性藥材附子使用中毒的案例發(fā)生，因此建議監(jiān)督部門對毒性藥材附子在生產(chǎn)源頭加強監(jiān)管，使用部門嚴格按劑量使用，以防中毒事件的發(fā)生。

本試驗中通過近紅外光譜法與HPLC技術(shù)結(jié)合，采用偏最小二乘法建立了快速測定附子中雙酯型生物堿含量的分析模型，結(jié)果表明，該方法準確、簡便、快速、無污染，可實現(xiàn)大批量樣品的快速分析，為毒性藥材附子雙酯型生物堿的在線檢測與快速篩查提供了新思路和新方法。建立的檢測方法既可用于中藥生產(chǎn)與經(jīng)營企業(yè)購進驗收的快速初檢與藥材炮制的實時評價，又可作為各級監(jiān)管部門對市場上附子及炮制品的快速篩查，有利于快速無損地發(fā)現(xiàn)問題產(chǎn)品，及早控制風險，降低檢測成本，提高檢測效率，對于打擊制售假劣中藥，凈化藥品市場，確保人民群眾用藥安全，具有非常重要的意義。