劉光斌，姜芳寧，高 穎，何苗苗

（酒鋼醫(yī)院，甘肅 嘉峪關(guān) 735100）

茶堿（theophylline）為甲基嘌呤類衍生物，主要用于治療慢性哮喘。茶堿血藥濃度個(gè)體差異大，有效范圍為5～20 μg/mL，安全范圍窄，治療指數(shù)低，故有必要在其使用過程中監(jiān)測(cè)血藥濃度[1]。測(cè)定茶堿血藥濃度的方法有高效液相色譜（HPLC）法、紫外法（UV）、氣相色譜法（GC）、免疫測(cè)定法、高效毛細(xì)管電泳法（HPCE）等[1]。HPLC法檢測(cè)成本低，專屬性、靈敏度、分離度均良好，但文獻(xiàn)報(bào)道大多采用內(nèi)標(biāo)法測(cè)定，且樣品前處理過程需要萃取、復(fù)溶等復(fù)雜操作，技術(shù)性較強(qiáng)。本研究中采用直接沉淀蛋白法處理樣品，并與內(nèi)標(biāo)法測(cè)定結(jié)果進(jìn)行比較，結(jié)果顯示外標(biāo)法快速、簡單，符合臨床檢測(cè)要求?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

LC-2010AHT型高效液相色譜系統(tǒng)，包括自動(dòng)進(jìn)樣器、在線真空脫氣機(jī)、四元高壓泵及溫控系統(tǒng)(日本島津公司）；LC Solution工作站、AUW120D型十萬分之一電子分析天平（日本島津公司）。

1.2 試藥

茶堿對(duì)照品（中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)為100121-199903）；甲醇為色譜純，試驗(yàn)用水為超純水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜柱：Inertsil ODS-SP柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；柱溫：30 ℃；流動(dòng)相：甲醇 -水（20 ∶80，V ∶V）；流速：1.0 mL/min；檢測(cè)波長：270 nm；進(jìn)樣量：20 μL。

2.2 溶液配制

茶堿標(biāo)準(zhǔn)溶液：稱取茶堿對(duì)照品，精密稱定，置50 mL容量瓶中，加甲醇溶解后稀釋至刻度，搖勻，配制成質(zhì)量濃度為39.6 μg/mL的茶堿貯備溶液，冰箱（4℃）存放，臨用前用甲醇稀釋成不同質(zhì)量濃度。

茶堿標(biāo)準(zhǔn)血清樣品及質(zhì)控樣品：取數(shù)支1.5 mL的離心管，精密加入不同質(zhì)量濃度的茶堿標(biāo)準(zhǔn)溶液各0.1mL，分別加入空白血清0.5 mL，配制成相應(yīng)質(zhì)量濃度的茶堿標(biāo)準(zhǔn)血清樣品及質(zhì)控樣品。

2.3 樣品處理

精密量取血樣0.5 mL，置1.5 mL離心管中，添加甲醇0.1 mL，再加5%高氯酸0.5 mL，渦旋混合10 min，以12 000r/min的速率離心10min，取上清液，用0.22μm微孔濾膜濾過，以40 μL為進(jìn)樣量，進(jìn)樣分析。

2.4 方法學(xué)考察

專屬性試驗(yàn)：在擬訂色譜條件下，茶堿的吸收峰約在7.7 min出現(xiàn)，峰形尖銳，基線平穩(wěn)，雜峰不干擾測(cè)定（分離度大于1.5）。色譜圖見圖1。

圖1 高效液相色譜圖

線性關(guān)系考察：取數(shù)支1.5 mL離心管，分別精密加入 1.2，2.5，5.0，9.9，19.8，39.6 μg/mL 系列質(zhì)量濃度的茶堿標(biāo)準(zhǔn)溶液，以茶堿血清藥物質(zhì)量濃度（C）對(duì)應(yīng)峰面積（A）進(jìn)行線性回歸，得回歸方程 C=2.416 85×10-5A+0.378 36，r=0.999 9(n=6)。結(jié)果表明，血清中茶堿質(zhì)量濃度在1.2～39.6 μg/mL范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。茶堿的有效血藥濃度為5～20 μg/mL，此范圍可以滿足臨床檢測(cè)需要。茶堿的最低檢測(cè)限為0.4 μg/mL（信噪比以 S/N=3 ∶1 計(jì)）。

回收率和精密度試驗(yàn)：取1.5 mL離心管數(shù)支，分別取茶堿標(biāo)準(zhǔn)溶液適量，置離心管中，添加空白血清0.5 mL，配制成 5.0，19.8，39.6 μg/mL 3 種質(zhì)量濃度的茶堿血清樣品。每個(gè)樣品測(cè)定5次，以平均值作為測(cè)定值，用測(cè)定值和實(shí)際值計(jì)算回收率。3種質(zhì)量濃度的溶液同一日內(nèi)測(cè)定5次計(jì)算日內(nèi)精密度，連續(xù)5日內(nèi)每日測(cè)定1次計(jì)算日間精密度。結(jié)果見表1。

表1 回收率和精密度試驗(yàn)結(jié)果

穩(wěn)定性試驗(yàn)：參照文獻(xiàn)[2]，取數(shù)支1.5 mL離心管，精密加入質(zhì)量濃度分別為5.0，19.8，39.6 μg/mL的茶堿質(zhì)控樣品0.25 mL，平行制備5份。第1份按血清樣品處理方法處理后即刻（時(shí)刻A）進(jìn)樣；第2份室溫條件放置4 h，按血清樣品處理方法處理后（時(shí)刻B）進(jìn)樣；第3份在4℃放置24 h，按血清樣品處理方法處理后（時(shí)刻C）進(jìn)樣；第4份置冰箱內(nèi)冷凍4周后取出，融化，按血清樣品處理方法處理后（時(shí)刻D）進(jìn)樣；第5份在4周內(nèi)凍、融3次，再按血清樣品處理方法處理后（時(shí)刻E）進(jìn)樣。結(jié)果見表2。

表2 血清中茶堿穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

2.5 內(nèi)標(biāo)和外標(biāo)法測(cè)定結(jié)果比較

分別取 5.0，19.8，39.6 μg/mL 質(zhì)量濃度的茶堿血清樣品溶液，用本研究方法和文獻(xiàn)方法（內(nèi)標(biāo)法）[3]分別測(cè)定，結(jié)果見表3。經(jīng) t檢驗(yàn)，兩種方法測(cè)得的回收率比較，差異無顯著性（P>0.05）。取服用茶堿的患者血樣20份，分別用本研究方法和文獻(xiàn)方法（內(nèi)標(biāo)法）[3]測(cè)定，結(jié)果經(jīng) t檢驗(yàn)，兩種方法測(cè)得值比較，差異無顯著性（P>0.05）。

表3 內(nèi)標(biāo)法與外標(biāo)法測(cè)定結(jié)果比較

3 討論

模擬臨床常用聯(lián)合用藥，將哮喘患者及COPD患者常用的各種藥物與茶堿進(jìn)行混合測(cè)定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)諸多常用藥物均不干擾茶堿血藥濃度的測(cè)定，說明本方法特異性較高。

據(jù)報(bào)道，茶堿血藥濃度檢測(cè)使用的波長有273，254，210 nm等，其中以270 nm左右居多[3-5]。對(duì)不同波長分別進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)波長為270 nm時(shí)其他組分對(duì)茶堿的干擾較小，色譜響應(yīng)較強(qiáng)，靈敏度高。

用5%高氯酸、乙腈和甲醇分別作為血清蛋白沉淀劑進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果單純使用5%高氯酸沉淀時(shí)色譜圖中段有饅頭樣峰出現(xiàn)，且基線不穩(wěn)定；選用乙腈、甲醇時(shí)回收率達(dá)不到要求；最終采用5%高氯酸和甲醇聯(lián)合作為沉淀劑時(shí)回收率達(dá)標(biāo)、基線穩(wěn)定。5%高氯酸的用量參照文獻(xiàn)使用標(biāo)本量的80%[6]。

血藥濃度測(cè)定因前處理步驟煩瑣，需用內(nèi)標(biāo)法校正，但也有文獻(xiàn)提出內(nèi)標(biāo)法需要加入其他物質(zhì)作為內(nèi)標(biāo)，增加操作步驟而增加了操作誤差，因此內(nèi)標(biāo)法未必能明顯改善血藥濃度檢測(cè)方法的精密度[7]。本研究中建立的外標(biāo)法與文獻(xiàn)報(bào)道的內(nèi)標(biāo)法[3]的測(cè)定結(jié)果均接近理論值，且無顯著性差異（P>0.05），說明兩種測(cè)定方法可互相替代。本研究中使用外標(biāo)法進(jìn)行過諸多藥物血藥濃度的研究，結(jié)果均較滿意[8-10]。

有文獻(xiàn)報(bào)道，HPLC法測(cè)定茶堿血藥濃度時(shí)選擇的流動(dòng)相有0.03 mol/mL磷酸鹽-乙腈-水[4]、甲醇-0.05 mol/mL硫酸鋰[11]、甲醇-水-0.1%三氟乙酸[12]等。本研究中采用甲醇和水為流動(dòng)相，不需使用其他鹽和酸，故成本較低、操作簡單，為較理想的檢測(cè)方法。