宋吉軒，呂俊，宗學(xué)鳳，何秀娟，徐宇，吳瀟，王三根*

(1.西南大學(xué)農(nóng)學(xué)與生物科技學(xué)院，重慶400715；2.貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所，貴州 貴陽 550006)

由于氣候的變化，干旱對(duì)植物的影響在全球范圍內(nèi)日益嚴(yán)重，其不僅造成土壤水分缺失，還可導(dǎo)致極端現(xiàn)象發(fā)生，因干旱引起的植物生長發(fā)育和作物產(chǎn)量的減產(chǎn)超過了其他環(huán)境脅迫的總和[1]。故干旱脅迫對(duì)植物的生長、代謝等的影響研究已成為研究的熱點(diǎn)[2]。羊草(Leymuschinensis)具有高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)及耐牧等特點(diǎn)，是我國多地優(yōu)勢的禾本科多年生牧草作物和生態(tài)草[3]。同樣，我國羊草分布區(qū)也受到干旱等環(huán)境脅迫，對(duì)其生產(chǎn)力的提高有很大影響[4]。

羊草雖然具有一定的耐旱能力，但當(dāng)其生境嚴(yán)重缺水時(shí)，其生長發(fā)育、產(chǎn)量及質(zhì)量也會(huì)受到嚴(yán)重的影響[4-5]。干旱脅迫使植物體內(nèi)發(fā)生一系列的生理生化反應(yīng)和基因表達(dá)的變化[6]，利用外源物質(zhì)對(duì)植物進(jìn)行處理，是提高植物抗逆性簡便、可行的方法之一[7]。5-氨基乙酰丙酸(5-aminolevulinic acid，ALA)是一種包含氧和氮的碳?xì)浠衔铮巧矬w內(nèi)的葉綠素、血紅素和維生素B12等合成的前體物質(zhì)，廣泛存在于動(dòng)植物和微生物的細(xì)胞中[8]。ALA對(duì)人畜無害，同時(shí)對(duì)環(huán)境無污染易降解，具有類似于植物激素的生理活性，被作為一種新型的植物生長調(diào)節(jié)劑，可促進(jìn)生長，增強(qiáng)光合效率，加強(qiáng)植物組織的分化及物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)等[9]。ALA也具有提高植物抗逆性的功能如遮陰脅迫[10]，低溫脅迫[11]，干旱脅迫[12]等。ALA可以提高羊草在鹽脅迫[13]與溫度脅迫[14]下的抗性，促進(jìn)生長。也對(duì)ALA提高羊草抗旱力作了初步報(bào)告[5]。

轉(zhuǎn)錄組是從基因功能和結(jié)構(gòu)整體水平出發(fā)，揭示特定生物過程的分子機(jī)制[15]。植物體的抗旱是由多基因控制的[16]，涉及一系列的調(diào)控及很多基因的表達(dá)。轉(zhuǎn)錄組測序?yàn)檠芯恐参锟剐詸C(jī)理提供了方便，成為揭示干旱脅迫信號(hào)通路和預(yù)測基因功能的有力工具[17]。關(guān)于羊草抗性的研究主要集中在生理生化方面，在轉(zhuǎn)錄組方面的研究很少。孫業(yè)鵬[18]通過轉(zhuǎn)錄組分析對(duì)鹽堿脅迫下羊草與鹽堿脅迫相關(guān)的功能關(guān)系進(jìn)行研究。董圓圓等[19]對(duì)鹽堿脅迫下羊草轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行了分析。尚未見干旱脅迫特別是ALA處理后羊草轉(zhuǎn)錄組分析的報(bào)告。

由于植物對(duì)干旱脅迫的響應(yīng)是通過分子、細(xì)胞和植物層面利用一系列生理生化反應(yīng)來綜合調(diào)控的[20]，本研究試圖將植株生長、物質(zhì)積累、根系活力、氮磷鉀含量及其相關(guān)酶活性的改變、內(nèi)源激素的含量及其比例變化、轉(zhuǎn)錄組水平相關(guān)變化聯(lián)系起來，解析干旱脅迫與ALA處理對(duì)羊草生長的影響機(jī)制，為在生產(chǎn)實(shí)踐中利用ALA調(diào)控羊草生長提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)所用的羊草種子采集于錫林浩特的中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院草原研究所退化恢復(fù)樣地，試驗(yàn)于2016年4月開始于西南大學(xué)進(jìn)行。選取籽粒飽滿、大小一致和無病蟲害的羊草種子，用濃度為1.0% 次氯酸鈉溶液進(jìn)行消毒處理10 min左右，然后用蒸餾水沖洗3～5次，將種子均勻鋪入有雙層濾紙的培養(yǎng)盤中進(jìn)行種子發(fā)芽試驗(yàn)。種子在培養(yǎng)箱中 (25±1) ℃恒溫培養(yǎng)，光照時(shí)間設(shè)為14 h/10 h(晝/夜)，光照強(qiáng)度為2500 lx。1周后將長勢一致的羊草幼苗移栽到盆缽里，利用稱重法每天監(jiān)測土壤的水分含量，并及時(shí)補(bǔ)充各處理消耗的水分[21]。參考Hsiao[22]對(duì)植物水分脅迫的等級(jí)劃分以及其他有關(guān)羊草干旱脅迫的相關(guān)研究[23-25]，以土壤相對(duì)含水量80% 為對(duì)照1(CK1)，土壤相對(duì)含水量50% 作干旱脅迫為對(duì)照2(CK2)，并設(shè)干旱脅迫+ALA濃度分別為10 mg·L-1(T10)、50 mg·L-1(T50)和100 mg·L-1(T100)3個(gè)處理。當(dāng)羊草株高為18～21 cm時(shí)，對(duì)各處理進(jìn)行不同濃度ALA葉面噴施，對(duì)照則噴施等量的清水；7 d 后重復(fù)噴施一次。噴施完成7 d 后取樣研究ALA對(duì)羊草生長的影響，并且找出最佳的處理濃度；然后用這個(gè)處理濃度進(jìn)一步研究其對(duì)植株?duì)I養(yǎng)積累、激素含量的影響及轉(zhuǎn)錄組分析。所有處理均3次重復(fù)。

1.2 生長與生理指標(biāo)測定

株高:量取植株莖基部到頂葉尖端的距離；植物鮮重測定，去除羊草表面雜物然后用水沖洗干凈，晾干后稱重為鮮重。糖含量采用蒽酮比色法測定[26]；蛋白質(zhì)含量采用考馬斯亮藍(lán)法測定[27]；根系活力采用TTC(氯化三苯四氮唑)法測定[28]。植株硝酸還原酶(NR)采用離體法測定[29]；酸性磷酸酶(ACP)采用比色法測定[30]；蘋果酸脫氫酶(MD)采用Sayre等[31]的方法測定。營養(yǎng)元素氮采用凱氏定氮法測定[32]；磷采用濃硫酸消煮，鉬銻抗比色法測定[33]；鉀采用濃硫酸消煮，原子吸收分光光度法測定[34]。脫落酸(ABA)、吲哚乙酸(IAA)、赤霉素(GA3)及玉米素(ZR)等植物內(nèi)源激素含量采用固相抗體型酶聯(lián)免疫吸附法 (ELISA) 進(jìn)行測定[35]。

1.3 轉(zhuǎn)錄組分析

同時(shí)將羊草上部葉片采集后迅速置于-80 ℃液氮中速凍，貯藏備用。取混合樣品提 RNA 進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，具體方法是將實(shí)驗(yàn)材料置于液氮中研磨后，快速提取總 RNA，檢測合格的樣品用于后續(xù)試驗(yàn)。富集 mRNA，以其為模板，合成 cDNA，純化后進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，得到最終的文庫。用 Q-PCR 方法對(duì)文庫的有效濃度進(jìn)行準(zhǔn)確定量，檢測合格后測序。利用RSEM軟件對(duì)基因表達(dá)水平比對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)[36]，并對(duì)其進(jìn)行 FPKM 轉(zhuǎn)換后用于基因表達(dá)水平的分析和差異表達(dá)基因篩選[37]。基因差異表達(dá)的輸入數(shù)據(jù)為基因表達(dá)水平分析中得到的 read count 數(shù)據(jù)。差異表達(dá)基因的篩選條件是先采用 TMM 對(duì) read count 數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，再用 DEGseq 進(jìn)行差異分析，篩選閾值為 qvalue<0.005 且 |log2 Fold Change|>1。用 Gene Ontology 進(jìn)行功能注釋及分類，生物途徑顯著性富集分析[38]。測序分析委托北京諾禾致源生物信息科技有限公司承擔(dān)。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

采用Excel和SPSS軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。利用DPS 19.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，以Duncan’s 新復(fù)極差法比較各處理間的差異性。

2 結(jié)果與分析

2.1 ALA對(duì)干旱脅迫下羊草植株生長的影響

由表1可以看出，經(jīng)干旱脅迫(CK2)后的羊草幼苗株高、鮮重均顯著降低，與CK1相比差異達(dá)顯著水平，同時(shí)其根系活力也顯著降低；但是植株的糖與蛋白質(zhì)含量明顯升高。經(jīng)過不同濃度ALA處理后，這些指標(biāo)與CK2相比都有一定的增加，有的與CK2相比達(dá)到差異顯著水平。值得關(guān)注的是，當(dāng)ALA濃度為50 mg·L-1(T50處理)時(shí)，各個(gè)指標(biāo)都達(dá)到最大值，其株高、鮮重與根系活力指標(biāo)甚至超過或與CK1相當(dāng)，糖與蛋白質(zhì)含量也達(dá)到最大值。T50處理與對(duì)照CK2相比較，其株高、鮮重與根系活力分別增加了40.6%，75.3%和65.2%。此外，與干旱脅迫CK2和對(duì)照CK1相比較，T50處理植株的糖含量分別增加了48.0%和95.4%；蛋白質(zhì)含量分別增加了72.7%和200.1%?？傊?，適當(dāng)濃度的ALA對(duì)在干旱脅迫下的羊草具有很好的緩解效應(yīng)，增強(qiáng)了其幼苗的抗旱能力，可促進(jìn)幼苗生長與物質(zhì)積累，其中以施用ALA濃度為50 mg·L-1時(shí)的處理效果最佳。

2.2 ALA對(duì)干旱脅迫下羊草氮磷鉀與營養(yǎng)代謝相關(guān)酶活性的影響

鑒于ALA濃度為50 mg·L-1(T50)時(shí)的處理對(duì)羊草抗旱的效果最好，本研究以此濃度處理又做了進(jìn)一步的研究。由表2可以看出，在干旱下(CK2)羊草幼苗氮與磷含量降低，并且與CK1相比均達(dá)到差異顯著水平；K含量略有下降。在經(jīng)過ALA(T50)處理后，其氮、磷以及鉀含量均有不同程度升高，特別是磷和鉀含量不但顯著高于CK2，而且還超過了CK1。與干旱脅迫CK2和對(duì)照CK1相比較，T50處理植株的P含量分別增加了37.1%和16.4%；K含量分別增加了21.4%和14.6%。分析比較與植株氮、磷、鉀等營養(yǎng)代謝相關(guān)酶活性的變化，可以看出干旱脅迫下(CK2)羊草的硝酸還原酶和酸性磷酸酶活性均顯著降低，而蘋果酸脫氫酶活性則顯著升高。經(jīng)過ALA(T50)處理后，植株的硝酸還原酶和酸性磷酸酶活性有所提高，與CK2相比達(dá)到顯著水平，但是沒有恢復(fù)到CK1的水平。值得關(guān)注的是其蘋果酸脫氫酶活性在ALA(T50)處理后顯著降低。

表1 不同濃度ALA對(duì)干旱脅迫下羊草生長的影響Table 1 Effects of different concentration ALA on the growth of L. chinensis under drought stress

注：同列不同字母表示差異達(dá)顯著水平(P<0.05)，下同。

Note: Different letters mean significant different at 0.05 level. The same below.

表2 干旱脅迫下ALA對(duì)羊草N、P、K與營養(yǎng)代謝相關(guān)酶活性的影響Table 2 Effects of ALA on N，P，K and the enzyme activities of nutritional metabolism in L. chinensis under drought stress

2.3 ALA對(duì)干旱脅迫下羊草內(nèi)源激素的影響

由表3可以看出，羊草的脫落酸(ABA)、吲哚乙酸(IAA)、赤霉素(GA3)及玉米素(ZR)等植物內(nèi)源激素含量在干旱脅迫后(CK2)有很大的變化；其中ABA和IAA顯著升高，GA3和ZR顯著降低。經(jīng)過ALA(T50)處理后，植株的內(nèi)源激素含量進(jìn)一步改變。如ABA含量降低了，但是仍然高于CK1；IAA、GA3及ZR則升高了。特別是IAA含量達(dá)到了最大值，分別比CK2和CK1增加了100.3%和158.5%。

表3 干旱脅迫下ALA對(duì)羊草內(nèi)源激素含量的影響Table 3 Effects of ALA treatments on endogenous hormone in L. chinensis under drought stress (ng·g-1)

植物激素的相對(duì)比例對(duì)植株生長影響更大。由表4可以看出，干旱脅迫使羊草幼苗幾類促進(jìn)生長與細(xì)胞分裂的激素(IAA、GA3和ZR)和ABA的比值也發(fā)生了改變。經(jīng)過干旱脅迫(CK2)，植株的IAA/ABA、ZR/ABA和GA3/ABA值均比正常水分處理(CK1)的比值有所下降，其總的(IAA+ZR+GA3)/ABA的值只有CK1的58%。當(dāng)用ALA(T50)處理后，植株的IAA/ABA、ZR/ABA和GA3/ABA值均超過了CK2，其中IAA/ABA還超過了CK1。計(jì)算總的(IAA+ZR+GA3)/ABA的值，比CK2上升了148%，甚至與CK1相比也上升了44%。

表4 干旱脅迫下ALA對(duì)羊草內(nèi)源激素比例的影響Table 4 Effects of ALA treatments on ratio of endogenous hormones in L. chinensis under drought stress

2.4 ALA對(duì)干旱脅迫下羊草生長差異表達(dá)相關(guān)基因分析

從轉(zhuǎn)錄組測序錯(cuò)誤率可知，正常水分處理 (CK1) 的測序錯(cuò)誤率在0.02%左右，干旱脅迫 (CK2) 測序錯(cuò)誤率在0.02%左右，干旱脅迫+ALA(50 mg·L-1)處理 (T50) 的測序錯(cuò)誤率在0.01%左右。CK1、CK2和T50分別得到測序數(shù)據(jù)為46818506，45746216，43609948，過濾后去除低質(zhì)量的，得到過濾后用于組裝的數(shù)據(jù)分別為45315832，44865196，42175670，過濾后質(zhì)量不低于20的堿基的比例分別為97.30%、96.40%、97.64%，過濾后質(zhì)量不低于30的堿基的比例分別為92.93%、91.13%、93.78%，GC比例(過濾后堿基G和C數(shù)占總堿基數(shù)的比例)分別為55.94%、55.73%、56.13%。這些數(shù)據(jù)表明測序所得的結(jié)果能用于后續(xù)的組裝和轉(zhuǎn)錄組的分析(表5)。通過對(duì)轉(zhuǎn)錄組測序的比較分析，生長相關(guān)基因的查找過程使用了同源基因BLAST，發(fā)現(xiàn)以正常樣品為對(duì)照(CK1)，在干旱脅迫下(CK2)共檢測到1373個(gè)基因發(fā)生了顯著差異表達(dá)，其中733個(gè)基因?yàn)轱@著下調(diào)表達(dá)；以CK2為對(duì)照，用ALA處理后(T50)共檢測到1315個(gè)基因發(fā)生了顯著差異表達(dá)，其中676個(gè)基因表達(dá)上調(diào)。

表5 測序產(chǎn)量及組裝質(zhì)量統(tǒng)計(jì)Table 5 Statistics of sequencing results and assembly quality

注：Q20，過濾后質(zhì)量不低于20的堿基比例。Q30，過濾后質(zhì)量不低于30的堿基比例。GC，過濾后堿基G和C數(shù)占總堿基數(shù)的比例。

Note: Q20，clean bases ratio that quality >20. Q30，clean bases ratio that quality >30. GC，clean bases ratio of G and C.

本研究對(duì)干旱脅迫 (CK2) 材料中下調(diào)表達(dá)的差異基因進(jìn)行了GO富集分析。GO 注釋由3個(gè)相對(duì)獨(dú)立的部分組成，包括生物學(xué)過程、分子功能和細(xì)胞組分等，這3部分可以完整描述基因的所有生物學(xué)功能，有12條被注釋到生物學(xué)過程中，23條被注釋到分子功能中，14條被注釋到細(xì)胞組分中。在對(duì)其中與生長密切相關(guān)的注釋結(jié)果的分析表明(表6)：GO富集的條目中基因表達(dá)下調(diào)包括多個(gè)糖類代謝的條目，如碳水化合物代謝過程、葡萄糖解代謝過程、己糖代謝過程、單糖分解過程、碳水化合物分解過程。呼吸作用方面表達(dá)顯著下調(diào)的有糖酵解中重要的磷酸甘油酸變位酶、磷酸己糖異構(gòu)酶、磷酸甘油酸酯激酶、丙酮酸脫氫酶，還有呼吸作用電子傳遞鏈中的重要成分如NADH-輔酶Q氧化還原酶(復(fù)合體I)、F0F1-type ATP synthase(復(fù)合體Ⅴ)、輔酶Q-細(xì)胞色素C氧化還原酶(復(fù)合體Ⅲ)、鐵氧還蛋白等。在血紅素合成過程中起重要作用的四吡咯結(jié)合也被富集。此外，物質(zhì)運(yùn)輸方面的蛋白跨膜運(yùn)輸活性、大分子物質(zhì)運(yùn)輸活性都被顯著富集。不飽和脂肪酸合成途徑中的關(guān)鍵酶omega-3 脂肪酸去飽和酶的基因表達(dá)也顯著下調(diào)。這些基因的顯著下調(diào)，嚴(yán)重影響羊草的正常生長發(fā)育、能量代謝與物質(zhì)積累。

表6 羊草在干旱脅迫處理后生長相關(guān)下調(diào)差異基因的GO注釋結(jié)果Table 6 GO annotation of the down-regulated genes related to growth in L. chinensis under drought stress

BP：生物學(xué)過程 Biological process；MF: 分子功能 Molecular function；CC: 細(xì)胞組分 Celelular component.下同 The same below.

對(duì)干旱脅迫下用ALA處理材料 (T50) 中上調(diào)表達(dá)的差異基因進(jìn)行了GO富集分析。發(fā)現(xiàn)其中4條被注釋到生物學(xué)過程中，13條被注釋到分子功能中，1條被注釋到細(xì)胞組分中。在對(duì)其中與生長密切相關(guān)的注釋結(jié)果的分析表明(表7)：干旱脅迫下顯著下降的一些代謝過程因噴施ALA顯著上調(diào)。如糖酵解中重要的2,3-二磷酸變位酶，與細(xì)胞中各種膜成分密切相關(guān)的脂肪酸合成途徑基因，電子傳遞的多個(gè)組分等。此外，氧化還原過程，四吡咯結(jié)合，單(雙)加氧氧化還原酶活性，3-氧?；?[?；?運(yùn)轉(zhuǎn)蛋白]合成酶活性，ɑ-半乳糖苷酶活性，絲氨酸型肽鏈內(nèi)切酶抑制劑活性等相關(guān)基因也顯著上調(diào)。這些基因的顯著上調(diào)，顯然對(duì)羊草緩解逆境的傷害、恢復(fù)其正常生長發(fā)育、能量代謝與物質(zhì)積累有很大幫助。

3 討論

干旱脅迫是影響植物生長和代謝的主要逆境因素之一[39]。而植物對(duì)干旱脅迫的響應(yīng)是通過分子、細(xì)胞和植物層面利用一系列生理生化反應(yīng)來綜合調(diào)控的[20]。通過采取不同的措施可以緩解或減輕干旱脅迫對(duì)植物的傷害，如用植物生長調(diào)節(jié)劑等處理[40]。韋品祥等[41]結(jié)果表明，在干旱脅迫下的金蕎麥(Fagopyrumdibotrys)幼苗生長受到顯著影響，但經(jīng)不同濃度的ALA處理后各指標(biāo)均得到一定程度的恢復(fù)。本研究表明(表1)，干旱脅迫使羊草的株高和鮮重等受到明顯抑制，而適當(dāng)濃度的ALA處理可恢復(fù)其生長，這與前述[5]研究外源ALA改善干旱脅迫下羊草幼苗的生長狀況的結(jié)果一致。本研究還發(fā)現(xiàn)，在干旱脅迫下，植株的糖與蛋白質(zhì)含量有所增加，印證了羊草對(duì)干旱有一定的適應(yīng)能力；但采用不同濃度的ALA處理過后，羊草植株糖與蛋白質(zhì)含量增加更為顯著，表明ALA可以進(jìn)一步提高植株抗旱性。根系活力是植物根系吸收、合成以及代謝能力的綜合體現(xiàn)，它影響地上部的生長和營養(yǎng)狀況，是一種較客觀地反映根系生命活動(dòng)的生理指標(biāo)[42]。本研究表明，干旱脅迫下羊草幼苗植株根系活力下降，外施不同濃度的ALA使根系活力上升，其中ALA濃度為50 mg·L-1時(shí)根系活力達(dá)到最大值。綜合分析其他指標(biāo)，以ALA濃度為50 mg·L-1(T50)的處理又做了進(jìn)一步的研究。

氮、磷和鉀含量在植物代謝與營養(yǎng)中特別是干旱脅迫下的作用極其重要[43-44]。本研究表明(表2)，干旱脅迫導(dǎo)致羊草幼苗氮磷鉀含量降低，而在經(jīng)過ALA處理后，其氮磷鉀含量均得以升高，特別是磷鉀含量還超過了正常土壤含水量的處理，這是值得關(guān)注的現(xiàn)象。這些結(jié)果可能與在ALA處理后根系活力大大增強(qiáng)及生長代謝相關(guān)基因的上調(diào)有關(guān)。同時(shí)，與氮磷鉀代謝相關(guān)的酶活性在干旱脅迫及ALA處理后，也發(fā)生了很大變化。已知硝酸還原酶活性與植株的氮代謝和生理功能密切相關(guān)[45]。酸性磷酸酶是一種誘導(dǎo)酶，其活性受磷的影響，是植物對(duì)缺磷脅迫的一種適應(yīng)性反應(yīng)[46]。蘋果酸脫氫酶在植物體內(nèi)廣泛存在，有重要的生理作用，其活性與鉀有密切關(guān)系[47-48]。本研究中干旱脅迫下羊草的硝酸還原酶和酸性磷酸酶活性均顯著降低，蘋果酸脫氫酶活性則顯著升高；而在ALA處理后，植株的硝酸還原酶和酸性磷酸酶活性有所提高，但蘋果酸脫氫酶活性則顯著降低。氮磷鉀含量在干旱脅迫與ALA處理之后的變化及其和幾種酶活性變化的關(guān)系值得深入研究。

干旱脅迫條件下，植物體內(nèi)激素的形成、比值及運(yùn)輸?shù)劝l(fā)生了相應(yīng)的變化，這些變化將直接影響植物生長與代謝[49]。本研究表明羊草的脫落酸(ABA)、吲哚乙酸(IAA)、赤霉素(GA3)及玉米素(ZR)等植物內(nèi)源激素含量在干旱脅迫后均有改變，其中ABA和IAA顯著升高，GA3和ZR顯著降低(表3)。在逆境下植物體內(nèi)的ABA、IAA、GA3和ZR等激素具有信號(hào)傳導(dǎo)等作用，可關(guān)系到植物適應(yīng)不良環(huán)境的能力，可直接影響植物對(duì)干旱脅迫的反應(yīng)[50]。通常ABA干旱脅迫會(huì)升高，但本研究IAA在干旱下也升高，其中的原因值得研究。同時(shí)研究也發(fā)現(xiàn)，在干旱脅迫時(shí)經(jīng)過ALA處理，植株的內(nèi)源激素含量進(jìn)一步改變。如ABA含量降低了，但是仍然高于正常的土壤水分含量處理；IAA、GA3及ZR則升高，特別是IAA含量還達(dá)到了最大值。植物激素對(duì)逆境下植物的調(diào)控方式較為復(fù)雜，植物對(duì)水分逆境較敏感，逆境下ABA的累積調(diào)控植物器官的衰老和脫落[51]；IAA在細(xì)胞乃至器官的伸長生長以及頂端優(yōu)勢方面都有顯著影響[50]; GA3對(duì)莖的延長以及一些酶的合成方面有重要影響[52]; ZR對(duì)細(xì)胞分裂、膨大具有促進(jìn)作用，同時(shí)也影響細(xì)胞衰老過程[53]。楊衛(wèi)兵等[54]結(jié)果表明，水稻(Oryzasativa)通過外源調(diào)節(jié)劑處理后，可以明顯改變植株內(nèi)源激素ABA、GA3、IAA和CTK的含量，從而影響其生長與代謝，這與我們施用ALA后對(duì)羊草激素含量變化的規(guī)律相似。

不利環(huán)境可讓植物體內(nèi)的激素含量及活性發(fā)生改變，這些改變可影響植物的生理生化反應(yīng)，激素間比值的變化在抗逆性中的作用更為重要。植物體內(nèi)各激素間的相互影響可產(chǎn)生極其繁雜的調(diào)控系統(tǒng)，從而調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育的眾多代謝[55]。本研究表明，經(jīng)干旱脅迫后，羊草幼苗幾類促進(jìn)生長與細(xì)胞分裂的激素(IAA、GA3和ZR)和ABA的比值也發(fā)生了改變，其中IAA/ABA、ZR/ABA和GA3/ABA值均比正常水分處理的比值有所下降(表4)。周芳等[56]關(guān)于干旱脅迫對(duì)苗期木薯(Manihotesculenta)內(nèi)源激素含量影響研究有類似的變化趨勢，IAA與ABA的比值會(huì)對(duì)植物的生長或衰老產(chǎn)生影響，二者具有拮抗作用；ZR/ABA與植物的頂端優(yōu)勢相關(guān)聯(lián)；GA3/ABA可以影響植物的休眠作用。本研究還發(fā)現(xiàn)，當(dāng)干旱時(shí)用ALA處理后，植株的IAA/ABA、ZR/ABA和GA3/ABA值均超過了僅用干旱處理；特別是總的(IAA+ZR+GA3)/ABA的值，不僅高于干旱脅迫，甚至還超過了正常的土壤水分含量處理。將這些內(nèi)源激素的變化與前述的植株生長、物質(zhì)積累、根系活力、氮磷鉀含量及其相關(guān)酶活性的改變聯(lián)系起來，推測ALA可能通過影響激素的含量與比例的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)方式調(diào)控羊草的生長代謝過程[57]，其中的機(jī)理需要進(jìn)一步探討。

轉(zhuǎn)錄組測序?yàn)檠芯恐参锟剐詸C(jī)理提供了方便，通過對(duì)轉(zhuǎn)錄組測序的比較分析，發(fā)現(xiàn)干旱脅迫與正常水分處理相比，有超過千個(gè)基因發(fā)生了顯著差異表達(dá)，其中七百多個(gè)基因?yàn)轱@著下調(diào)表達(dá)。干旱脅迫處理后基因表達(dá)下調(diào)包括碳水化合物代謝過程、呼吸作用中重要的酶類以及電子傳遞鏈的成分、蛋白跨膜運(yùn)輸活性等(表6)。從整體來看羊草的代謝過程、催化活性、氧化還原等重要的途徑在干旱脅迫時(shí)其基因表達(dá)受到了抑制，當(dāng)然會(huì)對(duì)羊草的生長發(fā)育產(chǎn)生嚴(yán)重影響。特別是糖類物質(zhì)的代謝尤其受影響，多個(gè)相關(guān)代謝過程基因表達(dá)顯著下調(diào)。糖類化合物是一切生物體維持生命活動(dòng)所需能量的主要來源，同時(shí)還具有特殊的生理活性。干旱造成的糖代謝基因表達(dá)的下調(diào)，嚴(yán)重影響到了羊草的相關(guān)生理代謝過程，也包括營養(yǎng)代謝過程。

外源ALA因可以緩解多種非生物脅迫對(duì)植物產(chǎn)生的不利作用，已經(jīng)在較多作物中應(yīng)用[11，58-59]。但是在各種逆境脅迫下，特別是干旱脅迫下ALA 對(duì)植物調(diào)控分子機(jī)理還沒有研究清楚。本研究發(fā)現(xiàn)在干旱的同時(shí)用ALA處理后，與僅用干旱處理相比，也有超過千個(gè)基因發(fā)生了顯著差異表達(dá)，其中600多個(gè)基因表達(dá)上調(diào)。特別是干旱脅迫下顯著下降的一些代謝過程在噴施ALA后顯著上調(diào)，如糖酵解中的酶、脂肪酸合成途徑基因、電子傳遞的多個(gè)組分等；此外，氧化還原過程、氧化還原酶活性運(yùn)轉(zhuǎn)蛋白合成酶活性等相關(guān)基因也顯著上調(diào)(表7)。這些基因表達(dá)顯著上調(diào)保證了羊草植株產(chǎn)生ATP和還原力，維持相對(duì)正常的呼吸作用，滿足植物體內(nèi)各個(gè)生理過程對(duì)能量與物質(zhì)代謝的需求。從總體上看羊草的代謝過程、氧化還原酶反應(yīng)等這些在干旱脅迫下表達(dá)顯著下調(diào)的代謝途徑，在使用ALA處理以后表達(dá)都顯著上調(diào)了，表明干旱脅迫下影響這些基因的正常表達(dá)，進(jìn)而引起生理和生長的受害，而外源ALA的處理可以大大緩解干旱脅迫對(duì)這些生理過程的傷害。

轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果從基因水平證明了ALA調(diào)控羊草抗旱性提高的可能性，為進(jìn)一步解析羊草應(yīng)答干旱脅迫以及ALA提高羊草抗旱性的分子調(diào)控機(jī)制打下了基礎(chǔ)。表6與表7的生長相關(guān)顯著下(上)調(diào)基因有的也與營養(yǎng)代謝相關(guān)酶活性及激素代謝有一定聯(lián)系，但其直接聯(lián)系尚需進(jìn)一步的證據(jù)。

4 結(jié)論

適當(dāng)濃度的ALA可提高羊草株高、鮮重，增強(qiáng)根系活力，促進(jìn)糖、蛋白、氮磷鉀等物質(zhì)積累，減輕干旱脅迫對(duì)羊草幼苗造成的傷害，這與ALA調(diào)控植株?duì)I養(yǎng)代謝相關(guān)酶活性、內(nèi)源激素含量及其比值等生理效應(yīng)密切相關(guān)，也與ALA在分子水平影響相關(guān)代謝的基因表達(dá)有直接聯(lián)系。相關(guān)機(jī)理值得進(jìn)一步研究。