李 紅， 李 波， 楊 曌， 徐婉玉

(1.黑龍江省畜牧研究所，黑龍江 齊齊哈爾 161005； 2.齊齊哈爾大學(xué)生命科學(xué)與農(nóng)林學(xué)院，黑龍江 齊齊哈爾 161006)

誘變育種是人為地利用物理、化學(xué)因素誘發(fā)作物產(chǎn)生遺傳性變異，依據(jù)育種目標(biāo)，經(jīng)過人工選擇、鑒定、選育新品種，獲得有價(jià)值新類型的一種育種方法，現(xiàn)已成為常規(guī)育種與現(xiàn)代技術(shù)有機(jī)結(jié)合的現(xiàn)代育種技術(shù)。在牧草育種上常用的電離輻射和非電離輻射，由于各種射線電離密度和生物效應(yīng)不同，所引起的突變率有所差異，其中最常用的為γ射線和X射線[1]。60Co-γ射線輻照是最為有效的人工誘變育種方法之一，已經(jīng)在農(nóng)作物育種中得到廣泛應(yīng)用。在牧草方面，輻射誘變育種工作起步較晚，研究尚少。

紫花苜蓿(Medicagosativa)是世界上栽培利用最廣泛的優(yōu)良豆科牧草, 具有營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高、適口性好等特點(diǎn), 在世界各地的畜牧業(yè)中發(fā)揮著非常重要的作用。同時(shí)，紫花苜蓿對(duì)改善鹽堿化土壤理化性質(zhì),恢復(fù)退化草地植被,牧草質(zhì)量和產(chǎn)量的提高等,均有著重要作用[2]。但目前利用60Co-γ射線輻照人工誘變育種紫花苜蓿的研究相對(duì)較少。本研究探討不同60Co-γ射線輻照劑量對(duì)紫花苜蓿種子的幼苗生長(zhǎng)狀況、葉片和根抗氧化酶活性代謝的影響，為紫花苜蓿的人工誘變育種提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料及輻射處理

以黑龍江畜牧研究所提供龍牧806苜蓿干種子為材料。60Co-γ輻射源由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院原子能利用研究所提供，輻射劑量依次為600 Gy，900 Gy，1 200 Gy，1 500 Gy，1 800 Gy六個(gè)劑量，劑量率15 Gy·min-1，每份處理50 g種子，以同一批次相同數(shù)量未經(jīng)處理的種子作為對(duì)照(CK)。

1.2 方法

1.2.1幼苗的培養(yǎng) 取5種劑量的60Co-γ(600，900，1 200，1 500和1 800 Gy)射線輻射處理和未輻射的苜蓿種子，采用土培的方法將其種植在營(yíng)養(yǎng)缽中(針葉土、營(yíng)養(yǎng)土和珍珠巖按1∶2∶0.5比例進(jìn)行混合)，定期澆水，待幼苗長(zhǎng)至三葉一心期后，將苜蓿幼苗取出備用。

1.2.2形態(tài)指標(biāo)測(cè)定 出苗率和成苗率：每個(gè)處理播種5個(gè)花盆，每盆播種15粒種子(輻射和未輻射種子)待15 d后統(tǒng)計(jì)每盆中種子的出苗數(shù)，待實(shí)生苗長(zhǎng)出5～6 片真葉(約30 d左右)后，統(tǒng)計(jì)幼苗數(shù)，計(jì)算種子幼苗的成苗率。

出苗率=(出苗數(shù)/播種種子總數(shù))×100%

成苗率=(成苗數(shù)/播種種子總數(shù))×100%

幼苗鮮重、干重和含水量：對(duì)培養(yǎng)至45 d幼苗，小心取出幼苗，用水沖洗凈根部的泥土，濾紙吸干其水分，每個(gè)輻射劑量和對(duì)照隨機(jī)選取10株幼苗，用電子天平稱取幼苗的鮮重即為幼苗的鮮重，自然風(fēng)干后測(cè)定其干重即為幼苗的干重，并計(jì)算其含水量。

幼苗長(zhǎng)度：隨機(jī)選取培養(yǎng)45 d每個(gè)輻射劑量和對(duì)照10株具代表性的苜蓿幼苗，利用米尺分別測(cè)量地上莖長(zhǎng)度、主根長(zhǎng)度和幼苗總長(zhǎng)度，計(jì)算其平均值。

1.2.3抗氧化酶活性測(cè)定 對(duì)不同60Co-γ射線輻射劑量苜蓿種子的幼苗葉片和根進(jìn)行過氧化物酶(peroxidase，POD)和過氧化氫酶(catalase，CAT)活性的測(cè)定，過氧化物酶活性采用愈創(chuàng)木酚比色法，過氧化氫酶活性采用紫外吸收法，重復(fù)三次。

1.3 數(shù)據(jù)分析

用Excel軟件進(jìn)行作圖，用SPSS 17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及相關(guān)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同劑量60Co-γ射線輻射對(duì)幼苗生長(zhǎng)的影響

2.1.1種子出苗率和成苗率的影響60Co-γ輻射處理后苜蓿干種子的出苗率和成苗率的變化見圖1，經(jīng)過60Co-γ輻射處理后，苜蓿干種子的出苗率和成苗率呈現(xiàn)先上升后下降的變化趨勢(shì)。輻射后種子的出苗率在低劑量(600 Gy)促進(jìn)其出苗，出苗率最高為77.33%，比對(duì)照組增加6.42%，1 800 Gy高輻射劑量種子的出苗率最低，為48.67%。經(jīng)過輻射后600 Gy輻射劑量以上種子的出苗率均小于對(duì)照組。輻射劑量為900、1 200、1 500和1 800 Gy種子的出苗率分別比對(duì)照組降低了15.60%、21.01%、28.44%和33.03%。低劑量600 Gy對(duì)成苗率影響不大，900 Gy以上輻射劑量對(duì)出苗率影響極大，與對(duì)照比較差異達(dá)到了極顯著的水平(P<0.01)，而1 200～1 800 Gy輻射劑量間比較差異不顯著。

輻射后種子的成苗率在低劑量(600 Gy)促進(jìn)其成苗率最高為77.33%，比對(duì)照組增加了6.42%，1 800 Gy高輻射劑量種子的幼苗不能成苗。經(jīng)過輻射后600 Gy輻射劑量以上種子的出苗率均小于對(duì)照組。輻射劑量在900、1 200、1 500和1 800 Gy種子的成苗率分別比對(duì)照組降低了12.13%、37.47%、51.89和100%，900 Gy輻射劑量以上與對(duì)照比較差異極顯著(P<0.01)，說明600 Gy低劑量輻射對(duì)苜蓿干種子的成苗率的影響不大，而高劑量輻射對(duì)苜蓿干種子的成苗率的影響比較大，甚至導(dǎo)致種子出苗后死亡。

圖1 60Co-γ輻射苜蓿種子的出苗率和成苗率的變化Fig.1 The changes of germination rate and survival rate of alfalfa seeds by 60Co-γ radiation.注：不同字母代表同一列不同劑量輻射間比較，小寫字母代表0.05水平，大寫字母代表0.01水平，下同Note: Different letters in the same column represent the comparison of different dose of radiation , lowercase letters indicate the difference at the level of 0.05, and capital letters indicate the difference at the level of 0.01. The same as below

2.1.2幼苗鮮重、干重和含水量的影響60Co-γ輻射處理后苜蓿種子的幼苗的鮮重、干重和含水量的影響見圖2，隨著輻射劑量的增加，各處理組的幼苗的鮮重、干重和含水量均呈現(xiàn)下降的變化趨勢(shì)。

輻射劑量越高幼苗的鮮重、干重和含水量越低，在5組輻射處理組中，輻射劑量為600 Gy的幼苗的鮮重量、干重和含水量最大，分別為14.92 g，3.74 g和13.00 g，1500 Gy輻射劑量的幼苗的鮮重、干重和含水量最小，分別為6.64 g，1.16 g和5.49 g。在600、900、1200和1500 Gy輻射劑量下，幼苗的鮮重分別比對(duì)照降低10.87%、33.71%、53.60%和60.32%，干重分別比對(duì)照降低19.07%、34.14%、65.21%和69.07%，含水量分別比對(duì)照降低8.51%、33.59%、50.18%和57.80%。輻射處理后苜蓿種子的幼苗的鮮重、干重和含水量與對(duì)照比較差異極顯著(P<0.01)，說明輻射處理對(duì)其幼苗的鮮重、干重和含水量影響極大(P<0.01)。

圖2 60Co-γ射線輻射苜蓿種子的幼苗鮮重、干重和含水量的變化Fig.2 The change of fresh weight, dry weight and moisture content of seedling of alfalfa by 60Co-γ radiation

2.1.3幼苗長(zhǎng)度的影響 苜蓿種子經(jīng)60Co-γ輻射不同劑量處理后，其幼苗的總長(zhǎng)度、地上莖長(zhǎng)度和主根長(zhǎng)度的影響見圖3，隨著輻射劑量的增加，各處理組的幼苗總長(zhǎng)度、地上莖長(zhǎng)度均呈現(xiàn)先增加后降低的變化趨勢(shì)，主根長(zhǎng)度出現(xiàn)降低的變化趨勢(shì)。幼苗的生長(zhǎng)對(duì)輻射反應(yīng)比較敏感，主要通過幼苗的地上莖長(zhǎng)度和地下主根長(zhǎng)度指標(biāo)的變化反應(yīng)出來，經(jīng)60Co-γ射線輻射處理后種子的生長(zhǎng)幼苗，表現(xiàn)為低劑量輻射促進(jìn)地上莖的生長(zhǎng)，高輻射劑量抑制其地上莖和地下主根部分的生長(zhǎng)，且隨著誘變劑量的增高，地下主根逐漸變得短粗。

幼苗的地下主根長(zhǎng)度表現(xiàn)為隨著輻射劑量的增加抑制作用增加，1 500 Gy輻射劑量下主根長(zhǎng)度僅為2.20 cm，在600、900、1 200和1 500 Gy輻射劑量下，幼苗的主根長(zhǎng)度分別比對(duì)照降低21.93%、38.26%、60.19%和65.79%，1 200和1 500 Gy輻射劑量下對(duì)主根的長(zhǎng)度抑制作用比較強(qiáng)，輻射與對(duì)照比較差異極顯著(P<0.01)，低劑量與高劑量比較差異顯著(P<0.05)。

幼苗的地上莖長(zhǎng)度的影響表現(xiàn)為隨著輻射劑量的增加抑制作用增加，600和900 Gy低劑量輻射促進(jìn)苜蓿幼苗地上莖的生長(zhǎng)，分別比對(duì)照增加25.13%和15.41%，1 200和1 500 Gy中度劑量輻射劑量抑制苜蓿幼苗地上莖的生長(zhǎng)，分別比對(duì)照降低19.14%和29.84%，說明1 200 Gy輻射劑量以上抑制苜蓿幼苗的地上莖生長(zhǎng)，與對(duì)照和低輻射劑量比較差異極顯著(P<0.01)。

隨著輻射劑量增加幼苗總長(zhǎng)度降低，輻射劑量為600 Gy的幼苗總長(zhǎng)度最高為33.21 cm，比對(duì)照增加了25.13%，1 500 Gy輻射劑量的幼苗總長(zhǎng)度最低為16.31 cm。在600和900低劑量輻射下，幼苗的總長(zhǎng)度分別比對(duì)照增加了25.13%和15.41%，1 200和1 500 Gy中度劑量輻射處理幼苗總長(zhǎng)度與對(duì)照比較差異極顯著(P<0.01)，低劑量輻射與高劑量之間對(duì)幼苗總長(zhǎng)度產(chǎn)生極顯著差異(P<0.01)。輻射對(duì)苜蓿幼苗主根的影響最大，進(jìn)而影響苜蓿幼苗的總長(zhǎng)度。

圖3 60Co-γ射線輻射苜蓿種子的幼苗長(zhǎng)度和主根長(zhǎng)度的變化Fig.3 The changes of seedling length and root length of alfalfa seeds by 60Co-γ radiation

2.2 不同劑量60Co-γ射線輻射對(duì)苜蓿葉片兩種酶活性的影響

2.2.1過氧化物酶活性的影響 不同劑量60Co-γ 射線輻射下的苜蓿種子，其幼苗葉片和根POD活性的變化見圖4，苜蓿葉片和根的POD活性隨著輻射劑量的增加呈現(xiàn)先上升后下降的變化趨勢(shì)，輻射處理增加苜蓿葉片和根POD的積累，輻射劑量900 Gy時(shí)苜蓿葉片和根POD活性達(dá)到最大值，分別為3 343.75 U·g-1Fw·min-1和3 060.42 U·g-1Fw·min-1。在600、900、1 200和1 500 Gy60Co-γ輻照劑量的葉片POD活性分別比對(duì)照組增加39.00%、53.08%、40.44%和37.58%，根POD活性分別比對(duì)照組增加7.78%、58.81%、52.76%、27.85%。苜蓿幼苗葉片和根POD活性方差分析顯示，除600 Gy外，其它輻射組與對(duì)照組比較差異極顯著(P<0.01)，60Co-γ輻射對(duì)苜蓿葉片和根部過氧化物酶的積累產(chǎn)生顯著的影響。

圖4 60Co-γ輻射苜蓿種子的幼苗的葉片和根過氧化物酶活性的變化Fig.4 Changes of peroxidase activity in leaves and roots of seedling of alfalfa under 60Co-γ radiation

2.2.2過氧化氫酶活性的影響 在不同劑量60Co-γ射線輻射下的苜蓿種子，其幼苗葉片和根的CAT活性的變化見圖4，苜蓿葉片和根的CAT活性隨著輻射劑量的增加呈先上升后下降的趨勢(shì)，輻射劑量900 Gy時(shí)苜蓿葉片和根CAT活性達(dá)到最大值，分別為382.22 U·g-1Fw·min-1和203.33 U·g-1Fw·min-1。在600、900、1 200和1 500 Gy60Co-γ 輻照劑量的葉片CAT活性分別比對(duì)照組增加19.13%、174.11%、67.74%和0.20%，根CAT活性分別比對(duì)照組增加13.58%、54.18%、20.22%和17.53%。苜蓿葉片CAT活性的方差分析顯示，900和1 200 Gy輻射組與對(duì)照組和其他輻射組比較差異達(dá)到極顯著水平(P<0.01)；苜蓿根CAT活性的方差分析顯示，900 Gy輻射組與對(duì)照組和其他輻射組比較差異達(dá)到極顯著水平(P<0.01)，一定的輻射劑量可以提高苜蓿葉片和根的CAT酶活性。

圖4 60Co-γ輻射苜蓿種子的幼苗的葉片和根過氧化氫酶活性的變化Fig.4 Changes of catalase activity in leaves and roots of seedling of alfalfa under 60Co-γ radiation

3 討論

60Co-γ射線可對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育產(chǎn)生一定的抑制或促進(jìn)作用，不同輻照劑量對(duì)不同植物的影響不同[3]。幼苗的生長(zhǎng)發(fā)育上的變化是輻射誘變效應(yīng)的重要參考指標(biāo)，直接反映在M1代植株的存活率與生長(zhǎng)對(duì)輻射的敏感性上。試驗(yàn)通過測(cè)定不同劑量60Co-γ輻射下，苜蓿干種子幼苗的出苗率、成苗率、鮮重、干重、主根長(zhǎng)、苗長(zhǎng)等指標(biāo)變化，綜合分析不同劑量的60Co-γ射線對(duì)植株生長(zhǎng)發(fā)育的影響。苜蓿幼苗的出苗率、成苗率、幼苗的長(zhǎng)度和地上莖長(zhǎng)度均呈先上升后下降的趨勢(shì)，主根長(zhǎng)度、鮮重和干重呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)，且隨著誘變劑量的增高，根逐漸變得短粗。由于高劑量的苜蓿干種子出苗后真葉未能長(zhǎng)出，植株未能正常生長(zhǎng)而死亡，這可能是因?yàn)榉N子經(jīng)60Co-γ射線輻射后，能量在種子中沉積，導(dǎo)致種子受到不同程度的損傷，使胚中分生組織的分裂過程受到抑制，但對(duì)生長(zhǎng)過程影響不大，所以種子能正常發(fā)芽，但在生長(zhǎng)過程中會(huì)逐漸顯現(xiàn)，最后導(dǎo)致幼苗死亡。試驗(yàn)中高輻射劑量1 800 Gy下的種子雖然出苗率達(dá)到49%，但是成苗率為0，與耿興敏[4]研究60Co-γ輻射對(duì)桂花種子幼苗生長(zhǎng)的影響，高劑量種子的幼苗的成苗率為0的結(jié)果一致。幼苗的長(zhǎng)度在低劑量輻射下可以促進(jìn)幼苗的生長(zhǎng)，800～1 500 Gy高劑量的輻射抑制幼苗的生長(zhǎng)，與袁蒲英[5]研究60Co-γ射線輻射對(duì)蠟梅種子幼苗生長(zhǎng)的影響和林仙淋[6]研究60Co-γ輻射對(duì)多花野牡丹幼苗生長(zhǎng)發(fā)育的影響結(jié)果一致。60Co-γ輻射不同劑量處理苜蓿種子的幼苗的鮮質(zhì)量和干質(zhì)量均呈下降的趨勢(shì)，即輻射劑量越高幼苗的鮮質(zhì)量和干質(zhì)量越低，與李勝洪[7]研究60Co-γ輻射處理對(duì)紫花苜蓿部分生長(zhǎng)的影響研究結(jié)果一致。

植物為適應(yīng)輻照過后帶來的損害，而產(chǎn)生適應(yīng)機(jī)制使植物免受逆境的傷害，也即是植物體內(nèi)存在的抗氧化酶系統(tǒng)包括過氧化物酶(POD)、過氧化氫酶(CAT)等緩解因逆境帶來的傷害[8]。不同的酶對(duì)輻照誘導(dǎo)存在各自不同的調(diào)節(jié)機(jī)制。本研究在供試劑量范圍內(nèi)，所檢測(cè)的2種酶活性表達(dá)水平較對(duì)照整體呈先上升后下降趨勢(shì)，但各種酶活性的變化情況又不完全相同。POD是細(xì)胞的呼吸代謝過程中一個(gè)重要的末端氧化酶，參與清除植物體內(nèi)的 H2O2。隨著輻射劑量的增加，苜蓿的葉片和主根部分的過氧化物酶活性均呈先上升后下降的趨勢(shì)，均在輻射劑量為900 Gy時(shí)達(dá)到最大值，苜蓿的葉片與主根相比較，其葉片POD的酶活性積累大于主根。CAT酶是生物體內(nèi)的主要抗氧化酶，它能促進(jìn)細(xì)胞中過氧化氫的分解，減輕過氧化氫對(duì)細(xì)胞的損害。輻照后的苜蓿的葉片和主根中 CAT活性隨劑量加大表現(xiàn)出先升高后降低的變化趨勢(shì)，900 Gy時(shí)存在峰值，這與王月華[9]利用5種不同劑量的60Co-γ射線輻射處理草地早熟禾，對(duì)其體內(nèi)酶活性的影響表現(xiàn)為先升高后降低的趨勢(shì)一致。也和張玉[10]研究不同劑量60Co-γ射線輻射處理菊苣，其酶活性表現(xiàn)為隨著輻射劑量的升高表現(xiàn)出先升高后降低趨勢(shì)的結(jié)果一致。苜蓿葉片和主根比較，其葉片的CAT活性高于主根。CAT活性比POD活性的波動(dòng)大，在消除過量的 H2O2方面起著主要的作用。不同輻射劑量對(duì)苜蓿產(chǎn)生的誘變效應(yīng)不一致，其中的機(jī)制較為復(fù)雜，有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

經(jīng)過600，900，1 200，1 500和1 800 Gy輻射劑量處理的苜蓿種子，在種子的出苗率、成苗率、幼苗長(zhǎng)度和地上莖長(zhǎng)度均隨著輻射劑量的增加呈下降的趨勢(shì)，幼苗的主根長(zhǎng)度、鮮重、干重和含水量均隨著輻射劑量的增加呈下降的趨勢(shì)；幼苗的葉片和根的POD、CAT活性均隨隨著輻射劑量的增加呈先上升后下降的趨勢(shì)。60Co-γ射線輻射不同劑量對(duì)苜蓿幼苗生長(zhǎng)表現(xiàn)為低劑量影響比較小，高劑量對(duì)幼苗的生長(zhǎng)抑制作用比較大，對(duì)POD、CAT兩種抗氧化酶活性積累產(chǎn)生不同的影響。