蔡宏宇，葛東穎，馬磊，張振東，葉萬(wàn)海，余海忠，郭壯，趙慧君，*

（1.湖北文理學(xué)院食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院鄂西北傳統(tǒng)發(fā)酵食品研究所，湖北襄陽(yáng)441053；2.棗陽(yáng)食品藥品監(jiān)督管理局，湖北棗陽(yáng)441200）

酸漿面為湖北省棗陽(yáng)市的獨(dú)特面食，發(fā)源于清朝，距今已有100多年的歷史，2013年被列入湖北省第四批非物質(zhì)文化遺產(chǎn)名錄。棗陽(yáng)酸漿面的最佳食用時(shí)間為每年的4月至10月，在這段時(shí)間溫度適宜乳酸菌生長(zhǎng)，采用白菜和芹菜制作的酸漿經(jīng)過一天的發(fā)酵，晚上食用酸度剛好。乳酸菌是（Lactic acid bacteria，LAB）一種習(xí)慣上的稱呼，是一種發(fā)酵糖類主要產(chǎn)物為乳酸的一類無(wú)芽孢、革蘭氏染色陽(yáng)性細(xì)菌的總稱[1]。乳酸菌分布廣泛，物種多樣性非常豐富，紅酒[2]、白酒[3]、發(fā)酵蔬菜[4-6]、乳品[7-8]等發(fā)酵食品中均蘊(yùn)藏著豐富的乳酸菌資源。

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-變性梯度凝膠電泳（polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis，PCR-DGGE）技術(shù)廣泛地運(yùn)用到研究微生物生態(tài)，在發(fā)酵食品中也有非常廣泛地應(yīng)用。意大利葡萄酒中植物乳桿菌和酒球菌的多樣性[9]、印度尼西亞單貝浸泡過程中微生物的群落結(jié)構(gòu)和多態(tài)性[10]、丹魄酒蘋果酸發(fā)酵時(shí)期細(xì)菌的生物多樣性和動(dòng)態(tài)變化[11]、不同來(lái)源的郫縣豆瓣醬中真菌多樣性[12]、漿水中細(xì)菌多樣性[4]等均采用了PCR-DGE的方法進(jìn)行了分析。

為了發(fā)掘棗陽(yáng)酸漿水中蘊(yùn)含的乳酸菌資源，研究棗陽(yáng)酸漿水乳酸菌的多樣性，從棗陽(yáng)市琚灣鎮(zhèn)不同酸漿面館采集酸漿水，采用了PCR-DGGE方法對(duì)酸漿水中細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)和多樣性進(jìn)行了研究，同時(shí)利用純培養(yǎng)的方法分離純化酸漿水中的乳酸菌。通過本研究不僅可以了解棗陽(yáng)酸漿水中細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)和多樣性，也為后續(xù)開發(fā)菌種制劑和棗陽(yáng)酸漿面的生產(chǎn)工業(yè)化、標(biāo)準(zhǔn)化奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)試劑

聚丙烯酰胺、N，N-亞甲基二丙烯酰胺：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；D5625-01 DNA提取試劑盒（OMEGA）、DNA marker（FERMENTAS）、PCR清潔試劑盒（AXYGEN）：北京科博匯智生物科技發(fā)展有限公司；2×PCR mix：南京諾唯贊生物科技有限公司；rTaq、dNTP，pMD18-T vector：大連寶生物技術(shù)有限公司（TaKaRa）；PCR引物合成和測(cè)序由武漢天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司完成。

1.2 儀器與設(shè)備

CT15RE冷凍離心機(jī)：日本HITACHI公司；VeritiTM96-well thermal cyclerPCR 儀、NanoDrop 2000/2000c：美國(guó)Thermo Fisher公司；DCodeTMSystem：美國(guó)Bio Red公司；水平電泳儀：北京六一儀器廠；FluorChem FC3：美國(guó)protein simple公司；Bio-5000 plus掃描儀：上海中晶科技有限公司；Whitley DG250厭氧工作站：英國(guó)DWS公司。

1.3 試驗(yàn)樣品

本試驗(yàn)所用材料采集于湖北省棗陽(yáng)市琚灣鎮(zhèn)酸漿面館。分別在10個(gè)獨(dú)立制作酸漿的酸漿面館采集未煮沸的酸漿水，采集后低溫保存，帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 宏基因組DNA的提取與檢測(cè)

采用omega D5625-01試劑盒提取10個(gè)酸漿水樣品中的宏基因組DNA，提取后用0.8%瓊脂糖凝膠進(jìn)行檢測(cè)并用NanoDrop測(cè)定DNA的濃度。

1.4.2 PCR擴(kuò)增細(xì)菌和乳桿菌16S rDNA基因片段

將提取的宏基因組DNA濃度調(diào)整一致后作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。細(xì)菌16S rDNA基因片段PCR擴(kuò)增所用的引物為：正向引物為ALL-GC-V3F（5’-CGC CCG GGG CGC GCC CCG GGC GGC CCG GGG GCA CCG GGG GCC TAC GGG AGG CAG CAG-3’），反向引物為 ALL-V3R（5’-ATT ACC GCG GCT GCT GG-3’）；乳桿菌16S rDNA基因片段PCR擴(kuò)增所用的引物為：正向引物為L(zhǎng)acF-GC（5’-CGC CCG GGG CGC GCC CCG GGC GGC CCG GGG GCA CCG GGG GCT CCT ACG GGA GGC AGC AGT-3’），反向引物為 LacR（5’-GTA TTA CCG CGG CTG CTG GCA C-3’）[13]。PCR 擴(kuò)增體系為2.5 μL 10×PCR Buffer（含Mg2+），2 μL dNTP（2.5 mol/L），0.5 μL 正向引物 （10 mmol/L），0.5 μL 負(fù)向引物（10 mmol/L），0.5 μL rTaq（5 U/μL），1 μL DNA 模板，18μL無(wú)菌水。PCR反應(yīng)條件：95℃4 min預(yù)變性，95℃30 s，55 ℃（或 58 ℃）30 s，72 ℃ 30 s，30 個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸10 min。PCR擴(kuò)增結(jié)束后，取擴(kuò)增產(chǎn)物5 μL用2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.4.3 DGGE及數(shù)據(jù)分析

細(xì)菌和乳桿菌DGGE均采用變性劑線性梯度為35%～60%，濃度為8%的聚丙烯酰胺濃度（40%丙烯酰胺/N，N-亞甲基二丙烯酰胺）凝膠進(jìn)行電泳，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物上樣量為10μL。電泳時(shí)，溫度為60℃，先120V，78 min；后80 V，13 h。電泳結(jié)束對(duì)聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行銀染[14]，用掃描儀采集凝膠電泳圖片，并用Quantity One軟件分析圖片。

1.4.4 DGGE膠上優(yōu)勢(shì)條帶的測(cè)序、比對(duì)及進(jìn)化樹構(gòu)建

將細(xì)菌DGGE膠上的優(yōu)勢(shì)條帶進(jìn)行用不含GC夾子的引物進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增程序同上。與T-載體連接后轉(zhuǎn)化到大腸桿菌TOP10中，鑒定陽(yáng)性克隆并送往武漢天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果除去兩端載體的序列，然后利用NCBI Blast從GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中提取相似度比較高的相似的序列，用MEGA 4.0軟件制作系統(tǒng)發(fā)育樹，采Neighbor-joining（鄰位相連法）制作系統(tǒng)進(jìn)化樹[15]，利用Bootstrap（自展法）檢測(cè)制作的系統(tǒng)樹[16]，自展數(shù)據(jù)集為1 000次。

1.4.5 棗陽(yáng)酸漿水中乳酸菌的分離與純化

用滅菌槍頭吸取0.5 mL酸漿水樣品于4.5 mL的生理鹽水（質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.85%）中，充分混勻，以10倍稀釋法對(duì)其進(jìn)行梯度稀釋后，吸取100 μL稀釋度為10-5、10-6、10-7的稀釋液涂布與含有1.5%的CaCO3固體MRS培養(yǎng)基上并置于厭氧工作站37℃培養(yǎng)48 h。挑取有透明圈的菌落進(jìn)行革蘭氏染色，染色結(jié)果為陽(yáng)性的在MRS固體培養(yǎng)基上劃線純化兩次，鏡檢為單一菌落的保存在-80℃冰箱待用。

1.4.6 棗陽(yáng)酸漿水中乳酸菌的鑒定

溴化十六烷三甲基銨（cetyltrimethyl ammonium bromide，CTAB）法提取疑似乳酸菌DNA并用0.8%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，采用通用引物27f（5’-A GA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3’）和 1495r（5’-CTA CGG CTA CCT TGT TAC GA-3’）對(duì)乳酸菌16S rDNA基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增體系為2.5 μL 10×PCR Buffer（含 Mg2+），2 μL dNTP （2.5 mol/L），0.5 μL 27f（10 mmol/L），0.5μL 1495r（10 mmol/L），0.5 μL rTaq（5 U/μL），1 μL DNA 模板，18 μL 無(wú)菌水。PCR 反應(yīng)條件：95℃ 4 min預(yù)變性，95℃1 min，55℃ 1 min，72℃1 min 30 s，30個(gè)循環(huán)，72℃延伸10 min。PCR擴(kuò)增結(jié)束后，取擴(kuò)增產(chǎn)物5 μL用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。對(duì)于符合大小的擴(kuò)增產(chǎn)物，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行清潔，并連接pMD-18T載體轉(zhuǎn)化到大腸桿菌TOP10中，鑒定陽(yáng)性克隆并送往武漢天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司測(cè)序。

1.4.7 棗陽(yáng)酸漿水中乳酸菌的進(jìn)化分析

棗陽(yáng)酸漿水中乳酸菌的進(jìn)化分析方法同1.4.4進(jìn)化樹構(gòu)建方法。

2 結(jié)果與分析

2.1 酸漿水中細(xì)菌和乳桿菌16S rRNA V3區(qū)域擴(kuò)增產(chǎn)物DGGE圖譜分析

棗陽(yáng)酸漿水中的DNA提取成功后，進(jìn)行細(xì)菌和乳桿菌16S rRNA V3區(qū)域擴(kuò)增，擴(kuò)增片段大小200 bp左右，且無(wú)非特異性擴(kuò)增，可以用于DGGE分析。10個(gè)棗陽(yáng)酸漿水樣品的細(xì)菌和乳桿菌DGGE結(jié)果如圖1所示。

圖1 棗陽(yáng)酸漿水細(xì)菌DGGE圖譜和乳桿菌DGGE圖譜Fig.1 DGGE analysis of bacteria and lactobacillus in Zaoyang suanjiangshui

DGGE圖譜中條帶的數(shù)量反映樣品中微生物的多樣性，條帶的亮度在一定程度上能反映菌種數(shù)量的多少。從圖1中可以看出，細(xì)菌（A）與乳桿菌（B）DGGE圖譜的差異就在于細(xì)菌DGGE圖譜的最下面有標(biāo)號(hào)6、7兩個(gè)條帶，其余部分基本相同，且兩個(gè)DGGE膠變性劑梯度相同，因此推斷細(xì)菌DGGE除6、7條帶外其余條帶與乳桿菌DGGE基本相同。

2.2 棗陽(yáng)酸漿水中細(xì)菌DGGE圖譜聚類分析

棗陽(yáng)酸漿水中的細(xì)菌聚類分析見圖2。

圖2 棗陽(yáng)酸漿水中的細(xì)菌聚類分析Fig.2 The cluster analysis of bacteria in Zaoyang suanjiangshui

由圖2可知，初步將10個(gè)酸漿水樣品分為了三類，第一類（5#），第二類（1#，2#，8#），第三類（3#，4#，6#，7#，9#，10#），這與圖1的直觀反映是一致的。反映在DGGE圖譜中就是在這些酸漿水中既存在一些共有的細(xì)菌，又存在一些特有的細(xì)菌種群。由于棗陽(yáng)酸漿的制作是以家庭為單位進(jìn)行的，所以酸漿水中的細(xì)菌種類不但與制作酸漿的材料有關(guān)，也與酸漿水續(xù)用次數(shù)和家庭環(huán)境相關(guān)，造成了DGGE圖譜上細(xì)菌種群豐度存在著一定的差異。

2.3 棗陽(yáng)酸漿水中細(xì)菌DGGE條帶測(cè)序及系統(tǒng)發(fā)育分析

對(duì)棗陽(yáng)酸漿水樣品DGGE圖譜上的代表性亮帶進(jìn)行切膠、擴(kuò)增、克隆和測(cè)序，與NCBI上的模式菌株進(jìn)行比對(duì)（表1）并構(gòu)建進(jìn)化樹（圖3）。

表1 棗陽(yáng)酸漿水中細(xì)菌DGGE條帶比對(duì)結(jié)果Table 1 Blast results of DGGE in Zaoyang suanjiangshui

圖3 棗陽(yáng)酸漿水中細(xì)菌系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree of bacteria in Zaoyang suanjiangshui

由圖3可知，測(cè)序結(jié)果分為了3個(gè)類別，類別I聚集了大多數(shù)序列，主要為L(zhǎng)actobacillus amylolyticus和Lactobacillus delbrueckii，包含條帶 1、2、4、5、7、8 和12。類別II為L(zhǎng)actobacillus fermentum和Lactobacillus panis，包含條帶 3、6、9、10 和 11。類別 III為 Lactobacillus acidipiscis，只有條帶13。從系統(tǒng)發(fā)育來(lái)看，乳桿菌占據(jù)了大部分比例，且具有一定的多樣性。

2.4 棗陽(yáng)酸漿水中分離乳酸菌的比對(duì)結(jié)果

利用含有1.5%CaCO3的MRS培養(yǎng)基分離棗陽(yáng)酸漿水中的乳酸菌，挑選有透明圈、革蘭氏染色為陽(yáng)性的菌株進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定，最終從棗陽(yáng)酸漿水中分離出15株乳酸菌，均為乳桿菌。測(cè)序結(jié)果在NCBI上進(jìn)行比對(duì)（結(jié)果見表2），其中10株為L(zhǎng)actobacillus fermentum，3株為 Lactobacillus plantarum，一株為 Lactobacillus agilis，一株為 Lactobacillus delbrueckii。這與PCR-DGGE的結(jié)果是相同的，Lactobacillus fermentum在酸漿水中為優(yōu)勢(shì)菌屬。

表2 棗陽(yáng)酸漿水中16S rDNA基因序列的分析結(jié)果Table 2 Results from 16S rDNA sequences analysis of Zaoyang suanjiangshui

對(duì)棗陽(yáng)漿水中的乳酸菌進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析，結(jié)果見圖4。

圖4 基于16SrDNA基因序列構(gòu)建棗陽(yáng)酸漿水中乳酸菌系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic tree based on 16S rDNA region gene sequences of lactobacillus in Zaoyang suanjiangshui

從圖中看以看出，編號(hào)為 1、3、4、6、7、8、10、13、14和15的歸為一類，均為L(zhǎng)actobacillus fermentum；編號(hào)為5和9為歸為L(zhǎng)actobacillus plantarum；編號(hào)為2的歸為L(zhǎng)actobacillus agilis；編號(hào)為11的歸為L(zhǎng)actobacillus delbrueckii。

3 結(jié)論

以細(xì)菌16S rDNA基因序列為靶點(diǎn)基于PCRDGGE技術(shù)對(duì)棗陽(yáng)酸漿水中細(xì)菌多樣性進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)在酸漿水中絕大多數(shù)細(xì)菌為乳酸菌，但是不同地點(diǎn)采集的酸漿水細(xì)菌的多樣性并不一致。對(duì)DGGE中的典型條帶進(jìn)行測(cè)序分析，13個(gè)典型條帶的測(cè)序結(jié)果歸為5個(gè)菌屬，分別為L(zhǎng)actobacillus amylolyticus、Lactobacillusdelbrueckii、Lactobacillusfermentum、Lactobacillus panis和 Lactobacillus acidipiscis，其中 Lactobacillus fermentum在所有樣品中均存在且為最具優(yōu)勢(shì)的乳酸菌。利用純培養(yǎng)的方法從棗陽(yáng)酸漿水中分離出15株乳酸菌，測(cè)序后發(fā)現(xiàn)均為乳桿菌，其中10株為L(zhǎng)actobacillus fermentum，這與PCR-DGGE的結(jié)果是一致的。因此推斷，棗陽(yáng)酸漿水中乳酸菌為主要的細(xì)菌，其中乳酸菌的優(yōu)勢(shì)菌株為L(zhǎng)actobacillus fermentum。