， *， ， ，

(1. 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院， 湖南 長沙 410128； 2. 湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所， 湖北 武漢430064)

白三葉(Trifoliumrepens)是豆科三葉草屬多年生優(yōu)質(zhì)牧草，在我國引進和栽培歷史較長，是南方重要的栽培牧草[1]，適宜生長于pH值5.5～6.5土壤，酸性土壤易遭受鋁毒害的影響[2]。白三葉較羅頓豆(Lotononisbainesii)、圓葉決明(Chamaecristarotundifolia)、大翼豆(Macroptiliumatropurpureum)等南方暖季型常見豆科牧草耐酸鋁性差[2]，但不同品種之間存在差異。且白三葉耐酸鋁特性屬隱性遺傳，酸鋁敏感特性更容易通過雜交遺傳給下一代[3]。因此白三葉種質(zhì)資源的耐酸鋁性評價對于育種材料選擇尤為重要。

Voigt等[4]于1994年發(fā)明一種在瓊脂上覆蓋一層薄的酸鋁毒土進行生根的方法(Soil-on-Agar Method)用于白三葉酸鋁耐性評價，在該基質(zhì)上生根快的白三葉較生根慢的白三葉更耐酸鋁，而且該方法也可適用于其他小種子作物。國外對白三葉耐酸鋁鑒定主要采用苗期實驗室鑒定，以根系生長情況作為主要鑒定指標(biāo)[3-6]。國內(nèi)最早進行耐酸鋁鑒定的作物是大麥(Hordeumvulgare)[7]，之后大豆(Glycinemax)[8]、圭亞那柱花草(Stylosanthesguianensis)[9]、小麥(Triticumaestivum)[10]、狼尾草(Pennisetumalopecuroides)[11]、鴨茅(Dactylisglomerata)[12]、玉米(Zeamays)[13]、芝麻(Sesamumindicum)[14]、油菜(Brassicanapus)[15]等多個科屬的植物陸續(xù)進行了耐酸鋁性的篩選；但針對白三葉耐酸鋁性的報道較少。作為我國南方當(dāng)家豆科牧草，開展白三葉耐酸鋁種質(zhì)資源評價研究，對充分利用南方酸性紅壤區(qū)荒山荒地發(fā)展人工草地具有十分重要的意義。本試驗對來源于俄羅斯的57份種質(zhì)資源和9份國內(nèi)外育成品種進行萌發(fā)期酸鋁耐性綜合評價，旨在篩選耐酸鋁性強的材料，為白三葉種質(zhì)資源耐酸鋁特性研究奠定。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

66份白三葉種子材料由湖北省農(nóng)科院畜牧獸醫(yī)研究所提供，57份來源于俄羅斯，9份是國內(nèi)外育成品種(表1)。

表1 66份白三葉種質(zhì)資源基本信息Table 1 The basic information of 66 white clover resources

1.2 試驗方法

選取大小均勻一致、飽滿、無病蟲害的種子，用50%多菌靈可濕性粉劑500倍液浸泡種子20 min，蒸餾水洗凈待用。以6H2O·AlCl3配制Al3+濃度2 mmol·L-1，pH 4.5的溶液來模擬酸鋁脅迫條件，對照組(CK)為去離子水。采用發(fā)芽盒濾紙法進行發(fā)芽試驗，每處理4次重復(fù)，每重復(fù)50粒種子。每發(fā)芽盒分別加入15 ml相應(yīng)處理溶液，于人工氣候箱進行恒溫培養(yǎng)(20℃，16 h光照/ 8 h黑暗)，試驗過程中不再加入任何溶液，第10 d結(jié)束試驗。

1.3 觀測指標(biāo)

每隔24 h記錄種子發(fā)芽數(shù)(以胚根或胚芽突破種皮長于種子長度為發(fā)芽標(biāo)準(zhǔn))，并計算種子發(fā)芽勢(試驗第4 d數(shù)據(jù))、發(fā)芽率(試驗第10 d數(shù)據(jù))、發(fā)芽指數(shù)[11]和活力指數(shù)(發(fā)芽指數(shù) × 根長)。

第10 d每處理隨機選取10株幼苗，清水洗凈后用LA-S系列植物根系分析系統(tǒng)軟件(杭州萬深檢測科技有限公司)掃描分析幼苗胚根長(mm)、胚長(mm)、胚根長/苗長、胚根表面積(mm2)，胚根體積(mm3)，胚根平均直徑(mm)等性狀指標(biāo)。

1.4 數(shù)據(jù)分析

試驗數(shù)據(jù)均使用Excel 2010進行整理計算，用DPS 7.05和SPSS 22進行數(shù)據(jù)處理與分析。

為減少材料間指標(biāo)性狀固有差異，試驗各指標(biāo)值均使用相對值。指標(biāo)相對值(%)= 指標(biāo)脅迫處理值 / 指標(biāo)對照處理值 × 100。

以相關(guān)性分析和因子主成分分析方法進行耐酸鋁評價指標(biāo)篩選；用加權(quán)隸屬函數(shù)法(以變異系數(shù)賦予權(quán)重)計算綜合隸屬函數(shù)值(D值)對參試材料的耐酸鋁強弱排序；用系統(tǒng)聚類法對66份材料進行耐酸鋁性強弱聚類。

2 結(jié)果與分析

2.1 酸鋁脅迫對白三葉種子萌發(fā)與幼苗生長的影響

66份白三葉材料萌發(fā)期各項指標(biāo)統(tǒng)計數(shù)據(jù)(表2)可知：與對照組相比，酸鋁脅迫組參試材料的各項指標(biāo)均值變化除胚長和胚根平均直徑為正值外，其余變化值都為負(fù)值。白三葉的活力指數(shù)、胚根長、胚根長/苗長和胚根表面積等受抑制作用明顯，變異系數(shù)變化值均在14%以上。

表2 酸鋁脅迫下66份白三葉材料10項觀測指標(biāo)的變化情況Table 2 Variation of 10 indexes value in 66 white clover materials under acid-aluminum stress

2.2 觀測指標(biāo)相關(guān)性分析

對10項指標(biāo)相對值進行兩兩相關(guān)性分析(表3)：白三葉的萌發(fā)和根系生長兩類指標(biāo)間分別存在極顯著或顯著相關(guān)性(P<0.01或P<0.05)；其中，相對發(fā)芽勢、相對發(fā)芽率和相對發(fā)芽指數(shù)，兩兩間存在極顯著相關(guān)性(P<0.01)；相對活力指數(shù)與其它胚根指標(biāo)均存在極顯著相關(guān)性(P<0.01)。

表3 酸鋁脅迫下66份白三葉材料各指標(biāo)間相關(guān)系數(shù)Table 3 Pearson correlation coefficients of indexes in 66 materials under acid-aluminum stress

注：**表示極顯著相關(guān)性(P<0.01)，*表示顯著相關(guān)性(P<0.05)

Note: **indicates significant at the 0.01 level. *indicates significant at the 0.05 level

2.3 耐酸鋁評價指標(biāo)篩選

對10項指標(biāo)進行因子主成分分析(表4)發(fā)現(xiàn)：前三個主成分的累積貢獻率達到83.182 %，且特征值均大于1。結(jié)合因子載荷矩陣(表5)，確定第一主成分為胚根生長因子，對應(yīng)特征向量中載荷較大的5個指標(biāo)是相對活力指數(shù)、相對胚根長、相對胚根表面積、相對胚根長/苗長和相對胚根體積；第二主成分為萌發(fā)特性因子，對應(yīng)特征向量中載荷較大的3個指標(biāo)為相對發(fā)芽勢、相對發(fā)芽率和相對發(fā)芽指數(shù)；第三主成分反映植株形態(tài)特征，定名為株型因子，特征向量載荷較大的2個指標(biāo)為相對胚根平均直徑和相對苗長。

綜合指標(biāo)相關(guān)性分析和因子主成分分析結(jié)果，在第一主成分胚根生長因子中選擇與其他指標(biāo)存在極顯著相關(guān)性且特征值最大的指標(biāo)是相對活力指數(shù)，第二主成分萌發(fā)特性因子中選擇與其他根系指標(biāo)存在極顯著相關(guān)性且特征值最大的指標(biāo)是相對發(fā)芽勢，第三主成分株型因子中選擇與其他指標(biāo)極顯著相關(guān)且特征值最大的指標(biāo)是相對胚根平均直徑。以上3項指標(biāo)作為白三葉萌發(fā)期耐酸鋁性的評價指標(biāo)，用于對66份白三葉材料進行耐酸鋁性綜合隸屬函數(shù)值的計算。

表4 三個主成分的特征值以及貢獻率Table 4 Special values and contributions of 3 principal components

表5 各因子載荷矩陣Table 5 Loading matrix of each component

2.4 66份白三葉材料萌發(fā)期耐酸鋁綜合評價

因篩選出的3項評價指標(biāo)均為正向指標(biāo)，所以用正向隸屬函數(shù)公式計算各指標(biāo)的隸屬函數(shù)值。根據(jù)變異系數(shù)賦權(quán)公式計算出3項指標(biāo)的權(quán)重值，用綜合隸屬函數(shù)公式計算66份白三葉材料的耐酸鋁綜合隸屬函數(shù)值(D值)。表6中綜合隸屬函數(shù)值結(jié)果可看出：66份白三葉材料的耐酸鋁能力存在明顯差異，排在前三位的編號為66號、17號、8號的耐酸鋁綜合隸屬函數(shù)值分別為0.890、0.745、0.675，表明這些材料在66份材料中的耐酸鋁性較強；排在最后兩位隸屬函數(shù)值分別是0.128(1號)和0.106(39號)，表明這些材料耐酸鋁能力弱。

表6 66份白三葉材料耐酸鋁隸屬函數(shù)值Table 6 Subordinate function value of 66 white clover materials’ acid-aluminum tolerance

續(xù)表6

2.5 耐酸鋁性能聚類

將66份白三葉材料的耐酸鋁綜合隸屬函數(shù)值用歐氏距離平均連鎖法進行聚類分析(圖1)，在歐氏距離15處將參試材料分為3個類群：第1類群包括編號為66、17、8、14、21、57號，占所有白三葉材料的9%，該類群耐酸鋁綜合隸屬函數(shù)值高，表明耐酸鋁能力較強。第2類群包括編號為7、30、22、52號等58個種質(zhì)材料，占所有材料的88%，該類群耐酸鋁綜合隸屬函數(shù)值在66份材料中排名居中，表明這些材料的耐酸鋁能力居中。第3類群包括編號為39號和1號，占所有白三葉材料的3%，該類群的耐酸鋁綜合隸屬函數(shù)值最低，表明這兩個材料耐酸鋁性最差。由圖2可知，3類不同耐酸鋁級別的代表性材料在植株根系生長狀況差異明顯，耐酸鋁性強的材料植株胚根生長更健康，而酸鋁脅迫敏感材料則表現(xiàn)出明顯的根部損傷。

圖1 66份白三葉材料耐酸鋁性聚類Fig.1 Dendrogram on acid-aluminum tolerance of 66 white clover materials

圖2 不同耐酸鋁水平代表材料的植株形態(tài)對比Fig.2 Comparison of representative materials’ appearance with different acid-aluminum tolerance

3 討論

3.1 耐酸鋁篩選指標(biāo)的確定

隨著氮肥的大量施用、酸雨、不良耕作方式等現(xiàn)象的加劇，我國的土壤酸性問題愈加嚴(yán)重，而鋁毒害是酸性土壤的突出問題，篩選耐酸鋁毒害的作物品種是解決酸性土壤地區(qū)生產(chǎn)最為便捷的途徑[16]。鋁對植物的毒害首先表現(xiàn)在抑制植物根系的生長，進而影響?zhàn)B分和水分的吸收，因而根系生長相關(guān)的指標(biāo)往往是作物鋁毒耐性篩選時主要的評價指標(biāo)[17]。林咸永等[10]和李學(xué)文等[18]認(rèn)為相對根長或根相對伸長率是小麥或豌豆耐酸鋁性較為理想的篩選指標(biāo)。除應(yīng)用單一根系指標(biāo)外，還有些使用根系及地上部的多個指標(biāo)作為酸鋁的綜合評價指標(biāo)，如應(yīng)小芳等[8]研究發(fā)現(xiàn)大豆相對根系干重、相對地上部干重、相對株高、相對葉面積與所有農(nóng)藝、生理指標(biāo)進行的秩和比排序獲得的綜合評價系數(shù)呈極顯著相關(guān)，可作為大豆耐鋁毒基因型篩選的有效指標(biāo)。唐新蓮等[13]以根尖相對伸長率、根尖胼胝質(zhì)和鋁含量和根尖染色作為玉米耐鋁性的綜合篩選指標(biāo)；孫建等[14]以相對成苗率，相對芽長，相對根長，相對苗鮮重作為芝麻的評價指標(biāo)；褚曉晴等[19]利用相對根系干重、相對地上部分干重、相對全株干重對假儉草的雜交后代的耐酸鋁性評價。本試驗通過主成分分析和相關(guān)性分析確定相對活力指數(shù)、相對發(fā)芽勢和相對胚根平均直徑作為白三葉苗期耐酸鋁評價指標(biāo)。由此可見，不同作物對酸鋁脅迫反應(yīng)有所區(qū)別，不同品種間農(nóng)藝形狀或生理指標(biāo)的變異系數(shù)各不一致，但總體來看，根系性狀是重要的參數(shù)，本試驗中首次提出相對平均直徑作為白三葉的篩選指標(biāo)。

3.2 耐酸鋁篩選統(tǒng)計方法的選擇

植物的抗逆性是多種因素相互作用構(gòu)成的較為復(fù)雜的綜合性狀，多種因素或性狀在反映植物抗逆性本質(zhì)時存在一定的相關(guān)關(guān)系和主次關(guān)系。因此，對植物抗逆性的評價應(yīng)有系統(tǒng)科學(xué)的評價方法。模糊數(shù)學(xué)中隸屬函數(shù)法或者歐氏距離聚類分析法經(jīng)常被用于評價植物抗逆性[11，14]，它能對多項觀測指標(biāo)進行綜合評價，可有效避免單一指標(biāo)評價的片面性。但它會忽略多項觀測指標(biāo)間存在的相關(guān)關(guān)系和主次關(guān)系。在統(tǒng)計學(xué)分析中，指標(biāo)相關(guān)性分析和主成分分析能客觀地分析指標(biāo)間相關(guān)關(guān)系和主次關(guān)系；變異系數(shù)賦權(quán)法能較好地區(qū)分指標(biāo)重要性差異。因此，本研究結(jié)合以上方法，先篩選抗逆評價指標(biāo)，然后對指標(biāo)進行賦權(quán)，最后計算加權(quán)隸屬函數(shù)值對植物抗逆性進行綜合評價。這種通過多指標(biāo)、去重復(fù)、算權(quán)重的方法，既能全面反映植物抗逆性信息，又能客觀區(qū)分指標(biāo)重要性差異，是一套適用于評價植物抗逆性的科學(xué)系統(tǒng)的分析方法，可廣泛應(yīng)用于植物抗逆性鑒定和篩選的研究工作。

4 結(jié)論

酸鋁脅迫對白三葉種子萌發(fā)和幼苗生長造成不利影響，幼苗根的伸長會受到抑制，根長與苗長比值、胚根表面積、胚根體積等根系指標(biāo)受抑制作用明顯，根直徑增加，但不同材料間存在顯著差異，耐酸鋁性強的材料較不耐酸鋁材料受抑制影響小。

根據(jù)指標(biāo)相關(guān)性分析和因子主成分分析篩選出相對活力指數(shù)、相對發(fā)芽勢和相對胚根平均直徑等3項酸鋁脅迫耐性評價指標(biāo)。

耐酸鋁性較強的材料有：‘海發(fā)’， ‘ZXY06P-1927’，‘ZXY06P-1768’，’ZXY06P-1879’，‘ZXY06P-2029’，‘ZXY06P-2659’；其中‘海發(fā)’在我國南方已有較大范圍的種植區(qū)域，其余5個材料是來源于俄羅斯的種質(zhì)資源，未來可對這些材料進一步研究，為耐酸鋁白三葉遺傳育種和種植推廣提供科學(xué)支持。