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(1.山東省畜牧總站, 山東省草產(chǎn)品質量檢測中心, 山東 濟南 250022; 2. 山東晟益牧業(yè)有限公司, 山東 濟南 250121)
1963年,Van Soest提出了用中性洗滌纖維(neutral detergent fiber,NDF)和酸性洗滌纖維(acid detergent fiber,ADF)替代粗纖維(crude fiber,CF)作為評定飼草中纖維類物質的指標,以準確反映飼草中纖維的可消化利用程度[1]。我國先后頒布的豆科牧草干草(Legume hay)、苜蓿干草捆(Bale of alfalfa hay)、草顆粒(Forage pellet)、草塊(Forage cubes)和青貯玉米(Silage maize)質量分級標準均把NDF或NDF和ADF作為質量分級參數(shù),同時中國飼料原料數(shù)據(jù)庫飼料常規(guī)養(yǎng)分表也自2000年引入這兩項指標,因此NDF和ADF快速準確測定已成為判定飼草質量等級和科學配置牛羊日糧的重要前提[2-3]。
我國于2006年和2007年先后頒布了國家標準GB/T20806—2006和行業(yè)標準NY/T1459—2007,分別規(guī)范了飼料中NDF和ADF含量的測定,其操作方法均為抽濾法。但該方法操作過程控制難、耗時長,尤其是抽濾過程常常因樣品堵塞過濾眼而延長檢測時間、影響樣品清洗程度,造成檢測效率低、誤差大[4]。為了提高檢測效率和精確度,自上個世紀90年代以來,濾袋法檢測技術被逐步研究與應用[5],1993年美國ANKOM科技公司推出ANKOM纖維分析儀,實現(xiàn)了濾袋法檢測技術的全自動化操作。
影響濾袋法測定結果的兩個重要因素是樣品的粉碎細度與濾袋,兩者緊密相關。研究發(fā)現(xiàn)[6-7],樣品粉碎越細,NDF和ADF含量越低,田雨佳等[4]認為這是樣品微粒流出濾袋造成的,并建議樣品粉碎細度為9目(2.00mm),但未給出濾袋孔徑大小參數(shù)。而Vogel等[8]和薛紅楓等[9]采用ANKOM公司 F57濾袋 (孔徑為25μm)測定粉碎細度為18目(1.00mm)的試樣,其NDF與ADF含量與國標法差異不顯著。目前市場推出了更小孔徑的濾袋,如ANKOM F58濾袋(孔徑為10μm),而相應的樣品粉碎細度參數(shù)研究未見報道。另外,一些學者對不同材質的纖維濾袋[9]、尼龍布濾袋[7, 10]、聚酯布濾袋[11]等在NDF和ADF測定中的應用做出了有益的探索,但由于樣品、檢測方法的不同,結果并不一致。本試驗就粉碎細度、濾袋材質和孔徑大小對濾袋法測定飼草中NDF和ADF含量的影響進行了研究,以期為濾袋法測定飼草NDF和ADF含量提供粉碎細度參數(shù)和濾袋篩選依據(jù)。
取自山東省內草捆、草粉、草顆粒和青貯飼料4大類10種飼草為試驗樣品。
1.2.1不同粉碎細度處理 設計9目(2.00 mm)、18目(1.00 mm)和40目(0.45 mm)3個粉碎細度處理,每個處理3次重復,用ANKON F58纖維濾袋(特制無紡布、孔徑10 μm、ANKOM公司提供)測定不同粉碎細度下10種飼草NDF和ADF含量。同時,將試驗樣品裝入ANKON F58纖維濾袋,用蒸餾水浸泡,測定樣品微粒流失率、溶水率和總失重率。
1.2.2不同濾袋處理 選擇聚酯布、尼龍布和無紡布3種材質制作成濾袋,聚酯布分國產(chǎn)和進口,孔徑為400目(37 μm)、600目(23 μm)、800目(18 μm),尼龍布孔徑為400目、800目、1200目(12 μm)、1600目(10 μm),無紡布為孔徑400目普通無紡布(國產(chǎn)聚酯布、尼龍布和無紡布均由浙江中科環(huán)保濾料有限公司提供;進口聚酯布為ANKOM technology, Macedon, NY, USA生產(chǎn))、CAU濾袋[7](特制無紡布、孔徑20 μm、中國農業(yè)大學肉牛研究中心提供)和ANKON F58纖維濾袋。不同材質和孔徑濾袋共13個處理,每個處理3次重復,以ANKON F58纖維濾袋為對照,測定苜蓿干草捆樣品(過40目網(wǎng)篩)NDF和ADF含量。
1.2.3樣品制備 采集的草捆、草粉、草顆粒先用鍘草粉碎機粗粉,再用實驗室用樣品粉碎機(HK-08B,廣州市旭朗機械設備有限公司)細粉至過9目、18目和40目網(wǎng)篩,充分混合后用四分法縮分至100 g,裝袋,為試驗樣品。青貯飼料先用電熱恒溫鼓風干燥箱在65℃下烘干24 h,再按上述方法粉碎、縮分、裝袋,制成試驗樣品。
1.2.4濾袋的制作 裁剪普通無紡布、聚酯布和尼龍布,用封口機(AIE-200,美國通用電氣公司)壓制成5 cm×6 cm的濾袋,樣品裝入后用封口機封口。
1.3.1儀器與試劑 全自動纖維分析儀:ANKOM 2000i,美國ANKOM技術有限公司。
離心機:DT5-2,北京時代北利離心機有限公司。
電熱鼓風干燥箱:DHG-9123A,上海精宏實驗設備有限公司。
耐高溫α-淀粉酶及稀釋液:100℃±5℃溫度下活性為8 000 U·g-1,上海阿拉丁生化科技股份有限公司。8.0 mL α-淀粉酶加水稀釋至250 mL,配成α-淀粉酶稀釋液。
中性洗滌劑:18.61 g乙二胺四乙酸二鈉(Na2EDTA)、 6.81 g四硼酸鈉(Na2B4O7·10H2O)、4.56 g 無水磷酸氫二鈉(Na2HPO4)、30.00 g十二烷基硫酸鈉(USP)各自加適量溫水溶解,冷卻后混合,加入10 mL三甘醇(C6H14O4)或乙二醇乙醚(C4H10O2),加水定容至1 000 mL。
酸性洗滌劑:20.00 g十六烷基三甲基溴化銨,溶解于1 000 mL 0.05 mol·L-1硫酸溶液中,適當加熱,攪拌溶解。
1.3.2失重率的測定 稱取烘干試樣0.5 g,裝入烘干并稱重和標號的濾袋,封口;放入烘干并稱重和標號的80 mL塑料離心管,移入50 mL蒸餾水,振蕩2 h;取出濾袋,在102℃±2℃下烘干至恒重,稱重,計算樣品失重率;離心管在2800×g離心力下離心5 min,倒去上清液,在102℃±2℃下烘干至恒重,稱重,計算樣品微粒流失率;用樣品失重與微粒失重之差與樣品重的比值,計算樣品溶水率。
1.3.3NDF的測定 稱取烘干試樣0.5 g,裝入濾袋,封口。置于燒杯中,加入丙酮浸泡振蕩洗滌3次,風干后置入全自動纖維分析儀濾袋架。自動加入中性洗滌液2 000 mL,手動加入20 g無水亞硫酸鈉,100℃ 消煮1 h,70℃ 溫水沖洗4次,濾袋移入燒杯,丙酮浸泡3~5 min,取出晾干,在102℃±2℃下烘干至恒重,稱重,計算樣品NDF含量。置入空白濾袋參與全部操作過程,計失重比例為校正因子。全株玉米青貯飼料樣品在消煮時加入4.0 mL ɑ-淀粉酶,并在熱水洗滌時加入250 mL ɑ-淀粉酶稀釋液。
1.3.4ADF的測定 采用連續(xù)法測定ADF的含量。將測定NDF后的濾袋重新放入全自動纖維測定儀濾袋架,自動加入酸性洗滌劑2 000 mL,100℃消煮1 h,70℃溫水沖洗4次,濾袋移入燒杯,丙酮浸泡3~5 min,取出晾干,在102℃±2℃下烘干至恒重,稱重,計算樣品ADF含量。置入空白濾袋參與全部操作過程,計失重比例為校正因子。
試驗數(shù)據(jù)采用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析,用Duncan法進行多重比較。
9目、18目和40目粉碎細度下樣品在F58濾袋中的失重率見圖1。由圖顯示,樣品粉碎細度從9目增加至40目,微粒流失率、溶水率和總失重率均無顯著性差異,變化范圍分別為1.37%~1.86%、12.07%~12.69%和13.68%~14.55%。表明,F(xiàn)58濾袋可有效阻止樣品微粒的流失。
10個飼草樣品經(jīng)過9目、18目和40目粉碎細度處理后的NDF含量見圖2。NDF含量最高的是小麥秸稈和豆秸,達到70%以上。其次是羊草干草、玉米秸稈青貯飼料、地瓜秧、花生秧和燕麥干草,范圍是50%~70%,苜蓿干草和玉米秸稈在40%~50%,最低的是全株玉米青貯飼料,低于40%。
苜蓿干草、豆秸和花生秧3個樣品不同細度處理間NDF含量差異不顯著,其它7個樣品的NDF含量表現(xiàn)為9目處理顯著高于18目處理和40目處理(P<0.05)。除小麥秸稈18目處理NDF含量顯著高于40目處理外(P<0.05),其它9個樣品18目處理和40目處理間的差異不顯著。
圖1 不同粉碎細度處理的失重率Fig.1 weight losses ratio of dry matter under different treatments
10個飼草樣品經(jīng)過9目、18目和40目粉碎細度處理后ADF含量見圖3。樣品ADF含量變化與NDF含量關系密切,由高到低依次為豆秸>小麥秸稈、花生秧、地瓜秧>羊草干草、玉米秸稈青貯飼料、苜蓿干草>燕麥干草、玉米秸稈、全株玉米青貯飼料。
粉碎細度處理對樣品ADF含量影響不如對NDF含量影響明顯,10個樣品中有6個樣品各處理間差異不顯著。具體表現(xiàn)為羊草干草、玉米秸稈青貯飼料、小麥秸稈和地瓜秧4個樣品9目處理的ADF含量顯著高于18目和40目(P<0.05),玉米秸稈青貯飼料和地瓜秧2個樣品的ADF含量18目顯著高于40目(P<0.05),其它樣品各處理間差異不顯著。
圖2 不同粉碎細度處理的NDF含量Fig.2 NDF content of sample under different finenesses
圖3 不同粉碎細度處理的ADF含量Fig.3 ADF content of sample under different finenesses
不同材質和孔徑濾袋處理,樣品NDF和ADF含量見表1。表中數(shù)據(jù)顯示, CAU濾袋測定樣品的NDF和ADF含量與F58濾袋(CK)差異不顯著,表明,CAU濾袋與F58濾袋材質相同,孔徑均較小,在本試驗測定方法中可以替代使用。其它濾袋測定的NDF含量均與CK處理差異顯著(P<0.05),ADF含量除尼龍布1 200目和1 600目處理與CK差異不顯著外,其它處理也均與CK處理差異顯著(P<0.05)。表明,普通無紡布、聚酯布和尼龍布均不能在本試驗測定方法下代替F58濾袋使用。
聚酯布和尼龍布濾袋不同孔徑處理NDF和ADF含量均呈隨目數(shù)增加而增加的趨勢。普通無紡布處理NDF含量與聚酯布和尼龍布的400目處理差異不顯著,ADF含量與聚酯布和尼龍布10個處理的7個處理無顯著性差異。
表1 不同濾袋測定的NDF和ADF含量Table 1 NDF and ADF contents of samples under different filter-bags
注:表中數(shù)據(jù)為平均值±標準差(n=3)。同列數(shù)字后不同字母表示差異顯著(P<0.05)
Note: Mean±standard deviation (n=3).The different letters within the same column mean the significant differences at the 0.05 level
13個濾袋處理在NDF含量測定過程中未發(fā)現(xiàn)濾袋破損現(xiàn)象,而ADF含量測定后發(fā)現(xiàn)有8個處理出現(xiàn)濾袋破損情況(見表2),為封口內緣斷裂。破損濾袋材質均為聚酯布和尼龍布,且呈現(xiàn)隨目數(shù)增加而增加的趨勢。濾袋破損率變化范圍為0~100%,其中600目和800目進口聚酯布處理破損率為100%,尤以800目進口聚酯布濾袋處理破損最為嚴重,使酸洗過程中樣品大量流失,導致ADF測定值出現(xiàn)異常。3個無紡布及400目的聚酯布和400目的尼龍布處理未出現(xiàn)濾袋破損現(xiàn)象。
表2 不同材質濾袋的破損率Table 2 Damaged rates of filter-bags during ADF determination procedure
范氏法測定NDF和ADF含量是利用中性洗滌劑和酸性洗滌劑分解植物細胞內容物(如脂肪、淀粉、蛋白質和糖類等)來實現(xiàn)的,洗滌和過濾是測定NDF和ADF含量的兩個重要環(huán)節(jié)[1,12]。本試驗結果顯示,飼草樣品經(jīng)18目和40目粉碎處理,NDF含量顯著低于9目處理(P<0.05),表明樣品細粉有利于非纖維物質的洗滌。錢文熙[13]對新鮮苜蓿、青貯玉米、棉籽殼(Cotton seed hull)和大豆(Soybean)的研究也發(fā)現(xiàn),樣品經(jīng)18目、40目和60目(0.25 mm)處理CF含量低于8目(2.00 mm)處理,且測定結果重復性好,原因是細粉確保了試驗樣品的代表性,并有效擴大樣品與試驗試劑的接觸面積,能促進非纖維物質的洗滌。
濾袋是濾袋法測定NDF和ADF技術的重要環(huán)節(jié),其材質和孔徑大小對測定結果的準確性影響很大。Lindberg 和 Knutsson[14]試驗結果顯示, 10 μm尼龍袋中裝入18目粗飼料樣品,水浸泡6 h后,干物質流失比例變動范圍為3.7%~8.5%,顯著低于20 μm尼龍袋。Ankom 技術認為[8],F(xiàn)57濾袋將有少于5%的樣品微粒(細度<30 μm)在洗滌中流失,田雨佳等[6]試驗表明,這種流失導致了細粉處理(過40目網(wǎng)篩)的NDF和ADF含量較粗粉(過2.00 mm網(wǎng)篩)處理顯著降低(P<0.05),但試驗并未給出濾袋孔徑大小參數(shù)。Van miellen和 Ellis[15]研究認為,孔徑為10 μm的濾袋能阻止樣品流失。本試驗數(shù)據(jù)顯示,采用孔徑為10 μm 的F58濾袋,飼草樣品粉碎細度從9目增加至40目,微粒流失率變化范圍為1.37%~1.86%,各處理間差異不顯著。顯然,與F57濾袋比,更小孔徑的F58濾袋有效防止樣品微粒的流失。
Komarek(1993)[16]和Komarek等(1994)[17]研究顯示,濾袋法測定NDF和ADF含量與傳統(tǒng)抽濾法的差異小于2%。Vogel等[8]和薛紅楓等[9]研究顯示,粉碎細度為18目的粗飼料樣品用ANKOM公司F57濾袋測定NDF 和ADF含量,其測定值與傳統(tǒng)抽濾法差異不顯著。本研究采用ANKOM 公司提供的F58濾袋,孔徑為10 μm,加上材料本身的三維結構,能有效降低樣品微粒的流失,并暢通洗滌液在濾袋內外的流動,用于測定18目和40目粉碎處理的樣品,兩者的NDF和ADF含量一致??紤]到國標法測定粗蛋白等營養(yǎng)指標要求樣品粉碎細度為40目,為減少樣品粉碎次數(shù),建議用孔徑為10 μm 的三維無紡布纖維濾袋測定飼草中NDF和ADF含量時,樣品粉碎細度可為40目。
濾袋法測定NDF和ADF含量過程中,濾袋充當了過濾膜的作用,要求其材質具備不易吸水、經(jīng)酸堿和有機溶劑處理前后質量變化小的特點,并且孔徑大小合適,保證洗滌劑的自由流通[11,18]。自上個世紀30年代以來,國內外學者對絲綢[19]、聚酯纖維[11]、尼龍布[7,10]和特制三維無紡布[7]等材質的篩選做了大量有益的探索,目前國內市場流通產(chǎn)品主要是ANKOM 公司的纖維濾袋和中國農業(yè)大學肉牛研究中心的CAU濾袋,材質均為特制無紡布。本研究結果顯示,用CAU濾袋測定樣品NDF和ADF含量與ANKOM F58濾袋差異不顯著,這與薛紅楓等[9]和王曉娜等[20]的研究結果一致。表明,CAU濾袋可以在飼草樣品中替代ANKOM F58濾袋使用,以降低檢測成本。
而普通無紡布、聚酯纖維與尼龍布濾袋NDF測定值均顯著低于ANKOM F58濾袋,這與袁翠林等[10]和張崇玉等[11]研究結果不一致。究其原因,一是可能與試驗樣品粉碎細度不同有關。袁翠林等[10]和張崇玉等[11]的試驗樣品粉碎細度為18目,而本試驗樣品粉碎細度為40目。二是與濾袋材質和孔徑有關。與400目尼龍布濾袋[10]和460目聚酯纖維濾袋[11]比較,ANKOM F58濾袋孔徑更小,且具備三維結構,在暢通洗滌液出入濾袋膜、確保洗滌充分的同時,能更有效阻止樣品細小微粒的流失。本試驗用連續(xù)法測定樣品ADF含量過程中,聚酯布和尼龍布濾袋破損現(xiàn)象普遍,均是封口內緣斷裂,導致ADF含量偏低。這可能與本試驗的濾袋縫制和封口方法有關,表明熱封口方法不適合聚酯布和尼龍布濾袋制作。聚酯纖維與尼龍布濾袋在NDF和ADF測定中的應用還有待于對縫制方法、孔徑大小及適宜樣品粉碎細度上做進一步研究。
隨著樣品粉碎細度的增加,NDF和ADF含量均呈現(xiàn)下降的趨勢。用孔徑為10 μm的特制三維無紡布纖維濾袋測定飼草中NDF和ADF含量時,樣品適宜粉碎細度為18~40目,但為與粗蛋白等其他養(yǎng)分指標測定時保持一致的粉碎細度,建議粉碎細度為40目。
利用CAU濾袋測定樣品NDF和ADF含量與ANKOM F58濾袋差異不顯著,可在濾袋法測定飼草NDF和ADF含量中替代應用。聚酯布和尼龍布濾袋在ADF測定過程中易出現(xiàn)破損現(xiàn)象,其在NDF和ADF測定中的應用還有待于對縫制方法、孔徑大小及適宜樣品粉碎細度方面做進一步研究。