廖思聰 王大新

1中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院心內(nèi)科（長沙 410011）；2江蘇省蘇北人民醫(yī)院心內(nèi)科（江蘇揚州 225001）

血管平滑肌細胞（vascular smooth muscle cell，VSMC）是血管組織中最主要的細胞類型，在生理狀態(tài)可維持低水平的死亡和增殖功能，然而在動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）發(fā)生發(fā)展過程中，VSMC的凋亡水平異常增高，提示VSMC的功能變化在AS等慢性炎癥疾病中具有重要地位［1］。近年來研究發(fā)現(xiàn)，在人AS斑塊中VSMC是泡沫細胞的主要細胞來源之一，VSMC源性泡沫細胞在AS病程進展中，發(fā)生凋亡或壞死將可能是引起斑塊不穩(wěn)定甚至破裂的重要因素［2-3］。吸煙是心血管疾病公認(rèn)的獨立危險因素，香煙煙霧暴露可引起血管內(nèi)皮的功能障礙，并引起慢性炎癥狀態(tài)［4-5］，但因香煙煙霧中成分復(fù)雜，其致病機制目前尚無定論。AS的發(fā)生發(fā)展過程相當(dāng)復(fù)雜，AS形成機制目前尚不完全清楚，因此，研究VSMC凋亡的誘發(fā)機制可能對防治AS具有重要的理論和臨床意義［6-7］。本研究以香煙煙霧提取物體外干預(yù)小鼠VSMC為切入點，探討香煙煙霧暴露對血管平滑肌細胞凋亡的影響及可能的機制，為抗AS研究提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器 Bax抗體和GRP78抗體購自美國Santa公司；Bcl?2抗體和Chop抗體購自美國CST公司；β?actin抗體購自美國Sigma公司；DMEM培養(yǎng)基購自美國Hyclone公司；PVDF膜購自美國Merck公司；ECL顯影液購自美國Thermo公司。胎牛血清購自浙江天杭生物公司；紅金龍香煙為中煙工業(yè)公司產(chǎn)品；山羊抗兔二抗和小鼠二抗為北京中杉金橋公司產(chǎn)品；青鏈霉素雙抗溶液、RIPA蛋白裂解液和BCA蛋白定量試劑盒為北京索萊寶公司產(chǎn)品；Annexin V?FITC/PI凋亡檢測試劑盒為北京康為世紀(jì)公司產(chǎn)品；RNA提取試劑盒、cDNA合成試劑盒以及PCR擴增試劑盒均為北京天根科技公司產(chǎn)品。Tecan M2000酶標(biāo)儀為美國Tecan公司產(chǎn)品；BD FACSCalibur流式細胞儀為美國BD公司產(chǎn)品；ChemiDoc XRS化學(xué)發(fā)光成像儀為美國Bio?Rad公司產(chǎn)品；Step One Plus實時熒光定量PCR儀為美國ABI公司產(chǎn)品。

1.2 細胞培養(yǎng)與實驗分組 小鼠主動脈血管平滑肌細胞株VSMC由南京醫(yī)科大學(xué)病理生理學(xué)系惠贈，使用含10%胎牛血清和1%雙抗的DMEM培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)于37℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱。用0.25%胰酶消化傳代，只取10代以內(nèi)的對數(shù)期細胞進行實驗。實驗分組：對照組采用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)，CSE低濃度組、中濃度組和高濃度組則分別加入終濃度為1%、5%和10%的CSE，細胞培養(yǎng)12 h后行相關(guān)實驗檢測。

1.3 香煙煙霧提取物的制備 參考LEE等［8］報道的方法制作負壓抽吸裝置，制備本實驗所需的香煙提取物（cigarette smoke extract，CSE）。1支點燃的香煙（焦油含量10 mg/支，尼古丁含量0.9 mg/支），使用50 mL針筒通過負壓吸引裝置將香煙煙霧連續(xù)抽吸入盛有20 mL PBS的密閉燒瓶內(nèi)，持續(xù)抽吸3～5 min直至香煙燃盡。抽吸完畢后溶液經(jīng)0.22 μm孔徑濾器過濾以除去細菌和大分子顆粒，即得到濃度為100%的CSE原液。實驗所需的不同濃度CSE溶液用相應(yīng)體積的無血清培養(yǎng)基稀釋，配制好不同濃度的CSE須在30 min內(nèi)用于實驗。

1.4 CCK?8法檢測細胞增殖 取對數(shù)生長期細胞接種于96孔板，對照組細胞使用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)，各CSE處理組分別給予不同濃度CSE（1%、5%和10%）的無血清培養(yǎng)基處理，同時設(shè)不接種細胞只含培養(yǎng)基的空白組，每組3個復(fù)孔，12 h后加入10 μL CCK?8溶液繼續(xù)培養(yǎng)2 h，隨后經(jīng)酶標(biāo)儀檢測各樣本在450 nm處的OD值。細胞存活率=（OD處組-OD空白組）/（OD對照組-OD空白組）×100%。

1.5 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡率 參照凋亡試劑盒操作，消化收集細胞后，調(diào)整細胞密度約為5×105個/mL，離心（4 ℃，1 000 r/min）5 min，預(yù)冷 PBS漂洗細胞2次，棄上清，細胞重懸于100 μL結(jié)合緩沖液，隨后加入5 μL Annexin V?FITC 和10 μL碘化丙碇（PI），室溫避光反應(yīng)15 min，再加入 400 μL PBS，30 min內(nèi)上機檢測細胞凋亡率。Annexin V?FITC陽性細胞為早期凋亡細胞，PI陽性細胞為晚期凋亡或壞死細胞，而Annexin V?FITC/PI雙陰性細胞為正常活細胞，故Annexin V?FITC單陽性細胞群占總細胞群的百分比即為本實驗檢測的細胞凋亡率。

1.6 實時定量PCR檢測mRNA表達 采用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計各基因的引物序列，由上海生工生物公司負責(zé)合成。各引物序列如下：Bcl?2正鏈5′?CCAGGACGTCTCCTCTCAGG?3′，反鏈 5′?AA?GATGGTGATGGGCTTCCCG?3′；Bax正鏈 5′?CGT?GAGCG GCTGCTTGTCTG?3′，反鏈 5′?TGGTGAGC?GAGGCGGTGAG?3′；Grp78正鏈 5′?GCGTCGGTGT?GTTCAAGAAC?3′，反鏈5′?AAGGGTCATTCCAAGT?GCGT?3′；Chop 正鏈5′?CCAACAGAGG?TCACACG?CACATC?3′，反鏈 5′?TCGTTCTCCTGCTCCTTCTCC?TTC?3′；Gapdh正鏈5′?TGGCAAAGTGGAGATTGTT?GCC?3′，反鏈 5′?AAGATGGTGATGGGCTTCCCG?3′。參照總RNA提取試劑盒的操作說明提取細胞RNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，隨后加入SYBR Green試劑經(jīng)熒光定量PCR儀檢測分析，最后通過擴增曲線、溶解曲線以及各樣本的CT值確認(rèn)擴增反應(yīng)。本實驗以GAPDH作為內(nèi)參基因，利用2-ΔΔCt法計算各樣本的mRNA相對表達。

1.7 Western blot檢測蛋白表達 參照RIPA蛋白裂解液說明書提取細胞總蛋白，每孔加入200 μL含1%蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液，冰上裂解10 min后，4℃，12 000g離心10 min，吸取上清。采用BCA蛋白定量試劑盒檢測各樣本的蛋白濃度。將蛋白樣本與5 X蛋白上樣緩沖液混勻，煮沸10 min后暫存于-20℃冰箱。每孔總蛋白上樣量為30 μg，使用10%聚丙烯酰胺凝膠電泳，電轉(zhuǎn)至PVDF膜后，5%脫脂奶粉封閉2 h。分別用Bcl?2抗體（1∶1 000）、Bax抗體（1∶1 000）、GRP78抗體（1∶1 000）、CHOP抗體（1∶1 000）和β?actin抗體（1∶3 000）4℃孵育過夜，對應(yīng)的HRP標(biāo)記二抗（小鼠二抗1∶4 000，兔二抗 1∶3 000）室溫孵育1 h，PBST溶液洗膜3次后，經(jīng)ChemiDoc XRS化學(xué)發(fā)光成像分析系統(tǒng)分析各條帶灰度值。本實驗以β?actin作為內(nèi)參，各目的蛋白與內(nèi)參蛋白灰度值的比值則為蛋白的相對表達量。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法 實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析（one?way ANOVA），組間均數(shù)比較用Dunnett法，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 香煙煙霧暴露抑制VSMC增殖 為檢測香煙香霧暴露對VSMC細胞增殖的影響，本研究設(shè)置1%、5%和10%不同濃度的CSE處理組，以CCK?8法檢測VSMC細胞存活率。結(jié)果顯示（圖1），對照組、1%CSE處理組、5%CSE處理組和10%CSE處理組細胞存活率分別為（100±2.16）%、（97.66± 1.57）%、（91.18± 4.86）%和（85.37± 2.75）%。其中，1%CSE處理組相比對照組細胞增殖有降低的趨勢，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.17），而5%CSE處理組和10%CSE處理組細胞增殖較對照組降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。上述結(jié)果提示，香煙煙霧暴露可抑制VSMC細胞增殖，同時也為后續(xù)探索細胞凋亡等實驗條件提供依據(jù)。

圖1 CSE對VSMC細胞增殖的影響Fig.1 The effect of CSE on the proliferation of VSMC cells

2.2 香煙煙霧暴露誘導(dǎo)VSMC細胞凋亡 為探討香煙煙霧暴露對VSMC凋亡的影響，結(jié)合此前細胞增殖的實驗結(jié)果，本研究以1%、5%和10%不同濃度CSE干預(yù)細胞12 h后，通過Annexin V?FITC/PI流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡率。結(jié)果顯示，細胞凋亡率相比對照組（5.84±1.21）%，1%CSE處理組（14.20±1.53）%、5%CSE處理組（24.18±2.44）%和10%CSE處理組（30.64±2.52）%呈濃度依賴性顯著增高（圖2），差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。凋亡相關(guān)蛋白和mRNA的檢測結(jié)果顯示，1%CSE處理組、5%CSE處理組和10%CSE處理組中抗凋亡效應(yīng)的Bcl?2蛋白和mRNA水平，相比對照組表達呈濃度依賴性下調(diào)，而促凋亡作用Bax的蛋白和mRNA表達則濃度依賴性上調(diào)（圖3），差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。上述結(jié)果表明，香煙煙霧暴露對VSMC細胞凋亡具有明顯的促進作用。

2.3 香煙煙霧暴露激活ERS信號途徑 本研究推測香煙煙霧暴露誘導(dǎo)VSMC凋亡可能與激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（endoplasmic reticulum stress，ERS）途徑有關(guān)，因此進一步檢測了2個ERS標(biāo)志分子GRP78以及Chop的蛋白和mRNA表達。結(jié)果顯示相比對照組，1%CSE處理組、5%CSE處理組和10%CSE處理組GRP78和Chop的蛋白與mRNA表達呈濃度依賴性增加（圖4），差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。上述結(jié)果表明，香煙煙霧暴露可激活VSMC細胞的ERS信號。

圖2 CSE對VSMC細胞凋亡的影響Fig.2 The effect of CSE on the apoptosis of VSMC cells

圖3 CSE對VSMC細胞凋亡相關(guān)蛋白和mRNA表達的影響Fig.3 Effects of CSE on the expression of apoptosis related protein and mRNA in VSMC cells

圖4 CSE激活VSMC細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號Fig.4 CSE activates the endoplasmic reticulum stress signal of VSMC cells

3 討論

VSMC是血管組織中合成膠原纖維的主要細胞，可維持AS斑塊的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，一旦VSMC細胞死亡將導(dǎo)致斑塊中膠原成分減少，這也是后續(xù)斑塊不穩(wěn)定甚至破裂的重要原因之一［1，9］。DICKHOUT等［10］在人體冠心病組織中證實與穩(wěn)定型斑塊相比，傾向于破裂的薄壁型斑塊以及破裂的斑塊內(nèi)凋亡細胞異常增加，包括GRP78和Chop等ERS標(biāo)志信號表達增高，并發(fā)現(xiàn)這些斑塊組織中凋亡細胞和高表達的ERS相關(guān)蛋白主要來源于VSMC。隨著AS疾病進展，斑塊中巨噬細胞的吞噬能力會逐漸減弱，將難以吞噬清除凋亡的VSMC，一旦這些殘余的凋亡細胞發(fā)展為壞死細胞，并釋放白介素（interleukin，IL）IL?1α、IL?6和單核趨化蛋白1（monocyte chemotactic protein）等炎癥因子，將導(dǎo)致慢性炎癥狀態(tài)，加劇AS的發(fā)生發(fā)展［6，11-12］?？傊訴SMC凋亡為靶標(biāo)逐漸成為AS的研究熱點［13-14］，對防治心血管疾病具有重大意義。

吸煙是心血管疾病公認(rèn)的獨立危險因素，同時也是肺部疾病重要的致病因素［15］。LEE等［8］研究證實香煙暴露可促進小鼠肺成纖維細胞合成IL?6、TNF?α以及活性氧族（reactive oxygen species）等促炎因子，引起炎癥反應(yīng)以及氧化應(yīng)激。香煙煙霧的成分復(fù)雜多變，含有多種有毒有害物質(zhì)，不僅對呼吸系統(tǒng)具有直接的細胞毒害作用，香煙中有害物質(zhì)溶于血液后可能對心血管系統(tǒng)也有長期潛在的致病作用［16］。本研究表明，CSE體外干預(yù)VSMC后細胞凋亡率明顯增加，而Bcl?2的蛋白和mRNA表達下調(diào)，Bax的蛋白和mRNA表達上調(diào)，推測香煙煙霧暴露可誘導(dǎo)VSMC凋亡。凋亡是在各種生理或病理狀態(tài)下細胞的一種程序性死亡方式，凋亡過程受到促凋亡和抗凋亡的雙重調(diào)控，其中BCL?2家族在平衡凋亡過程中具有重要作用?；诮Y(jié)構(gòu)和序列的同源性，BCL?2家族中抗凋亡蛋白包括 Bcl?2、Bcl?xl以及 MCL?1 等，而 Bax、Bak 和Bim等蛋白則具有促凋亡效應(yīng)［17］。例如，Bax可介導(dǎo)細胞色素C（cytochrome C）自線粒體釋放至胞質(zhì)中，進而通過經(jīng)典的線粒體途徑促發(fā)細胞凋亡［18］。

ERS是在各種原因激活未折疊蛋白反應(yīng)（unfolded protein response，UPR）后細胞做出的適應(yīng)性反應(yīng)，在AS中發(fā)揮關(guān)鍵性作用［19］。早期輕度的ERS通過誘導(dǎo)糖調(diào)節(jié)蛋白（glucose regulated pro?tein 78 kD，GRP78）等內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶表達增加，以減輕UPR從而產(chǎn)生保護效應(yīng)，而持續(xù)或強烈的ERS可通過Chop、caspase?12以及JNK等信號通路誘導(dǎo)細胞凋亡。Chop蛋白作為ERS信號分子，同時也是激活細胞色素C極其重要的誘導(dǎo)因子。細胞色素C自線粒體釋放至胞質(zhì)引起的線粒體膜電位變化，可直接促發(fā)細胞凋亡［20-22］。因此GRP78和Chop可在一定程度反映ERS強烈程度，是細胞發(fā)生ERS的標(biāo)志信號。本研究結(jié)果顯示，CSE可濃度依賴性增加VSMC細胞中GRP78以及Chop的蛋白和mRNA表達，因此推測香煙煙霧暴露誘導(dǎo)VSMC凋亡可能與ERS信號途徑有關(guān)。任妮娜等［23］報道PM2.5暴露可致肺癌細胞發(fā)生自噬，提示本研究中香煙煙霧暴露誘導(dǎo)VSMC凋亡部分與ERS有關(guān)外，可能也有細胞自噬的參與，有待進一步研究證實。

總之，本研究通過CSE體外干預(yù)小鼠VSMC較好地模擬吸煙可能引起的細胞損傷，首次從ERS途徑探討了香煙煙霧暴露誘導(dǎo)VSMC凋亡的分子機制。本研究的局限性在于只涉及體外實驗，今后還需進一步開展動物實驗。綜上所述，香煙煙霧暴露可能通過ERS途徑誘導(dǎo)體外VSMC凋亡。抑制香煙煙霧暴露誘導(dǎo)的VSMC凋亡可能是今后抗AS新的研究思路。