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        UPLC-MS/MS同時(shí)測(cè)定水產(chǎn)品中4種丁香酚類(lèi)麻醉劑殘留量

        2018-07-27 03:25:52倪崢飛馮永巍薛慶海
        質(zhì)譜學(xué)報(bào) 2018年4期
        關(guān)鍵詞:丁香酚麻醉劑水產(chǎn)品

        倪崢飛,顧 曄,馮永巍,薛慶海,王 琴

        (無(wú)錫產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)院,江蘇 無(wú)錫 214101)

        丁香酚類(lèi)化合物包括丁香酚、異丁香酚、甲基丁香酚、甲基異丁香酚等,自20世紀(jì)70年代初發(fā)現(xiàn)該類(lèi)化合物對(duì)魚(yú)類(lèi)有強(qiáng)烈的麻醉作用至今,以其高性價(jià)比在水產(chǎn)運(yùn)輸領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。丁香酚、異丁香酚對(duì)魚(yú)類(lèi)、甲殼類(lèi)水產(chǎn)品都具有較好的麻醉效果[1],分別以二者為主要成分制成的丁香油和AQUI-S[2-3]代表性漁用麻醉劑,其中均易殘留甲基丁香酚、甲基異丁香酚,進(jìn)而影響食品安全[4]。

        目前,丁香酚類(lèi)漁用麻醉劑的安全性在國(guó)際上仍存在較大爭(zhēng)議,特別是甲基丁香酚,國(guó)際研究機(jī)構(gòu)通過(guò)大量實(shí)驗(yàn)證明其對(duì)哺乳動(dòng)物具有致癌作用[5-7]。美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局禁止丁香酚、異丁香酚和甲基丁香酚等成分作為新型獸藥流通使用[8],同時(shí)終止了對(duì)丁香油作為非商品漁用麻醉劑使用的審批[9],至今未批準(zhǔn)養(yǎng)殖鮭魚(yú)使用AQUI-S的申請(qǐng)[11]。但在新西蘭、智利等國(guó)家,AQUI-S可用于魚(yú)類(lèi)和貝類(lèi)的養(yǎng)殖和捕撈[3]。日本規(guī)定了丁香酚作為漁用麻醉劑使用時(shí)的藥浴劑量范圍50~200 mg/L和殘留限量值0.05 mg/L[10]。目前,我國(guó)對(duì)丁香酚類(lèi)漁用麻醉劑的使用尚無(wú)明確規(guī)定,調(diào)查顯示,丁香油是我國(guó)水產(chǎn)品流通環(huán)節(jié)使用最廣泛的麻醉劑[12]。

        丁香酚類(lèi)化合物的檢測(cè)方法主要有紫外分光光度法[13]、毛細(xì)管電泳法[14]、氣相色譜法[15]、液相色譜法[16-18]、氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[19-20]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[12,21]等。對(duì)于水產(chǎn)品等復(fù)雜基質(zhì)樣品,光譜法和色譜法雖然操作簡(jiǎn)單,但無(wú)法有效排除雜質(zhì)和背景干擾,檢測(cè)限高、靈敏度低。趙東豪等[12]采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-MS/MS)負(fù)離子模式測(cè)定了魚(yú)肉和水中的丁香酚殘留,定量限分別為2.5 μg/kg和0.05 μg/L。孫鵬等[21]針對(duì)水產(chǎn)品建立了漂浮固化分散液-液微萃取結(jié)合UPLC-MS/MS的方法測(cè)定丁香酚,定量限為4.91 μg/kg。由于甲基丁香酚和甲基異丁香酚?;烊攵∠惴雍彤惗∠惴勇樽韯┊a(chǎn)品中,影響食品安全,因此有必要建立一種快速、準(zhǔn)確的水產(chǎn)品中丁香酚類(lèi)麻醉劑多殘留檢測(cè)的分析方法。

        本研究擬將固相萃取與超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-MS/MS)結(jié)合,同時(shí)測(cè)定水產(chǎn)品中4種丁香酚類(lèi)麻醉劑的殘留量,希望為水產(chǎn)品中丁香酚類(lèi)麻醉劑的多殘留檢測(cè)提供技術(shù)支持。

        1 實(shí)驗(yàn)部分

        1.1 儀器與設(shè)備

        1290-6470型超高效液相色譜-串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜儀:配有電噴霧離子源及MassHunter 8.0數(shù)據(jù)處理系統(tǒng),美國(guó)Agilent公司產(chǎn)品;BiosafeAvarti J-E冷凍離心機(jī):美國(guó)Beckman公司產(chǎn)品;超純水儀:美國(guó)Millipore公司產(chǎn)品;Oasis HLB固相萃取小柱(60 mg/3 mL):美國(guó)Waters公司產(chǎn)品。

        1.2 材料與試劑

        丁香酚標(biāo)準(zhǔn)品(純度99.8%)、異丁香酚標(biāo)準(zhǔn)品(純度97.2%)、甲基丁香酚標(biāo)準(zhǔn)品(純度98.0%)、甲基異丁香酚標(biāo)準(zhǔn)品(純度99.6%):美國(guó)Accustandard公司產(chǎn)品;正己烷、乙腈、乙酸乙酯、甲醇:均為色譜純,德國(guó)Merck公司產(chǎn)品;實(shí)驗(yàn)用水:符合GB/T 6682—2008規(guī)定的一級(jí)水,由Milli-Q超純水系統(tǒng)制備;鯽魚(yú)、對(duì)蝦:均購(gòu)于超市,取可食部分經(jīng)高速組織搗碎機(jī)處理后備用。

        丁香酚類(lèi)麻醉劑標(biāo)準(zhǔn)溶液:用乙腈配制1 mg/L 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液,于-18 ℃避光保存,使用時(shí)用初始流動(dòng)相逐級(jí)稀釋成標(biāo)準(zhǔn)工作液。

        1.3 實(shí)驗(yàn)條件

        1.3.1色譜條件 色譜柱:ZORBAX Eclipse Plus C18柱(50 mm×2.1 mm×1.8 μm);流動(dòng)相:A為0.01%甲酸溶液,B為甲醇-乙腈(1∶3,V/V);流速0.3 mL/min;柱溫35 ℃;進(jìn)樣量5 μL;梯度洗脫程序:0~0.5 min(90%A),0.5~1.5 min(90%~58%A),1.5~7.5 min(58%A),7.5~8 min(58%~10%A),8~10 min(10%A),10~11 min(10%~90%A),11~13 min(90%A)。

        1.3.2質(zhì)譜條件 電噴霧離子源(ESI);多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)正、負(fù)離子模式;毛細(xì)管電壓:正、負(fù)離子模式均為3 500 V;干燥氣、霧化氣、碰撞氣、鞘氣:均為高純氮?dú)?;鞘氣:溫?00 ℃,流速11.0 L/min,噴嘴電壓500 V;干燥氣:溫度350 ℃,流速5.1 L/min;多反應(yīng)監(jiān)測(cè)離子對(duì)和質(zhì)譜條件列于表1。

        表1 丁香酚類(lèi)麻醉劑的質(zhì)譜多反應(yīng)監(jiān)測(cè)離子對(duì)及質(zhì)譜參數(shù)Table 1 MRM ion pairs and mass spectral parameters for eugenol derivatives anesthetics

        注:*表示定量離子

        1.4 實(shí)驗(yàn)方法

        1.4.1樣品前處理 稱(chēng)取2.00 g均質(zhì)樣品于50 mL離心管中,加入5 mL正己烷,旋渦振蕩10 min,以6 000 r/min離心10 min,轉(zhuǎn)移上清液,殘?jiān)? mL正己烷按上述步驟重復(fù)提取1次,合并2次提取液,置于35 ℃水浴中,氮吹至近干,用3 mL 40%甲醇溶液復(fù)溶。

        用3 mL甲醇和3 mL水活化HLB固相小柱,將樣品液以1 mL/min上樣,控制緩慢流速,用3 mL 40%甲醇溶液淋洗、2 mL甲醇洗脫,將全部洗脫液置于35 ℃水浴中,氮吹至不足0.5 mL,再用初始流動(dòng)相定容至1 mL,過(guò)0.22 μm有機(jī)濾膜,上機(jī)檢測(cè)。

        1.4.2方法學(xué)驗(yàn)證 將4種丁香酚類(lèi)麻醉劑混標(biāo)儲(chǔ)備液用初始流動(dòng)相配制成濃度分別為1、2.5、5、10、50、100、200 μg/L的混標(biāo)工作液,建立標(biāo)準(zhǔn)曲線,并考察其線性關(guān)系。

        向陰性鯽魚(yú)、對(duì)蝦樣品中分別添加2.5、5、25 μg/kg丁香酚類(lèi)麻醉劑混標(biāo)溶液,每個(gè)加標(biāo)水平制備6個(gè)平行樣品,按1.4.1節(jié)處理,以外標(biāo)法定量,考察樣品的加標(biāo)回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD),評(píng)價(jià)方法的準(zhǔn)確度和精密度。

        2 結(jié)果與討論

        2.1 實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化

        2.1.1色譜條件 本實(shí)驗(yàn)比較了甲醇-水、乙腈-水以及甲醇乙腈-水溶液作為流動(dòng)相的分離情況。結(jié)果表明,以甲醇-水、乙腈-水作為流動(dòng)相時(shí),丁香酚和異丁香酚、甲基丁香酚和甲基異丁香酚2對(duì)同分異構(gòu)體均無(wú)法完全分離,這對(duì)質(zhì)譜分析產(chǎn)生干擾;以甲醇乙腈(1∶3,V/V)-水溶液為流動(dòng)相,且兩相體積比為58∶42時(shí),譜圖基線平整穩(wěn)定,2對(duì)同分異構(gòu)體在7.5 min之前均達(dá)到完全分離,峰形尖銳、對(duì)稱(chēng)、無(wú)拖尾,結(jié)果示于圖1。

        圖1 10 μg/L丁香酚類(lèi)麻醉劑標(biāo)準(zhǔn)溶液的總離子流圖Fig.1 Total ion chromatogram of 10 μg/L eugenol derivatives anesthetics standard solution

        流動(dòng)相pH值對(duì)丁香酚類(lèi)麻醉劑的質(zhì)譜響應(yīng)具有顯著影響,實(shí)驗(yàn)通過(guò)向流動(dòng)相中添加甲酸來(lái)控制其pH值,添加甲酸濃度分別為0.01%、0.05%、0.1%、0.2%時(shí),比較獲得的目標(biāo)物信號(hào)。結(jié)果表明,甲酸濃度為0.01%時(shí),甲基丁香酚和甲基異丁香酚的信號(hào)強(qiáng)度明顯提高,但進(jìn)一步提高甲酸濃度,則會(huì)抑制丁香酚和異丁香酚的質(zhì)譜響應(yīng),故選擇甲酸添加濃度為0.01%。

        2.1.2質(zhì)譜條件 4種丁香酚類(lèi)麻醉劑的結(jié)構(gòu)式示于圖2。丁香酚和異丁香酚均有1個(gè)酚羥基,在電噴霧電離下,易丟失1個(gè)質(zhì)子形成[M-H]-準(zhǔn)分子離子峰[22]。甲基丁香酚與甲基異丁香酚中酚羥基被甲氧基取代,在電噴霧電離下,易獲得1個(gè)質(zhì)子形成[M+H]+準(zhǔn)分子離子峰。

        將1 mg/L丁香酚類(lèi)麻醉劑混標(biāo)溶液進(jìn)樣。首先,選擇MS2Scan模式同時(shí)以正、負(fù)離子模式在m/z100~350范圍進(jìn)行一級(jí)質(zhì)譜掃描。結(jié)果表明,負(fù)離子模式下,丁香酚和異丁香酚的[M-H]-(m/z163)信號(hào)較強(qiáng);正離子模式下,甲基丁香酚和甲基異丁香酚的[M+H]+(m/z179)信號(hào)較強(qiáng)。由此,確定4種化合物的分子離子,然后選擇MS2SIM模式以各分子離子響應(yīng)最大化優(yōu)化碎裂電壓,確定碎裂電壓均為90 V。其次,選擇子離子模式,分別設(shè)定各母離子的碰撞能為10、20、30、40 eV,進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜掃描,從各組分二級(jí)質(zhì)譜中分別選取2個(gè)無(wú)干擾、相對(duì)豐度較強(qiáng)的特征碎片離子,然后將相對(duì)豐度最強(qiáng)的碎片離子與母離子組成定量離子對(duì),次強(qiáng)的碎片離子與母離子組成定性離子對(duì)。最后選擇MRM模式,分別優(yōu)化每對(duì)離子對(duì)的碰撞能,確定最優(yōu)值;并優(yōu)化電噴霧離子源參數(shù)(包括毛細(xì)管電壓、干燥氣、霧化氣、碰撞氣等)。質(zhì)譜多反應(yīng)監(jiān)測(cè)離子對(duì)和質(zhì)譜條件參數(shù)列于表1。

        圖2 丁香酚類(lèi)麻醉劑的結(jié)構(gòu)式Fig.2 Chemical structures of eugenol derivatives anesthetics

        2.2 樣品提取條件的優(yōu)化

        2.2.1提取液的選擇 丁香酚類(lèi)麻醉劑屬于極性化合物,難溶于水,易溶于乙腈、乙醚等有機(jī)溶劑。本實(shí)驗(yàn)對(duì)比了正己烷、乙腈和乙酸乙酯對(duì)4種丁香酚類(lèi)麻醉劑的提取效果,結(jié)果表明,3種有機(jī)溶劑的提取回收率均大于90%,示于圖3。乙腈試劑毒性大,且樣品濃縮速度顯著慢于正己烷和乙酸乙酯,易造成丁香酚類(lèi)麻醉劑損失;乙酸乙酯提取樣品經(jīng)固相萃取凈化后,仍有明顯雜質(zhì)干擾,且基線噪音較大,靈敏度降低;正己烷提取的樣品,基線平穩(wěn),雜質(zhì)干擾少,且氮吹濃縮速度相對(duì)較快。因此,選擇正己烷作為4種丁香酚類(lèi)麻醉劑的提取溶劑。

        圖3 不同有機(jī)溶劑對(duì)丁香酚類(lèi)麻醉劑的提取回收率Fig.3 Recoveries of eugenol derivatives anesthetics extracted by hexane, acetonitrile or ethyl acetate

        2.2.2固相萃取條件的優(yōu)化 分別采用3 mL不同體積分?jǐn)?shù)(10%~100%)的甲醇溶液對(duì)HLB小柱進(jìn)行丁香酚類(lèi)麻醉劑的進(jìn)樣和淋洗實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明,當(dāng)甲醇溶液的體積分?jǐn)?shù)低于40%時(shí),4種丁香酚類(lèi)麻醉劑能較好地吸附于HLB小柱上,不會(huì)在上樣和淋洗時(shí)隨甲醇溶液過(guò)柱而損失,所以采用3 mL 40%甲醇溶液作為固相萃取的上樣液和淋洗液。

        為確定洗脫液的體積,減少樣品濃縮時(shí)間,考察了1~5 mL甲醇洗脫4種丁香酚類(lèi)麻醉劑的回收率,示于圖4。結(jié)果表明,2 mL甲醇足以將4種丁香酚類(lèi)麻醉劑從60 mg/3 mL的HLB小柱上完全洗脫。

        2.2.3氮吹水浴溫度對(duì)回收率的影響 丁香酚類(lèi)麻醉劑具有一定的揮發(fā)性。為考察它們?cè)诘禎饪s時(shí)的穩(wěn)定性,本實(shí)驗(yàn)向5 mL甲醇中加入0.1 mL 1 mg/L的4種丁香酚類(lèi)麻醉劑混標(biāo)溶液,設(shè)定水浴溫度分別為25、30、35、40、45 ℃,氮吹濃縮至不足0.5 mL,使用初始流動(dòng)相定容至1 mL,測(cè)定各組分的回收率,結(jié)果示于圖5。結(jié)果表明,水浴溫度為25、30、35 ℃時(shí),4種丁香酚類(lèi)麻醉劑的平均回收率約為97%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)小于2.7%;而水浴溫度上升至45 ℃時(shí),平均回收率降至90%以下,這可能是由于部分丁香酚類(lèi)麻醉劑隨溫度升高揮發(fā)分解所致。為保證樣品回收率并縮短前處理時(shí)間,本研究采用35 ℃作為氮吹水浴溫度。

        圖4 不同體積甲醇洗脫丁香酚類(lèi)麻醉劑的回收率Fig.4 Recoveries of eugenol derivatives anesthetics correlated with the eluting volumes of methanol

        圖5 不同氮吹溫度下丁香酚類(lèi)麻醉劑的回收率Fig.5 Recoveries of eugenol derivatives anesthetics correlated with different temperatures of nitrogen blowing

        2.3 方法學(xué)考察

        2.3.1線性關(guān)系和定量限 在1~200 μg/L范圍內(nèi),4種丁香酚類(lèi)麻醉劑標(biāo)準(zhǔn)溶液的線性關(guān)系良好,相關(guān)系數(shù)R2大于0.996。以定量離子的10倍信噪比確定丁香酚、異丁香酚的定量限(LOQ)均為2.5 μg/kg,甲基丁香酚和甲基異丁香酚的定量限均為1.0 μg/kg,結(jié)果列于表2。

        2.3.2回收率和精密度 考察了4種丁香酚類(lèi)麻醉劑的加標(biāo)回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD),在2.5、5、25 μg/kg添加水平上,每個(gè)濃度設(shè)置6個(gè)平行樣品,同時(shí)設(shè)1個(gè)空白對(duì)照,結(jié)果列于表3。丁香酚類(lèi)麻醉劑的加標(biāo)回收率在77.6%~111.4%之間,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.7%~9.1%,可見(jiàn)該方法的準(zhǔn)確性和重現(xiàn)性較好,能夠滿足獸藥殘留分析要求。

        表2 丁香酚類(lèi)麻醉劑的線性范圍、線性相關(guān)系數(shù)、定量限Table 2 Linear ranges, correlation coefficients (R2), limits of quantification (LOQs) of eugenol derivatives anesthetics

        表3 水產(chǎn)品中丁香酚類(lèi)麻醉劑的加標(biāo)回收率和精密度Table 3 Recoveries and precision of eugenol derivatives anesthetics in aquatic products

        2.3.3基質(zhì)效應(yīng) 通過(guò)比較空白樣品提取液添加混標(biāo)溶液與純?nèi)軇?biāo)液的離子響應(yīng)強(qiáng)度[23],考察水產(chǎn)品中丁香酚類(lèi)麻醉劑的基質(zhì)效應(yīng)。設(shè)定基質(zhì)因子(matrix effect)%=基質(zhì)溶液中定量離子響應(yīng)值/純?nèi)軇┲卸侩x子響應(yīng)值,分別在2.5、50、200 μg/kg添加濃度下評(píng)價(jià)基質(zhì)效應(yīng),添加濃度2.5 μg/kg的鯽魚(yú)樣品MRM色譜圖示于圖6。當(dāng)基質(zhì)抑制目標(biāo)組分的響應(yīng)時(shí),基質(zhì)因子<100%;當(dāng)基質(zhì)增強(qiáng)目標(biāo)組分的響應(yīng)時(shí),基質(zhì)因子>100%;若不存在基質(zhì)效應(yīng),基質(zhì)因子=100%。結(jié)果表明,水產(chǎn)品基質(zhì)對(duì)4種丁香酚類(lèi)麻醉劑均產(chǎn)生一定程度的離子抑制,但在3個(gè)添加濃度下,基質(zhì)因子均在80%~100%之間,說(shuō)明所建立的固相萃取前處理方法的樣品凈化效果較好。

        2.4 實(shí)際樣品檢測(cè)

        采用本法檢測(cè)了隨機(jī)購(gòu)買(mǎi)的30份市售鮮活水產(chǎn)品(包括10份鯽魚(yú)、10份鳊魚(yú)、10份對(duì)蝦),所有樣品均未檢出丁香酚類(lèi)麻醉劑。

        圖6 2.5 μg/kg添加水平下的鯽魚(yú)樣品MRM色譜圖Fig.6 MRM chromatograms of standard addition concentration (2.5 μg/kg) of crucian samples

        3 結(jié)論

        本研究建立了固相萃取結(jié)合超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(UPLC-MS/MS)快速、同時(shí)測(cè)定水產(chǎn)品中4種丁香酚類(lèi)麻醉劑殘留量。樣品用正己烷提取,經(jīng)HLB固相小柱萃取凈化,以多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)正、負(fù)離子模式同時(shí)測(cè)定,實(shí)現(xiàn)了一次性同時(shí)測(cè)定水產(chǎn)品中4種丁香酚類(lèi)麻醉劑殘留。該方法操作簡(jiǎn)便、快捷、靈敏度高、穩(wěn)定性好,適用于水產(chǎn)品中丁香酚類(lèi)麻醉劑多殘留的快速定性和定量分析。

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