王紅鋼， 程會(huì)軍， 吳東棟， 王 軍， 劉正國(guó)， 吉愛(ài)玲， 李彥章

(河南大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院， 河南 開(kāi)封 475004)

慢性腎病是世界上一種普遍的疾病，腎小球?yàn)V過(guò)率逐漸降低和腎間質(zhì)纖維化，繼而發(fā)生腎衰竭是其重要特征，其中腎小管間質(zhì)纖維化是慢性腎病的主要決定因素，其發(fā)生于腎單位和集合管之間的間葉組織，是在損傷、阻塞和感染等因素作用下，成纖維細(xì)胞被激活并增殖，細(xì)胞外基質(zhì)過(guò)度聚集，腎小管上皮細(xì)胞凋亡以及轉(zhuǎn)分化等因素參與的病理過(guò)程，現(xiàn)已成為全球范圍內(nèi)的醫(yī)學(xué)難題[1]。

自噬是真核細(xì)胞中一種高度保守的生理過(guò)程，是細(xì)胞利用溶酶體降解和清除胞內(nèi)受損或衰老的細(xì)胞器以及功能異常的蛋白質(zhì)，并使降解產(chǎn)物循環(huán)使用，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)外環(huán)境穩(wěn)態(tài)的維持和細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖等正常生理過(guò)程[2-5]，其具體生理功包括：(1)清除受損的細(xì)胞，維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定；(2)調(diào)節(jié)固有免疫和適應(yīng)性免疫；(3)誘導(dǎo)細(xì)胞死亡；(4)參與延長(zhǎng)細(xì)胞壽命[6]。在生理?xiàng)l件下，自噬常常維持在一個(gè)基礎(chǔ)水平，在一定的外因誘導(dǎo)下可被增強(qiáng)，比如缺血、缺氧以及營(yíng)養(yǎng)缺乏等[7-8];在機(jī)體病理狀態(tài)下，顯著增強(qiáng)的細(xì)胞自噬可清除胞內(nèi)異常蛋白,有利于細(xì)胞生存。但自噬對(duì)細(xì)胞的作用是“雙刃劍”，若自噬持續(xù)維持在一個(gè)較高水平，則可導(dǎo)致細(xì)胞自噬性死亡[9-10]。自噬可依據(jù)待降解物傳遞給溶酶體的途徑分為巨自噬、微自噬和分子伴侶介導(dǎo)的自噬(胞漿蛋白直接進(jìn)入溶酶體降解)，其中巨自噬是目前研究最多的自噬[11]。近年來(lái)的研究顯示，細(xì)胞自噬對(duì)于維持合成、分解和細(xì)胞成分再利用的平衡有重要作用[12]，細(xì)胞自噬異常參與肝病、腫瘤、衰老、心血管疾病、神經(jīng)退行性疾病和腎臟疾病等病理過(guò)程的發(fā)生和發(fā)展[13]。

硫化氫(hydrogen sulfide，H2S)是一種無(wú)色、有臭雞蛋氣味的氣體，是繼一氧化碳(carbon monoxide,CO)和一氧化氮(nitric oxide,NO)之后第3類氣體信號(hào)分子，以前一直被認(rèn)為是有毒氣體，自上世紀(jì)90年代被發(fā)現(xiàn)其具有多種重要功能，可調(diào)控多種生理及病理過(guò)程[14-15]。在哺乳動(dòng)物的細(xì)胞中，H2S的主要在肝臟通過(guò)酶促反應(yīng)途徑和非酶促反應(yīng)途徑生成，以前者為主。酶促反應(yīng)途徑是以半胱氨酸為底物，在胱硫醚γ-裂解酶(cystathionine γ-lyase，CSE)、胱硫醚β-合成酶(cystathionine β-synthase，CBS)和3-巰基丙酮酸硫基轉(zhuǎn)移酶(3-mercaptopyruvate sulfurtransferase，3-MST)的催化下產(chǎn)生[16]。一般來(lái)說(shuō)，H2S在毫摩爾濃度范圍內(nèi)才顯現(xiàn)機(jī)體毒性，體內(nèi)生理水平的H2S(50～160 μmol/L)對(duì)人體具有抗氧化、抗炎和保護(hù)神經(jīng)等多種有益作用[17-18]，對(duì)細(xì)胞凋亡、物質(zhì)代謝、炎性損傷和氧化應(yīng)激等過(guò)程均有調(diào)節(jié)作用，比如外源性硫化氫可促進(jìn)非酒精性脂肪肝脂質(zhì)分解[19-21]。近年來(lái)的研究表明，H2S在阻塞性腎疾病中對(duì)機(jī)體具有的保護(hù)作用，可緩解腎組織纖維化的改變，但其作用機(jī)制還未完全搞清楚。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)構(gòu)建阻塞性腎損傷的單側(cè)輸尿管結(jié)扎(unilateral ureteral obstruction，UUO)模型，探討外源性硫化氫在小鼠UUO引起的腎纖維化過(guò)程中的作用及可能的機(jī)制，以期為研發(fā)H2S相關(guān)的藥物提供理論依據(jù)。

材 料 和 方 法

1 材料

1.1動(dòng)物及分組 C57BL/6 小鼠購(gòu)自南京大學(xué)模式動(dòng)物研究所，在室溫(22±2) ℃，濕度50%～70%,標(biāo)準(zhǔn)清潔級(jí)環(huán)境喂養(yǎng)，并模擬正常的晝夜交替。選取8周齡的健康雄性 C57BL/6 小鼠15只，隨機(jī)分為3組：假手術(shù)(sham)組、手術(shù)(operation)組和硫化氫處理(H2S)組。假手術(shù)組：腹腔內(nèi)注射戊巴比妥鈉麻醉后，剪開(kāi)腹腔左肋部皮膚一個(gè)小口，肌肉鈍性分離，然后分別縫合肌肉和皮膚；手術(shù)組：注射戊巴比妥鈉麻醉后，剪開(kāi)腹腔左肋部皮膚一個(gè)小口，肌肉鈍性分離，找到腎臟和輸尿管，在輸尿管上結(jié)扎兩道，在2個(gè)結(jié)扎點(diǎn)之間把輸尿管剪斷，然后分別縫合肌肉和皮膚；硫化氫處理組：按照手術(shù)組處理后，硫氫化鈉稱量后按合適的比例溶于生理鹽水中，按照劑量50 μmol/kg體重腹腔注射。假手術(shù)組和手術(shù)組每日腹腔注射同樣體積的生理鹽水，每天1次，1周后處死小鼠，取出左腎，從腎臟中央切開(kāi)，一部分放置入4%的中性甲醛中固定做切片，另一部分迅速放入液氮中冷處理后放入-80 ℃冰箱中冷藏，用于提取蛋白和RNA。

1.2主要試劑 TRIzol購(gòu)自Invitrogen;反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自TaKaRa；辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記的羊抗鼠/兔IgG和抗纖連蛋白(fibronectin,FN)抗體購(gòu)自北京中杉金橋生物公司；兔抗LC3和beclin-1抗體購(gòu)自Santa Cruz；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所。

2 方法

2.1RNA的提取 取50 mg的腎臟組織和l mL的TRIzol放在勻漿器中，研磨粉碎腎臟組織，室溫下裂解5 min，將液體轉(zhuǎn)移入EP管中，加入200 μL三氯甲烷，充分混勻，室溫放置2～3 min，12 000 r/min離心15 min。將上清吸至另1新的的EP管中，加入等體積的異丙醇，混合，室溫靜置10 min，然后4 ℃、12 000 r/min離心10 min，棄上清，加入1 mL預(yù)冷的75%乙醇洗滌，4 ℃、12 000 r/min 離心3 min，棄上清，白色沉淀即是RNA樣品,用50 μL的 RNase free水將RNA溶解，依據(jù)TaKaRa的反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行的反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。

2.2RT-PCR 反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA用于RT-PCR。PCR的反應(yīng)程序?yàn)?4 ℃預(yù)變性2 min;93 ℃變性30 s， 58 ℃退火45 s， 72 ℃延伸45 s,35個(gè)循環(huán)。CBS的上游引物為5’-TTATCACACAGTGCTGACCAAA-3’，下游引物為5’-TTCTCCATACTCATCTTCTCCG-3’；CSE的上游引物為5’-TTCCTGCCTAGTTTCCAGCAT-3’，下游引物為5’-GGAAGTCCTGCTTAAATGTGGTG-3’； 3-MST的上游引物為5’-TTCATCAAGACCCACGAGGACA-3’，下游引物為5’-TGGCCAGGTTCGATGCCATCTC-3’； 18S rRNA的上游引物為5’-AGAGTCGGCATCGTTTATGGTC-3’，下游引物為5’-CGAAAGCATTTGCCAAGAAT-3’。

2.3HE染色 將已放入蒸餾水后的切片放入蘇木精溶液中染色8 min，自來(lái)水沖洗2 min后蒸餾水浸泡1 min，在70%和90%乙醇中脫水各10 min，再放入乙醇伊紅染色液染色3 min。染色后的切片經(jīng)純乙醇脫水，再經(jīng)二甲苯處理使切片透明，將已透明的切片滴上樹(shù)膠，蓋上蓋玻片封固。顯微鏡下觀察。

2.4Masson染色 石蠟切片經(jīng)脫蠟處理后雙蒸水潤(rùn)濕玻片60 s，R1核染液染色50 s，然后迅速倒掉染色液，沖洗液沖洗40 s左右，R2細(xì)胞漿染液染色60 s，吸掉染液，沖洗液沖洗40 s左右，R3分色液分色10 min，吸掉分色液。不要用沖洗液沖洗，直接用R4復(fù)染液復(fù)染3～5 min，再吸掉復(fù)染液，在無(wú)水乙醇中洗干凈玻片，直至玻片無(wú)藍(lán)色為止，迅速吹干玻片，用甘油明膠進(jìn)行封片、做好玻片記號(hào)。光鏡下觀察以上各種染色的腎組織形態(tài)學(xué)變化，拍照記錄。

2.5血清中胱抑素C的檢測(cè) 使用肝素鈉潤(rùn)洗針管后抽取血液，將血放入EP管后在4 ℃條件下，1 000 r/min離心20 min，所得血漿使用免疫比濁法檢測(cè)，儀器為羅氏cobas? 8000全自動(dòng)生化免疫分析儀。

2.6Western blot實(shí)驗(yàn) 取30 mg的腎臟組織，PBS清洗細(xì)胞3遍，加入RIPA裂解液200 μL，勻漿器研磨后,用超聲波裂解，再在冰上裂解。然后在4 ℃、12 000 r/min離心10 min。取出上清液保存。取所得到的部分上清液加到PBS中稀釋混勻，按“BCA法測(cè)蛋白”步驟進(jìn)行蛋白定量,上樣50 μL，100 V電泳45～60 min，轉(zhuǎn)膜后取出PVDF膜，用TBS清洗10～15 min。 I 抗用含脫脂奶粉的TBST稀釋(1∶1 000)，室溫孵育2 h， TBST緩沖液洗PVDF膜3次，每次10 min，加入 II 抗(1∶1 000稀釋，HRP標(biāo)記)室溫孵育2 h， TBST緩沖液洗PVDF膜3次，每次10 min，加入顯色液照相保存結(jié)果。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用Prism 5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，采用t檢驗(yàn)分析2組均數(shù)間的差異，采用單因素方差分析檢驗(yàn)3組和3組以上均數(shù)間的差異，以P<0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 UUO對(duì)催化內(nèi)源性H2S產(chǎn)生的酶mRNA表達(dá)的影響

RT-PCR結(jié)果表明，UUO手術(shù)后，催化內(nèi)源性H2S產(chǎn)生的CBS、CSE和3-MST mRNA表達(dá)均顯著降低(P<0.05)，見(jiàn)圖1。

2 外源性H2S減輕UUO模型腎臟結(jié)構(gòu)損傷

假手術(shù)組小鼠左側(cè)腎臟組織HE染色結(jié)果顯示,腎臟結(jié)構(gòu)完整，各個(gè)細(xì)胞形態(tài)正常；手術(shù)組小鼠腎小管之間出現(xiàn)有明顯的間隙，腎組織中可見(jiàn)到明顯的間質(zhì)水腫，大量上皮細(xì)胞壞死，管腔明顯擴(kuò)張，腎小球萎縮;H2S組小鼠左側(cè)腎臟組織間質(zhì)輕度水腫，部分管腔擴(kuò)張，與手術(shù)組小鼠相比，腎小管間的間隙減小，腎組織病理變化顯著改善，見(jiàn)圖2。

3 外源性H2S對(duì)UUO模型小鼠腎功能損傷有保護(hù)作用

手術(shù)組小鼠血漿胱抑素C顯著高于假手術(shù)組，而給予外源性H2S則可顯著降低血漿胱抑素C水平(P<0.05)，見(jiàn)圖3。

4 外源性H2S減輕UUO小鼠腎臟纖維化

假手術(shù)組小鼠腎臟Masson染色切片顯示腎臟結(jié)構(gòu)完整，間質(zhì)有少許藍(lán)色膠原纖維；手術(shù)組腎臟Masson染色切片顯示腎小管之間出現(xiàn)有明顯的間隙，存在大量染色成藍(lán)色的膠原纖維，提示腎間質(zhì)顯著纖維化；H2S組腎組織Masson染色切片顯示腎小管之間可見(jiàn)染成藍(lán)色的膠原纖維，與手術(shù)組相比顯著減少，見(jiàn)圖4。

5 外源性H2S下調(diào)UUO小鼠腎臟中FN的蛋白表達(dá)

Western blot 結(jié)果顯示，與假手術(shù)組相比，手術(shù)組和H2S組腎組織中FN的蛋白表達(dá)顯著升高；與手術(shù)組相比，H2S組腎組織中FN的蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05)，見(jiàn)圖5。

6 外源性H2S上調(diào)UUO小鼠腎臟細(xì)胞自噬水平

Western blot結(jié)果顯示,與假手術(shù)組相比，手術(shù)組和H2S組小鼠腎組織細(xì)胞中LC3-II和beclin-1蛋白表達(dá)均顯著增高，而H2S組小鼠腎組織細(xì)胞中LC3-II和beclin-1蛋白表達(dá)又顯著高于手術(shù)組，提示外源性H2S可通過(guò)上調(diào)細(xì)胞自噬水平而減輕UUO小鼠腎臟組織纖維化，見(jiàn)圖6。

Figure 1. The effect of UUO on the mRNA expression of the catalytic enzymes of endogenous H2S. Mean±SD.n=3.△P<0.05vssham group.

圖1UUO對(duì)催化內(nèi)源性H2S產(chǎn)生酶的mRNA表達(dá)的影響

Figure 2. The exogenous H2S mitigated renal injury in UUO mice (HE staining).

圖2外源性H2S減輕UUO模型小鼠腎臟結(jié)構(gòu)損傷

Figure 3. The effect of exogenous H2S on the changes of cystatin C content in the plasma. Mean±SD.n=3.△P<0.05vssham group;*P<0.05vsoperation group.

圖3外源性H2S對(duì)血漿胱抑素C含量的影響

討 論

UUO模型是阻塞性腎病腎小管間質(zhì)纖維化的一個(gè)典型的模型，體現(xiàn)了阻塞性腎損傷的典型特征，已被應(yīng)用于多個(gè)研究，可快速地形成阻塞性腎病，但腎臟輸尿管完全阻塞在人體鮮見(jiàn)，這是UUO模型的不足之處[22]。本研究中手術(shù)組小鼠腎小管之間出現(xiàn)有明顯的間隙，腎組織中可見(jiàn)到明顯的間質(zhì)水腫；大量上皮細(xì)胞壞死，管腔明顯擴(kuò)張；腎小球萎縮以及腎小球?yàn)V過(guò)率顯著下降，提示UUO構(gòu)建成功，經(jīng)H2S處理后，腎組織間質(zhì)水腫，管腔擴(kuò)張和間質(zhì)纖維化等均明顯改善，提示H2S對(duì)阻塞性腎損傷有保護(hù)作用。胱抑素C廣泛存在于哺乳動(dòng)物各組織器官中，因其僅能夠經(jīng)腎小球?yàn)V過(guò)而排出體外，故胱抑素C可作為反映腎小球?yàn)V過(guò)率變化的內(nèi)源性標(biāo)志，也是臨床上用于檢測(cè)腎小球早期受損以及評(píng)價(jià)腎功能的內(nèi)源性分子。本實(shí)驗(yàn)UUO建模后小鼠血漿胱抑素C顯著升高，給予外源性H2S則可顯著降低血漿胱抑素C水平，提示外源性H2S對(duì)阻塞性腎損傷有保護(hù)作用。

Figure 4. The exogenous H2S attenuated renal fibrosis in UUO mice (Masson staining).

圖4外源性H2S減輕UUO模型小鼠腎臟纖維化

Figure 5. The exogenous H2S down-regulated the protein expression of fibronectin (FN). Mean±SD.n=3.**P<0.01vssham group;△P<0.05vsoperation group.

圖5外源性H2S下調(diào)纖維連接蛋白的表達(dá)

H2S是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一種具有重要的機(jī)體保護(hù)作用的氣體信號(hào)分子。研究表明，H2S可通過(guò)影響細(xì)胞自噬發(fā)揮抗組織纖維化的作用，在鼠腎小球內(nèi)皮細(xì)胞中，高糖可下調(diào)AMP活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)的磷酸化，抑制自噬，導(dǎo)致細(xì)胞基質(zhì)蛋白過(guò)度沉積，引起腎小球基質(zhì)重塑增生，而給予外源性H2S則可通過(guò)促進(jìn)AMPK磷酸化，上調(diào)細(xì)胞自噬水平，抑制細(xì)胞基質(zhì)蛋白合成并促進(jìn)其降解和清除，從而改善高糖導(dǎo)致的基質(zhì)纖維化[23]；高糖還可減少鼠內(nèi)源性H2S的產(chǎn)生，激活細(xì)胞自噬，抑制PI3K/Akt1途徑，誘導(dǎo)心肌發(fā)生纖維化改變，而給予外源性H2S則可逆轉(zhuǎn)上述變化，對(duì)糖尿病心肌具有保護(hù)作用[24]。在小鼠酒精性心肌纖維化過(guò)程中，H2S可通過(guò)下調(diào)miR-21和miR-211的表達(dá)，調(diào)節(jié)PI3K/Akt1和TGF-β1信號(hào)途徑，抑制細(xì)胞自噬，緩解乙醇所致的心肌纖維化[25]。而H2S在阻塞性腎損傷導(dǎo)致的纖維化過(guò)程中的作用及機(jī)制還未見(jiàn)報(bào)道。FN是1974年發(fā)現(xiàn)的一種高分子量糖蛋白，和腎臟纖維化緊密相關(guān)，是評(píng)估組織纖維化水平的一個(gè)指標(biāo)；LC3-II和beclin-1是細(xì)胞自噬水平的蛋白標(biāo)志物，其蛋白表達(dá)量和細(xì)胞自噬強(qiáng)弱呈正相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，和假手術(shù)組相比，手術(shù)組腎組織中FN、LC3-II和beclin-1的蛋白表達(dá)顯著升高，給予外源性H2S后的腎組織中FN蛋白表達(dá)顯著降低，LC3-II和beclin-1的蛋白表達(dá)又顯著升高，提示外源性H2S可顯著改善阻塞性腎損傷引起的腎間質(zhì)纖維化，其機(jī)制可能是通過(guò)上調(diào)細(xì)胞自噬水平實(shí)現(xiàn)的，此推測(cè)還需后續(xù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步論證。

Figure 6. The exogenous H2S up-regulated the autophagy of renal cells in UUO mice. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vssham group;△P<0.05vsoperation group.

圖6外源性H2S上調(diào)UUO模型小鼠腎臟細(xì)胞自噬水平