尉杰忠， 閆玉清， 谷青芳， 余鴻強(qiáng), ， 郭敏芳， 劉春云， 宋國(guó)斌， 柴 智， 王 青， 肖保國(guó)， 張漢霆， 降雨強(qiáng)， 馬存根△

(1山西大同大學(xué)腦科學(xué)研究所， 山西 大同 037009； 2中國(guó)科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所分子發(fā)育生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 北京 100101； 3山西中醫(yī)藥大學(xué)神經(jīng)生物學(xué)研究中心， 山西 太原 030024； 4復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院神經(jīng)病學(xué)研究所， 上海 200025； 5西弗吉尼亞大學(xué)健康科學(xué)中心行為醫(yī)學(xué)與精神病學(xué)系及生理學(xué)、藥理學(xué)與神經(jīng)科學(xué)系， 美國(guó) 西弗吉尼亞州 摩根城 26506)

阿爾茨海默病(Alzheimer disease，AD)是常見(jiàn)的老年性中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system, CNS)變性疾病。在我國(guó)隨著老齡化社會(huì)的到來(lái)，AD患者迅猛增加，2000年為371萬(wàn)，2010年為569萬(wàn)，到2015年增加到950萬(wàn)[1]，AD已成為越來(lái)越嚴(yán)峻的威脅老年健康的重大疾病。目前AD 發(fā)病的細(xì)胞分子機(jī)制尚未闡明，但AD的基本病理特征中神經(jīng)元變性丟失，特別是膽堿能神經(jīng)元變性是AD 形成的基本病理特征，而神經(jīng)元內(nèi)Tau 蛋白過(guò)度磷酸化導(dǎo)致神經(jīng)原纖維纏結(jié)(neurofibrillary tangles, NFT)可能是膽堿能神經(jīng)元變性的實(shí)質(zhì)原因[2]。因此，在AD的治療策略中繞過(guò)復(fù)雜的致病信號(hào)通路和分子機(jī)制，直接修復(fù)受損的膽堿能神經(jīng)元或促進(jìn)神經(jīng)再生不失為一種保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞，并有效干預(yù)AD病理過(guò)程的治療策略和藥物研究思路。

神經(jīng)再生一方面指神經(jīng)細(xì)胞的修復(fù)、神經(jīng)突觸的再生和重建，另一方面指神經(jīng)干細(xì)胞的動(dòng)員、增殖和分化。通過(guò)神經(jīng)再生重建神經(jīng)細(xì)胞之間的突觸聯(lián)系，實(shí)現(xiàn)神經(jīng)再支配，從而使認(rèn)知功能得以恢復(fù)[3]。因此，神經(jīng)細(xì)胞的修復(fù)、突觸重建連接和內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞再生補(bǔ)充成為改善AD基本病理特征的必要結(jié)構(gòu)和條件。然而，在AD的中樞神經(jīng)系統(tǒng)病理狀態(tài)下，β-淀粉樣蛋白(amyloid β-protein，Aβ)形成神經(jīng)毒性最強(qiáng)的寡聚體導(dǎo)致神經(jīng)損傷變性丟失，使得神經(jīng)細(xì)胞修復(fù)再生難以實(shí)現(xiàn)，歸結(jié)其原因?yàn)橐韵聨讉€(gè)方面：(1)長(zhǎng)期病理?xiàng)l件下受損的神經(jīng)細(xì)胞生長(zhǎng)很不穩(wěn)定，損傷后自身修復(fù)能力很弱，極易發(fā)生神經(jīng)細(xì)胞的凋亡和死亡[4]；(2)神經(jīng)細(xì)胞損傷繼發(fā)微環(huán)境中產(chǎn)生神經(jīng)突觸再生抑制蛋白(如Nogo-A、MAG和OMgp等)，抑制神經(jīng)突觸再生，破壞神經(jīng)細(xì)胞之間的突觸聯(lián)系，造成神經(jīng)功能逐漸缺失[5]；(3)神經(jīng)損傷后CNS自身動(dòng)員內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞增殖、神經(jīng)元分化和神經(jīng)元突觸形成的能力有限，導(dǎo)致新生神經(jīng)元沒(méi)有及時(shí)補(bǔ)充更新[6]。

Rho/Rho激酶(Rho kinase,ROCK)信號(hào)通路對(duì)細(xì)胞的增殖分裂和生長(zhǎng)遷移等生物活動(dòng)具有重要的調(diào)節(jié)作用。大量研究表明諸多神經(jīng)系統(tǒng)疾病均涉及ROCK的異常激活，從不同的層面影響疾病發(fā)生和發(fā)展[7-8]。ROCK一方面可以調(diào)節(jié)Aβ1-42的產(chǎn)生，抑制ROCK可減少Aβ1-42的產(chǎn)生，增加可溶性淀粉樣前體蛋白(amyloid precursor protein, APP)或Aβ1-42的前體[9-10]; 另一方面ROCK激活使腦衰蛋白反應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白2(collapsin response mediator protein-2,CRMP-2)磷酸化，阻礙微管蛋白組裝，參與神經(jīng)突觸生長(zhǎng)抑制[11]。研究顯示抑制ROCK可增加海馬錐體神經(jīng)元突觸密度和長(zhǎng)度，促進(jìn)神經(jīng)突觸再生，改善空間學(xué)習(xí)和工作記憶[12]。我們的前期研究也證實(shí)應(yīng)用ROCK抑制劑鹽酸法舒地爾(fasudil)可減輕Aβ1-42在腦內(nèi)的沉積，減輕免疫炎性反應(yīng)，恢復(fù)神經(jīng)功能，改善AD疾病模型淀粉樣前體蛋白/早老素1雙轉(zhuǎn)基因(amyloid precursor protein/presenilin 1 double transgenic，APP/PS1 Tg)小鼠空間記憶和學(xué)習(xí)能力[13]。Fasudil可以促進(jìn)中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)細(xì)胞突觸再生、生長(zhǎng)錐再建和神經(jīng)功能恢復(fù)[14-15]。

體外研究已經(jīng)顯示，ROCK抑制劑或shRNA介導(dǎo)的ROCK基因沉默均能促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞增殖、分化為功能性神經(jīng)元，并可降低神經(jīng)干細(xì)胞分化后細(xì)胞的凋亡率[16]。我們前期體內(nèi)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)fasudil 可促進(jìn)體內(nèi)神經(jīng)干細(xì)胞動(dòng)員和膽堿能神經(jīng)元分化[17]。體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，fasudil可促進(jìn)原代神經(jīng)干細(xì)胞小球形成并增殖，促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞向Tuj-1+神經(jīng)細(xì)胞分化。本研究的目的是在我們前期系列研究的基礎(chǔ)上進(jìn)一步證實(shí)應(yīng)用ROCK抑制劑是否對(duì)APP/PS1 Tg小鼠神經(jīng)再生(包括神經(jīng)細(xì)胞突觸修復(fù)及神經(jīng)干細(xì)胞動(dòng)員、增殖)有促進(jìn)作用，為臨床應(yīng)用ROCK抑制劑的神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)作用治療AD開(kāi)辟新的治療策略和藥物研發(fā)思路。

材 料 和 方 法

1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

雄性8 月齡APP/PS1 Tg小鼠20只(購(gòu)自南京大學(xué)模式動(dòng)物研究所,動(dòng)物合格證編號(hào)為2009002302753),表達(dá)瑞典突變型人695(human 695 with Swedish mutation，HuAPP695swe)和突變型人早老素1δE9(mutant human presenilin 1 deltaE9，PS1-dE9)，隨機(jī)分為fasudil干預(yù)組(fasudil組，25 mg·kg-1·d-1，參照早期實(shí)驗(yàn)的濃度和劑量[13]，n=10)和生理鹽水組(NS組，9 g/L NaCl，n=10)，以同窩同性別野生型C57BL/6小鼠作為正常對(duì)照組(WT組，n=10)，干預(yù)療程為2個(gè)月。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均按照國(guó)際實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)理事會(huì)的指導(dǎo)方針執(zhí)行，按照國(guó)際動(dòng)物實(shí)驗(yàn)委員會(huì)有關(guān)的規(guī)章制度進(jìn)行，山西大同大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)在山西大同大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(25 ℃左右，相對(duì)濕度40%，屏障環(huán)境)，普通小鼠飼料喂養(yǎng)。

2 主要實(shí)驗(yàn)試劑和儀器

鹽酸法舒地爾注射液(商品名: 川威)購(gòu)自天津紅日藥業(yè)股份有限公司；兔抗小鼠phospho-APP (Thr668) 抗體、兔抗小鼠phospho-Tau (Ser396)抗體、兔抗小鼠PSD-95抗體和大鼠抗小鼠nestin抗體購(gòu)自Cell Signaling Technology；兔抗小鼠膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶(choline acetyltransferase,ChAT)抗體購(gòu)自Abcam；辣根過(guò)氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)標(biāo)記的山羊抗大鼠IgG和HRP的標(biāo)記山羊抗兔IgG購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司；Western blot試劑盒購(gòu)自Bio-Rad。

Morris水迷宮(Morris water maze，MWM)裝置及SMART 3.0軟件購(gòu)自深圳瑞沃德生命科技有限公司；ChemiDoc XRS+凝膠成像分析儀購(gòu)自Bio-Rad;BX51型熒光顯微鏡購(gòu)自O(shè)lympus；CM1950冰凍切片機(jī)購(gòu)自Leica。

3 方法

3.1MWM實(shí)驗(yàn) 采用國(guó)際通用的MWM實(shí)驗(yàn)來(lái)訓(xùn)練和測(cè)評(píng)小鼠空間學(xué)習(xí)和認(rèn)知功能。水迷宮為直徑90 cm、高50 cm的圓形水池，水池上方設(shè)置攝像頭，確保整個(gè)迷宮都在攝像頭視野內(nèi)，觀察并記錄小鼠的運(yùn)動(dòng)軌跡等參數(shù)。調(diào)節(jié)水溫在25 ℃左右，水池內(nèi)用無(wú)毒白色素調(diào)和，使池水不透明，水池置于安靜、溫和光照的房間，水池壁露出水面的部分隨機(jī)位置黏貼4幅黑色圖案(用于動(dòng)物在MWM中參考定位)。水迷宮通過(guò)SMART 3.0軟件分為4個(gè)象限：西北(northwest，NW)象限、東北(northeast，NE)象限、西南(southwest，SW)象限和東南(southeast，SE)象限，每個(gè)象限又分為內(nèi)區(qū)和外區(qū)，共有8個(gè)區(qū)域。訓(xùn)練階段在SW 象限的內(nèi)區(qū)放置一個(gè)5.0×5.0 cm的圓形平臺(tái)，平臺(tái)暴露于水面以上2.5 cm，訓(xùn)練小鼠從入水點(diǎn)(保持入水位置相同)尋找到并爬上平臺(tái)，每天1次，共進(jìn)行6次訓(xùn)練，每次時(shí)長(zhǎng)60 s，如果訓(xùn)練期間小鼠未找到平臺(tái)，則人為引導(dǎo)小鼠到達(dá)平臺(tái)，并在平臺(tái)停留20 s。檢測(cè)階段：訓(xùn)練結(jié)束后，平臺(tái)位置不變，置于水面以下2.5 cm，同訓(xùn)練程序，進(jìn)行6次認(rèn)知功能測(cè)定，通過(guò)攝像頭跟蹤小鼠運(yùn)動(dòng)軌跡， SMART 3.0軟件系統(tǒng)記錄運(yùn)動(dòng)時(shí)間和距離的指標(biāo)，包括：(1)動(dòng)物從入水點(diǎn)到達(dá)平臺(tái)位置的時(shí)間(latency to target)；(2)動(dòng)物在平臺(tái)所在象限(SW)活動(dòng)時(shí)間占總活動(dòng)時(shí)間的比例[time in SW (%)]；(3)動(dòng)物在平臺(tái)所在象限游泳的距離占總路徑距離的比例[distance in SW (%)]。繪制運(yùn)動(dòng)軌跡圖。

3.2免疫熒光組織化學(xué)染色法檢測(cè)小鼠腦組織p-Tau、ChAT、BrdU和nestin的蛋白表達(dá)和分布 各組動(dòng)物采用腹腔注射0.1 kg/L水合氯醛(每只200 μL)進(jìn)行常規(guī)麻醉。麻醉穩(wěn)妥后，開(kāi)胸暴露心臟，用0.1 mol/L PBS灌注左心室，同時(shí)剪破右心耳，灌流至肝臟變白，換用4%多聚甲醛心臟灌注固定。冰上快速分離腦組織，10%、20%和30%梯度蔗糖脫水，OCT包埋。液氮下制備組織塊，用冰凍切片機(jī)切片，厚度為10 μm，-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。免疫熒光組織化學(xué)染色時(shí)，切片置于室溫徹底干燥，0.1 mol/L PBS浸洗5 min，3次，10%牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)封閉1 h， 10% BSA聯(lián)合0.03% Triton室溫作用30 min；分別孵育兔抗小鼠p-Tau抗體(1∶500)、兔抗小鼠ChAT抗體(1∶400)和兔抗小鼠PSD-95抗體(1∶800)等抗體，4 ℃濕盒過(guò)夜；洗滌后，孵育對(duì)應(yīng)的Alexa Fluor? 488標(biāo)記的山羊抗兔 II 抗或Alexa Fluor? 555標(biāo)記的山羊抗大鼠 II 抗(1∶1 000)，避光室溫下孵育2 h；50%甘油封片，熒光顯微鏡觀察蛋白表達(dá)和分布。

3.3Western blot法檢測(cè)小鼠腦組織p-APP(Thr668)和p-Tau(Ser396)的蛋白水平 腦組織取材同上，在冰上用組織研磨器充分裂解腦組織(按照10 mg 腦組織配比100 μL裂解液)，高速離心提取蛋白，BCA法測(cè)定蛋白含量，調(diào)整各組蛋白質(zhì)含量相同，加入上樣緩沖液，100 ℃水浴中變性10 min。通過(guò)10% SDS-PAGE分離各組蛋白提取物，轉(zhuǎn)移至0.2 μm聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride，PVDF)膜。4 ℃冰箱孵育兔抗小鼠p-APP (Thr668)抗體(1∶1 000)、兔抗小鼠p-Tau(Ser396)抗體(1∶1 000)和兔抗小鼠ChAT抗體(1∶1 000);次日加HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG II 抗(1∶10 000)，室溫孵2 h；TBST洗膜，通過(guò)凝膠成像分析儀的Image Lab 5.0軟件操作曝光成像并測(cè)定吸光度(A)，以A目的蛋白/Aβ-actin的比值表示目的蛋白相對(duì)表達(dá)水平。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)被重復(fù)測(cè)3次，數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism 5.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理。計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。組間比較采用Bonferroni校正的t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)前先進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANOVA)以確定是否存在整體統(tǒng)計(jì)學(xué)變化。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 Fasudil改善APP/PS1 Tg小鼠認(rèn)知功能

與WT組相比，NS組的latency to target明顯增加，而time in SW (%)和distance in SW (%)明顯減少(P<0.01)，見(jiàn)圖1，說(shuō)明AD動(dòng)物模型成功，認(rèn)知功能較WT組下降。

Figure 1. The spatial learning of the mice in each group tested by Morris water maze (MWM). A: the typical trajectory diagram of the mice in each group; B: the corresponding parameters of MWM were recorded in the retention test session, representing the time and distance spent by animals from the starting site onto the platform or SW zone. Mean±SD.n=10.*P<0.05,**P<0.01vsNS group．

圖1各組小鼠空間認(rèn)知功能的MWM測(cè)試

在fasudil組，應(yīng)用fasudil連續(xù)2個(gè)月治療的AD模型動(dòng)物認(rèn)知功能明顯較NS組改善，latency to target時(shí)間縮短，而time in SW (%)和distance in SW(%)明顯提高(P<0.05)，見(jiàn)圖1。這一結(jié)果提示fasudil可改善AD疾病模型APP/PS1 Tg小鼠的認(rèn)知功能。

2 Fasudil明顯減少p-Tau、增加p-APP在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的蛋白水平

免疫熒光組織化學(xué)染色顯示，p-Tau在10月齡APP/PS1 Tg小鼠的海馬齒狀回、CA3區(qū)和大腦皮層呈散在分布，形狀不規(guī)則,與WT組相比，NS組上述腦區(qū)p-Tau的蛋白水平明顯增加,見(jiàn)圖2；Western blot分析提示，NS組腦內(nèi)的p-Tau 蛋白水平均高于WT組(P<0.05),見(jiàn)圖3。通過(guò)fasudil治療后APP/PS1 Tg小鼠上述腦區(qū)p-Tau的蛋白水平明顯較NS組減少, Western blot檢測(cè)提示，fasudil組腦內(nèi)的p-Tau 蛋白水平較NS組明顯下降(P<0.01),見(jiàn)圖2、3。另外，fasudil治療促進(jìn)小鼠腦內(nèi)p-APP蛋白水平增加(P<0.05)，增加可溶性APP可能間接導(dǎo)致腦內(nèi)寡聚體Aβ的減少，見(jiàn)圖3。

Figure 2. The phosphorylation of Tau protein in hippocampal dentate gyrus, hippocampal CA3 area and cerebral cortex of the mice in the three groups detected by immunohistochemistry (×40).

圖2小鼠海馬齒狀回、CA3區(qū)和大腦皮層的p-Tau蛋白水平和分布

Figure 3. The protein levels of p-Tau and p-APP in the brain tissues of the mice in the three groups determined by Western blot．Mean±SD．n=3.*P<0.05,**P<0.01vsNS group.

圖3Westernblot法檢測(cè)各組小鼠腦內(nèi)p-Tau和p-APP的蛋白水平

3 Fasudil促進(jìn)海馬膽堿能神經(jīng)元再生

ChAT是催化乙酰膽堿合成的酶，表達(dá)在膽堿能神經(jīng)元中，ChAT的檢測(cè)常被作為膽堿能神經(jīng)元的標(biāo)志物，膽堿能神經(jīng)元形態(tài)和數(shù)量的變化用于反映AD的認(rèn)知功能水平[18]。免疫熒光組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，10月齡APP/PS1 Tg小鼠(NS組)的海馬齒狀回ChAT的表達(dá)較WT組減少，神經(jīng)元軸突明顯縮短，部分神經(jīng)元的形態(tài)不完整;通過(guò)2個(gè)月的fasudil治療后，fasudil組的APP/PS1 Tg小鼠海馬齒狀回膽堿能神經(jīng)元(ChAT+/BrdU+)數(shù)量較NS組增多,而且膽堿能神經(jīng)元的軸突長(zhǎng)度明顯較NS組延長(zhǎng)，恢復(fù)部分膽堿能神經(jīng)元的形態(tài),見(jiàn)圖4。Western blot分析也證實(shí)，fasudil組腦內(nèi)ChAT蛋白水平明顯較NS組上升(P<0.01),見(jiàn)圖5。

Figure 4. The expression of ChAT in hippocampal dentate gyrus of the mice in the three groups detected by immunohistochemistry(×40).

圖4小鼠海馬齒狀回膽堿能神經(jīng)元ChAT的表達(dá)

Figure 5. The protein levels of ChAT in the brain tissues of the mice in the three groups determined by Western blot. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsNS group．

圖5Westernblot法檢測(cè)各組小鼠腦內(nèi)ChAT蛋白水平

4 Fasudil促進(jìn)海馬齒狀回顆粒下區(qū)(subgranular zone,SGZ)和腦室下區(qū)(subventricular zone,SVZ)內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞增殖

成體小鼠腦內(nèi)神經(jīng)干細(xì)胞發(fā)生主要在大腦的SVZ和SGZ 2個(gè)區(qū)域[19]。成體神經(jīng)干細(xì)胞的動(dòng)員和發(fā)生主要參與了大腦的可塑性、學(xué)習(xí)與記憶[20-22]。首先我們觀察了各組SVZ和SGZ細(xì)胞增殖(BrdU+細(xì)胞)情況，免疫熒光組織化學(xué)染色結(jié)果顯示在NS組小鼠腦SVZ和SGZ細(xì)胞增殖較WT組明顯減少，而fasudil組在上述2個(gè)腦區(qū)有大量細(xì)胞增殖，見(jiàn)圖6。為了進(jìn)一步確認(rèn)增殖的細(xì)胞類(lèi)型，我們檢測(cè)了SVZ nestin和BrdU的表達(dá)情況，免疫熒光組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，在小鼠腦SVZ，NS組nestin+BrdU+細(xì)胞較WT組減少，而fasudil組較NS組明顯增多，見(jiàn)圖7。上述結(jié)果證實(shí)，fasudil在SGZ和SVZ這2個(gè)腦內(nèi)神經(jīng)干細(xì)胞發(fā)生區(qū)域?qū)?nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞增殖有積極的促進(jìn)作用。

Figure 6. The number of BrdU+cells in brain subgranular zone (SGZ) and subventricular zone (SVZ) of the mice in the three groups detected by immunohistochemistry (×40). Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vsNS group．

圖6小鼠腦內(nèi)SGZ和SVZBrdU+細(xì)胞的數(shù)量

Figure 7. The number of nestin+BrdU+proliferating neural stem cells in brain SVZ of the mice in the three groups detected by immunohistochemistry (×40). Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vsNS group．

圖7各組小鼠腦內(nèi)SVZnestin+BrdU+增殖的神經(jīng)干細(xì)胞的數(shù)量

討 論

目前AD的病理機(jī)制尚未完全闡明，AD的治療仍缺乏有效藥物。已獲批準(zhǔn)的用于防治AD的藥物包括乙酰膽堿酯酶抑制劑(如多奈哌齊、利斯的明)及NMDA受體拮抗劑(如美金剛)等只能延緩認(rèn)知功能進(jìn)行性障礙的癥狀，但不能影響整個(gè)疾病的進(jìn)展。AD理想的治療是希望從根本上阻斷神經(jīng)元繼續(xù)變性死亡或者修復(fù)正在損害的神經(jīng)元，甚至動(dòng)員神經(jīng)干細(xì)胞的潛力及時(shí)補(bǔ)充丟失的神經(jīng)元，促進(jìn)突觸重塑，恢復(fù)記憶，從而達(dá)到真正意義上的治療[23]。AD的病因雖然不清晰，但最為明顯的病理特征是前腦基底核內(nèi)膽堿能神經(jīng)元的變性和丟失，這些核團(tuán)聚集腦內(nèi)90%以上的膽堿能神經(jīng)元。盡管神經(jīng)元變性丟失的原因很多，如膽堿能學(xué)說(shuō)、β-淀粉樣蛋白瀑布學(xué)說(shuō)、泛素-蛋白酶體系統(tǒng)失衡、神經(jīng)血管和氧化應(yīng)激學(xué)說(shuō)等[24]，但目前仍缺乏普遍的共識(shí)。其中Tau 蛋白學(xué)說(shuō)是一個(gè)重要的學(xué)說(shuō)，過(guò)度磷酸化的Tau 蛋白影響了膽堿能神經(jīng)細(xì)胞骨架的微管蛋白的穩(wěn)定結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致p-Tau在神經(jīng)細(xì)胞沉積形成NFT，破壞神經(jīng)細(xì)胞及神經(jīng)突觸的正常功能，發(fā)生神經(jīng)元變性丟失。了解AD神經(jīng)變性的細(xì)胞和分子基礎(chǔ)，尋找有效干預(yù)AD的策略是臨床神經(jīng)科學(xué)迫切需要解決的現(xiàn)實(shí)問(wèn)題。

Rho/ROCK信號(hào)通路是調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架微管蛋白重要的信號(hào)通路，ROCK也是細(xì)胞骨架中肌動(dòng)蛋白的關(guān)鍵成分絲氨酸/蘇氨酸激酶。越來(lái)越多的研究開(kāi)始關(guān)注ROCK在神經(jīng)細(xì)胞中調(diào)控神經(jīng)突觸生長(zhǎng)抑制、神經(jīng)軸突再生等涉及神經(jīng)細(xì)胞骨架的細(xì)胞分子機(jī)制[25]。激活ROCK導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞生長(zhǎng)錐萎縮和軸突抑制，而抑制ROCK可減輕多種原因?qū)е碌纳窠?jīng)損傷，促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞的存活和神經(jīng)突起的延長(zhǎng)[26]。法舒地爾是一種具有水溶性和脂溶性基團(tuán)、易溶于水、可自由通過(guò)血-腦屏障的小分子化合物，通過(guò)與ATP競(jìng)爭(zhēng)ROCK催化區(qū)的ATP結(jié)合位點(diǎn)而阻斷ROCK的活性。在本研究中，應(yīng)用ROCK抑制劑fasudil持續(xù)2個(gè)月的療程治療8月齡的APP/PS1 Tg小鼠，觀察fasudil對(duì)APP/PS1 Tg小鼠認(rèn)知功能、CNS內(nèi)海馬和皮層p-Tau蛋白表達(dá)的影響。通過(guò)MWM測(cè)試和SMART 3.0軟件系統(tǒng)分析，fasudil治療組較NS組動(dòng)物到達(dá)平臺(tái)位置的時(shí)間縮短，在平臺(tái)所在象限活動(dòng)時(shí)間和距離比例均增加，證實(shí)fasudil可改善APP/PS1 Tg小鼠空間認(rèn)知功能。進(jìn)一步的細(xì)胞分子研究發(fā)現(xiàn)，fasudil促進(jìn)APP/PS1 Tg小鼠CNS中p-Tau 蛋白水平下調(diào)，通過(guò)增加p-APP蛋白(可溶性APP)水平，間接減少腦內(nèi)Aβ的沉積。本研究觀察fasudil的這些調(diào)控機(jī)制可能是改善APP/PS1 Tg小鼠認(rèn)知功能障礙的原因之一。目前，fasudil已經(jīng)是臨床中獲批使用的擴(kuò)血管藥物，主要用于防治蛛網(wǎng)膜下腔出血后血管痙攣，這種通過(guò)血管擴(kuò)張作用，增加局部腦流量進(jìn)而改善APP/PS1 Tg小鼠認(rèn)知功能的作用還需后期研究，進(jìn)一步觀察和探討。

在AD的中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后，由于微環(huán)境中神經(jīng)生長(zhǎng)刺激因子的缺乏和多種神經(jīng)突觸再生抑制蛋白(如Nogo-A、MAG 或OMgp等)的存在，導(dǎo)致ROCK的活化[27]，引起肌球蛋白輕鏈磷酸化，致使肌球蛋白收縮，從而改變神經(jīng)細(xì)胞骨架動(dòng)力學(xué)，導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞生長(zhǎng)錐的脫落和突觸再生抑制，使神經(jīng)的再生過(guò)程被阻斷[25]。本研究觀察到，10月齡APP/PS1 Tg小鼠的海馬區(qū)表達(dá)ChAT的膽堿能神經(jīng)元明顯較WT組減少，神經(jīng)元軸突縮短，形態(tài)不完整。而通過(guò)fasudil治療抑制ROCK的活化，逆轉(zhuǎn)神經(jīng)再生抑制的過(guò)程，fasudil組的APP/PS1 Tg小鼠海馬DG區(qū)膽堿能神經(jīng)元數(shù)量增多，而且神經(jīng)軸突形態(tài)明顯延長(zhǎng)。我們前期體內(nèi)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)fasudil 可促進(jìn)體內(nèi)神經(jīng)干細(xì)胞動(dòng)員和膽堿能神經(jīng)元分化[17]。體外實(shí)驗(yàn)顯示fasudil可促進(jìn)原代神經(jīng)干細(xì)胞增殖并形成小球，并向神經(jīng)元分化。本研究通過(guò)免疫熒光組織化學(xué)染色的方法證實(shí)在fasudil治療組APP/PS1 Tg小鼠的SVZ有大量nestin+BrdU+的內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞增殖。ROCK抑制劑fasudil通過(guò)抑制ROCK的過(guò)度激活，一方面促進(jìn)APP/PS1 Tg小鼠海馬膽堿能神經(jīng)元細(xì)胞骨架修復(fù)，神經(jīng)軸突再生，另一方面促進(jìn)SGZ和SVZ內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞動(dòng)員和增殖，為下一步分化為神經(jīng)元，增補(bǔ)丟失或變性的神經(jīng)元提供基礎(chǔ)。

本研究應(yīng)用ROCK抑制劑fasudil抑制APP/PS1 Tg小鼠CNS內(nèi)p-Tau蛋白水平，使NFT沉積下降，減少過(guò)度磷酸化Tau 蛋白對(duì)膽堿能神經(jīng)元骨架的影響，修復(fù)神經(jīng)元軸突變性。同時(shí)通過(guò)增加可溶性p-APP蛋白水平，間接減少毒性寡聚體Aβ的沉積[13]，緩解由p-Tau和Aβ沉積對(duì)神經(jīng)元的毒性損害。此外，fasudil還促進(jìn)膽堿能神經(jīng)元細(xì)胞骨架修復(fù)，動(dòng)員內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞增殖，對(duì)APP/PS1 Tg小鼠認(rèn)知功能障礙、神經(jīng)損傷再生都具有潛在的治療作用。隨著對(duì)Rho/ROCK信號(hào)分子在神經(jīng)退行性疾病中的作用和相關(guān)機(jī)制的研究，ROCK抑制劑可促進(jìn)神經(jīng)保護(hù)和神經(jīng)再生形成，將為這類(lèi)神經(jīng)系統(tǒng)疾病功能恢復(fù)提供新的思路和作用靶點(diǎn)。