王盈盈，劉 青，唐麗琴，魏 偉

(1. 安徽醫(yī)科大學臨床藥理研究所，抗炎免疫藥物教育部重點實驗室，抗炎免疫藥物安徽省協(xié)同創(chuàng)新中心，安徽 合肥 230032；2. 安徽醫(yī)科大學附屬省立醫(yī)院藥劑科，安徽 合肥 230001)

糖尿病腎病(diabetic nephropathy, DN)是糖尿病最常見、最嚴重的微血管并發(fā)癥之一，也是終末期腎衰竭的主要誘因之一[1-2]。DN的發(fā)病機制十分復雜，涉及到糖脂代謝紊亂、血流動力學異常、炎癥介質(zhì)釋放、細胞因子、氧化應(yīng)激、細胞凋亡等多種因素的作用，這些作用最終導致腎小球濾過屏障的破壞和組織學變化，包括腎小球系膜擴張、腎小管間質(zhì)纖維化和結(jié)節(jié)性腎小球硬化等[3]。足細胞即腎小球臟層上皮細胞，為高度分化的終末期細胞，位于腎小球基底膜(glomerular basement membrane, GBM)的最外層，與內(nèi)皮細胞層、腎小球基底膜共同構(gòu)成了腎小球的3層濾過屏障，以保證腎小球毛細血管壁的選擇通透性。作為腎臟組織中重要的固有細胞，足細胞功能的改變在DN的發(fā)生、發(fā)展過程中起著至關(guān)重要的作用。足細胞具有多種功能，在正常情況下，足細胞能夠合成GBM的主要成分，是維持腎小球濾過屏障結(jié)構(gòu)和功能正常的主要細胞[4]。小檗堿(berberine, BBR)為黃連根莖中主要成分，研究表明，BBR具有降血糖、抗炎、調(diào)節(jié)異常脂質(zhì)代謝、改善胰島素抵抗、減輕腎臟損傷作用。有研究報道，足細胞在高糖及糖基化終末產(chǎn)物作用下，可引起足細胞骨架蛋白重構(gòu)及分布異常，并誘導足細胞凋亡，BBR能改善高糖及糖基化終末產(chǎn)物引起的足細胞骨架蛋白損傷，并抑制足細胞的凋亡[5]。本實驗將通過高糖誘導腎小球足細胞模擬DN環(huán)境，進一步探討B(tài)BR對高糖誘導損傷足細胞功能的保護作用，為BBR治療DN提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1細胞株小鼠腎小球足細胞株，購自北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院，由中國醫(yī)學科學院基礎(chǔ)醫(yī)學研究所建系。于37℃水浴中復蘇，再將細胞轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶中，加入含10%胎牛血清、0.2% γ-干擾素、1%雙抗的RPMI 1640培養(yǎng)液，置于37℃、5% CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2藥物BBR由安徽省立醫(yī)院藥劑科提取純化，經(jīng)RP-HPLC法檢測純度大于96.5%[6]。樣品分析使用C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動相為乙腈-0.033 mol·L-1磷酸二氫鉀溶液(48∶52)，流速為1.0 mL·min-1，檢測波長為263 nm，柱溫25℃。稱取40.365 g BBR粉末，加入10 mL生理鹽水，加熱渦旋混勻至完全溶解，配制濃度為1.2×104μmol·L-1的儲備液，0.22 μm無菌過濾器處理后，分裝凍存。臨用前加熱溶解后，稀釋適當倍數(shù)，達到所需濃度即可使用。

1.3試劑小鼠重組γ干擾素(貨號：315-05-100)，美國Protech公司；RPMI Medium Modified培養(yǎng)液(貨號：SH30809.01)，賽默飛世爾生物化學制品公司；胎牛血清：杭州四季青公司；己糖激酶(貨號：N4006)、二甲基亞砜、D(+)Glucose(貨號：G-8270)、MTT粉末，均購自美國Sigma公司；Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒(貨號：BB-4101-100T)，貝博生物有限公司；β-actin(批號：151110)、辣根酶標記山羊抗小鼠IgG(貨號：ZB-2305)、辣根酶標記山羊抗兔IgG(貨號：ZB-2301)，均購自北京中杉金橋生物公司；抗desmin蛋白多克隆抗體(貨號：bs-1026R)，北京博奧森生物公司；抗podocin蛋白多克隆抗體(貨號：sc-21009)，美國Santa Cruz 公司；抗nephrin蛋白單克隆抗體(貨號：ab136894)，艾博抗貿(mào)易公司。

1.4儀器超凈工作臺(江蘇蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司)；CO2細胞培養(yǎng)箱(Thermo Fisher Scientific公司)；FC500流式細胞儀(美國貝克曼庫爾特公司)；Powerpac164-5070電泳儀(美國Bio-Rad公司)；LAS4000Mini型化學發(fā)光成像分析儀(美國GE公司)；BX53正置顯微鏡(日本Olympus光學工業(yè)株氏會社)；Infinite M1000 PRO多功能酶標儀(瑞士Tecan公司)。

2 方法

2.1細胞增殖檢測采用MTT法檢測細胞增殖活性。取對數(shù)生長期的足細胞，調(diào)整細胞密度至2×104個/孔，接種于96孔板，每孔100 μL，于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)24 h。分別加入高糖(葡萄糖濃度30 mmol·L-1)及BBR (終濃度分別為30、60、90 μmol·L-1)，同時設(shè)置高糖模型組(葡萄糖濃度30 mmol·L-1)和正常對照組。24 h后，每孔加入5 g·L-1的MTT溶液10 μL，繼續(xù)孵育4 h，吸棄孔中培養(yǎng)上清液，每孔加入150 μL的DMSO，震蕩混勻10 min，酶標儀測定490 nm處各孔的吸光度值，計算細胞存活率，繪制細胞活力柱狀圖,每組設(shè)5個復孔。

2.2細胞凋亡檢測采用Annexin V-FITC/PI雙染法檢測足細胞凋亡，分組與加藥處理同“2.1”項，足細胞培養(yǎng)24 h后，離心收集各組細胞，將1×106個細胞懸浮于500 μL工作液中，分別加入10 μL Annexin V染液，混勻，室溫避光孵育10 min，再分別加入5 μL PI 染液，室溫避光孵育5 min，流式細胞儀檢測細胞凋亡百分率。

2.3Transwell檢測細胞遷移能力將Transwell小室放于24孔板中，在Transwell下室中加入含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基，并分別加入不同濃度的BBR(30、60、90 μmol·L-1)和高糖刺激；用含1%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基將足細胞制成單細胞懸液，計數(shù)，種于Transwell小室，每孔細胞數(shù)約為2×104個，放置37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，；取出Transwell小室，用PBS輕輕漂洗2遍，結(jié)晶紫染色，Transwell上室中未遷移的細胞用棉簽輕輕擦去，倒置顯微鏡下觀察、計數(shù)、拍照。每個樣本隨機選取10個視野，計算每個視野的細胞數(shù)。

2.4Westernblot檢測相關(guān)蛋白表達取對數(shù)生長期細胞，分組與加藥處理同“2.1”項，以1×108個/孔將細胞接種于6孔板，處理24 h后，離心收集細胞，用RIPA裂解液提取細胞總蛋白，并測定蛋白濃度。蛋白樣品中加入等體積的蛋白上樣緩沖液，沸水煮沸5 min，進行SDS-PAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，含5%脫脂牛奶-0.05%吐溫的PBS溶液中37℃封閉2 h，TPBS溶液洗3次，PBS溶液洗1次；一抗4℃孵育過夜；次日TPBS漂洗3次，加入辣根過氧化酶標記的二抗，37℃孵育2 h，ECL顯色。利用Image J 軟件分析各組灰度值，以β-actin為內(nèi)參計算各蛋白的變化。

2.5細胞黏附實驗測定足細胞的黏附功能傳代消化足細胞后，分組與加藥處理同“2.1”項。將足細胞種于預(yù)先用I型鼠尾膠原鋪板的96孔板，細胞濃度約為1×105個/孔，待細胞大部分貼壁后，棄去培養(yǎng)液，用PBS洗去未貼壁細胞，配制含有3.75 mmol·L-1己糖激酶和0.25% Triton X-100的枸櫞酸緩沖液，將上述液體混合均勻后加入培養(yǎng)孔內(nèi)(每孔60 μL)，37℃孵育1 h，孵育結(jié)束后取出，再加入含有5 mmol·L-1依地酸二鈉的甘氨酸緩沖液，每孔90 μL(pH 10.4)，測定405 nm處的吸光度值。以正常對照組吸光度值為黏附能力100%作為對照，計算其他各組足細胞黏附能力。

3 結(jié)果

3.1BBR對高糖損傷足細胞存活率的影響Fig 1的MTT結(jié)果顯示，給予高糖刺激24 h后，與正常對照組相比較，高糖組細胞存活率明顯降低；與高糖組比較，BBR(30、60、90 μmol·L-1)能不同程度促進足細胞增殖，且呈濃度相關(guān)性。

Fig 1 Effect of BBR on viability of

##P<0.01vscontrol group;*P<0.05,**P<0.01vsHG group

3.2BBR對高糖損傷足細胞凋亡的影響采用Annexin V-FITC/PI雙染法檢測足細胞凋亡情況。Fig 2流式細胞儀檢測結(jié)果顯示，與正常對照組相比，高糖能明顯誘導足細胞的凋亡；與高糖組比較，BBR(30、60、90 μmol·L-1)能明顯降低足細胞的凋亡率，改善足細胞的凋亡。

3.3BBR對高糖損傷足細胞遷移能力的影響Fig 3的Transwell遷移實驗結(jié)果顯示，與正常對照組相比，高糖能明顯增加遷移至Transwell下室的足細胞數(shù)量；與高糖組相比，BBR(30、60、90 μmol·L-1)能明顯減少遷移至Transwell下室的足細胞數(shù)量。

3.4BBR對高糖損傷足細胞nephrin、podocin、desmin蛋白表達的影響nephrin、podocin、desmin蛋白是維持足細胞功能完整性的重要蛋白。Fig 4的Western blot結(jié)果顯示，與正常對照組比較，高糖能明顯降低足細胞內(nèi)nephrin、podocin的表達水平, 升高足細胞內(nèi)desmin蛋白的表達；與高糖組相比，BBR(30、60、90 μmol·L-1)能不同程度升高足細胞內(nèi)nephrin和podocin的表達水平，降低足細胞內(nèi)desmin蛋白的表達。

3.5BBR對高糖損傷足細胞黏附能力的影響Fig 5黏附能力測定結(jié)果顯示，與正常對照組比較，高糖能明顯降低足細胞的黏附水平；與高糖組比較，BBR(30、60、90 μmol·L-1)能不同程度提高足細胞的黏附能力。

4 討論

腎小球足細胞是腎臟中重要的固有細胞，足細胞的損傷與腎臟疾病的進展具有密切的關(guān)系。在疾病狀態(tài)下，足細胞是腎小球疾病損傷的靶細胞，當足細胞的丟失超過其增殖能力時，剩余的足細胞不足以完全覆蓋GBM的表面，造成足細胞脫落位點處GBM的裸露，裸露的GBM與鮑曼囊的壁層直接接觸并發(fā)生了黏連，導致腎小球毛細血管袢結(jié)構(gòu)毀損，并出現(xiàn)繼發(fā)性透明樣物質(zhì)的沉積，最后腎小球硬化形成[7]。由此可見，損傷后的足細胞數(shù)量減少在腎小球硬化的發(fā)生過程中起了關(guān)鍵性的作用。足細胞表型是以在足細胞裂孔隔膜(slit diaphragm, SD)上表達的各種膜蛋白為特征性表現(xiàn)，nephrin和podocin是足細胞成熟的標志性分子，也是維持SD完整性和腎小球濾過功能的重要結(jié)構(gòu)分子[8]。desmin作為足細胞骨架中間絲蛋白的一種，與α-平滑肌肌動蛋一樣，屬于肌源性細胞標志，正常情況下腎小球系膜細胞可偶見少量表達，而足細胞無明顯表達。當足細胞因各種原因發(fā)生損傷時，可大量表達desmin而發(fā)生表型轉(zhuǎn)化，其原因可能是足細胞骨架重新排列。因此，desmin可作為足細胞損傷的標志[9-10]。

Fig 2 Effect of BBR on apoptosis of HG-induced

A: Annexin V-FITC/PI double staining assay detected the effect of BBR on apoptosis of podocytes;B: Quantitative analysis showed the percentage of the apoptotic podocytes relative to different groups using CytExpert software.##P<0.01vscontrol group;*P<0.05,**P<0.01vsHG group.

Fig 3 Effect of BBR on migration ability of

Fig 4 Effect of BBR on expression of desmin,

##P<0.01vscontrol group;*P<0.05,**P<0.01vsHG group

Fig 5 Effect of BBR on podocyte adhesion ability induced byHG analyzed by cell adhesion assay n=4)

##P<0.01vscontrol group;*P<0.05,**P<0.01vsHG group

黃連根莖中主要成分為BBR，有降血糖、調(diào)節(jié)血脂的作用，是黃連治療DN的物質(zhì)基礎(chǔ)。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，BBR可能通過調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮生長因子和G蛋白偶聯(lián)受體(G protein-coupled receptor, GPCR)的表達，調(diào)節(jié)GPCR的脫敏和GPCR-G蛋白-AC-cAMP信號通路，從而抑制系膜細胞炎性細胞因子的分泌和過度增殖。上述研究結(jié)果提示，BBR可以減輕DN大鼠腎損害，發(fā)揮腎臟保護作用[6,11-13]。本研究在體外用高糖刺激足細胞，觀察對足細胞增殖、凋亡、遷移、黏附功能及足細胞nephrin、podocin、desmin蛋白表達的影響。結(jié)果表明，BBR對高糖誘導的足細胞功能具有明顯的保護作用，可明顯促進足細胞增殖，抑制足細胞的凋亡和遷移，提高足細胞的黏附能力及足細胞上標志蛋白nephrin、podocin的表達，降低足細胞desmin蛋白的水平。

綜上所述，本研究揭示了高糖能損傷足細胞的功能，促進足細胞的凋亡和遷移，BBR能明顯改善高糖引起的足細胞損傷，其機制可能與調(diào)控足細胞特有的nephrin、podocin、desmin蛋白表達有關(guān)，具體機制有待進一步加以探究。

(致謝:本實驗完成于安徽醫(yī)科大學臨床藥理研究所實驗室，實驗過程中得到臨床藥理研究所全體老師和同學的幫助，在此表示感謝。)