俸 珊，俸 娜，付玉穎，鄒 利，劉 珂，任 巧，徐曉玉

(1. 西南大學藥學院，重慶 400715；2. 成都市青白江區(qū)人民醫(yī)院重癥監(jiān)護病房，四川 成都 610300)

Fig 1 Formation of reactive NAPQI from APAP and relatedmechanism for induced hepatotoxicity

妊娠后，體內(nèi)激素水平會隨著妊娠周期有所波動，而該波動會影響肝臟CYP450s活性水平。研究顯示，妊娠期間肝臟CYP2C9、2D6、2E1、3A的活性均會上調(diào)[3-4]，故孕期用藥藥物藥代動力學參數(shù)的變化一直是研究的熱點。早在1986年，Miners等[5]便報道了孕期APAP的口服清除率較非孕期高58%。隨后Larrey等[6]也發(fā)現(xiàn)，給予妊娠17～18 d小鼠400 mg·kg-1APAP后，24 h小鼠肝臟轉(zhuǎn)氨酶水平升高。Neto等[7]于2004年報道了長期給予妊娠大鼠1 500 mg·kg-1APAP(從妊娠d 1到妊娠結(jié)束)后，母體及胎兒的肝臟和腎臟均有明顯損傷。Thiele等[8]發(fā)表的薈萃分析也表明，過量APAP對妊娠期母體和胎兒均存在較大風險。FDA頒布的妊娠用藥指南中，將APAP納入B級(B級：副作用在動物繁殖性研究中得到證實，而不曾在已妊娠3個月的孕婦中證實)。Franko、Thornton等[9-10]分別在2013和2012年報道了妊娠中期孕婦過量服用APAP導致肝移植的病例，APAP孕期安全性評價又重新引起關(guān)注[11]。目前并無直接證據(jù)表明妊娠中期和晚期肝臟對APAP的耐受性有差異，同時，腎臟作為APAP的主要排泄器官，單劑量APAP是否會引發(fā)孕期腎損傷也未知。鑒于APAP妊娠用藥的生殖毒性，以及對子代行為學影響已研究較多，本研究將主要關(guān)注 APAP 500 mg·kg-1(正常小鼠的最大可耐受劑量[8])對不同妊娠時期(未妊娠時期、妊娠中期、妊娠晚期)母鼠肝腎功能的影響，同時探究相關(guān)機制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1試劑 APAP購于中國食品藥品檢定研究院, 純度>99%；谷丙轉(zhuǎn)氨酶 (alanine aminotransferase, ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶 (aspartate aminotransferase, AST)、堿性磷酸酶 (alkaline phosphatase, ALP)、肌酐(creatinine，Cre)、尿素氮(urea nitrogen, BUN)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、GSH、丙二醛 (malondialdehyde, MDA) 測定試劑盒，均購自南京建成生物工程研究所。

1.1.2實驗動物 SPF級昆明小鼠120只，體質(zhì)量 (20 ± 2) g，購自重慶中藥研究院，生產(chǎn)許可證號：SCXK(渝)2017-0003。

1.1.3儀器 API 4000 Qtrap(2臺島津LC-20AD泵，ESI接口離子源，Analyst Software 1.5.1色譜工作站)；BS-220全自動生化分析儀(深圳邁瑞)；超高速離心機(美國Thermo Scientific 公司)。

1.2孕鼠的制備將♀鼠和♂鼠按照2 ∶1合籠飼養(yǎng)，并于合籠后的每日清晨、中午及晚上檢查♀小鼠是否出現(xiàn)陰栓(作為判斷受孕的直接證據(jù))；同時做陰道涂片觀察小鼠的動情周期。陰栓是小鼠在交配后形成的白色漿狀物質(zhì)，堵塞于陰道腔內(nèi)，是動物已交配的標志，本研究將陰栓出現(xiàn)當天作為妊娠“0 d”。

1.3實驗分組實驗分為未妊娠組、妊娠中期組(受孕后7～15 d，本實驗采用受孕后10 d小鼠)、妊娠晚期組(受孕后15～21 d，本實驗采用受孕后18 d小鼠)。灌胃給予上述各組小鼠APAP 500 mg·kg-1，并于給藥后0(不同妊娠期各自空白對照組)、6、24、48 h后取材。給藥結(jié)束后，動物禁食不禁水，并于各時間點摘眼球采血，進行血清生化指標檢測。同時取部分肝、腎組織，固定于4%多聚甲醛溶液中，以備后續(xù)病理切片。其余的肝組織-80℃冰箱保存待用。

1.4血清生化指標的檢測ALT、AST、ALP、Cre、BUN等血液生化指標采用全自動生化分析儀檢測。

1.5肝、腎組織氧化應激指標的檢測肝、腎組織中SOD、GSH、MDA 含量按照南京建成試劑盒說明書測定。

1.6肝、腎組織HE病理切片制備將固定液中肝、腎組織石蠟包埋, 切片, 蘇木精-伊紅 (hematoxylin-eosin, HE) 染色后, 光學顯微鏡下觀察病理學變化。

1.7小鼠肝微粒體的制備每份肝、腎取0.1 g，即每組各0.5 g，加入3倍體積冰冷的PBS勻漿，3 500 r·min-1離心30 s(離心2次)。棄去沉淀和上層白色物質(zhì)。將上清液裝入特制離心管中，PBS配平至誤差在0.01 g以內(nèi)，超高速離心(105 000×g，60 min)，所得沉淀用pH 7.4的Tris緩沖液重懸浮，得到肝微粒體溶液，BCA試劑盒法測定其蛋白含量。

1.8“Cocktail”探針法檢測CYP450s活性[12]向50 μL探針藥物(其中右美沙芬2.5 μmol·L-1、非那西丁10 μmol·L-1、甲苯磺丁脲100 μmol·L-1、氯唑沙宗20 μmol·L-1、咪達唑侖5 μmol·L-1)中加入50 μL的小鼠肝微粒體(0.5 g·L-1)，接著加入100 μL NADPH(1 mmol·L-1) 啟動反應，37℃孵育15 min。反應結(jié)束后，加入2倍體積冰甲醇(含有75 μg·L-1內(nèi)標卡馬西平)終止反應。10 000 r·min-1離心10 min，LC-MS/MS“Cocktail”探針法分析上清液[12]。

1.9NAPQI-GSH結(jié)合物測定[13]100 μL 10%組織勻漿+400 μL甲醇沉淀，13 000 r·min-1離心5 min，取上清LC-MS/MS分析。流動相：A：水(0.1%甲酸)，B：乙腈(0.1% 甲酸)；色譜柱：Agilent ZORBAX XDB-C18，3.5 μm，2.1 mm×50 mm Part No. USHP004814；柱溫：30℃；流速：0.5 mL·min-1；進樣量：10 μL；梯度洗脫(A:0 min→4 min, 98%→2%)，ESI+，MRM模式監(jiān)測離子對457.1/328.1。

2 結(jié)果

2.1APAP對不同妊娠期小鼠肝臟組織病理學的影響如Fig 2所示, 當給予各組小鼠500 mg·kg-1APAP后，未妊娠組小鼠在0、6、24、48 h的肝細胞排列正常，門管區(qū)未見炎細胞浸潤。妊娠中期小鼠肝小葉在6 h時出現(xiàn)炎細胞浸潤；24 h時肝小葉結(jié)構(gòu)模糊, 小葉內(nèi)肝細胞水腫且胞質(zhì)淡染；48 h時少量肝細胞排列混亂。妊娠晚期小鼠僅在6 h時觀察到肝小葉內(nèi)有少量炎細胞浸潤，其余時間點的小葉內(nèi)肝細胞基本正常。結(jié)果提示，在給予同等劑量的APAP后，妊娠中期小鼠出現(xiàn)了輕微的肝細胞損傷，但在48 h時損傷開始恢復。而未妊娠和妊娠晚期小鼠均未出現(xiàn)明顯的肝組織損傷病理學變化。

2.2APAP對不同妊娠期小鼠肝臟轉(zhuǎn)氨酶水平的影響如Fig 3A～3C所示, 當給予各組小鼠500 mg·kg-1APAP后，未妊娠組和妊娠晚期組小鼠在0～48 h內(nèi)的血清ALT、AST、ALP水平均無明顯波動，而妊娠中期組這3個轉(zhuǎn)氨酶水平在6 h時明顯升高(P<0.01)，隨后在24～48 h內(nèi)又恢復到正常水平。值得注意的是，妊娠中期組和妊娠晚期組小鼠血清ALP水平的基礎(chǔ)值(0 h)均明顯低于未妊娠組(P<0.01)。

2.3APAP對不同妊娠期小鼠肝臟組織氧化應激水平的影響如Fig 3D～3F所示, 當給予各組小鼠500 mg·kg-1APAP后，小鼠肝組織MDA水平變化趨勢在3組中基本一致：在24 h時明顯升高(P<0.01)，在48 h時又恢復到正常水平。SOD水平變化：未妊娠組在0～48 h內(nèi)有升高趨勢；妊娠中期組則是先升高后降低(0～6 h升高，12～48 h降低)；而妊娠晚期組則無明顯波動。值得注意的是，妊娠中期和晚期組小鼠血清SOD水平的基礎(chǔ)值(0 h)均明顯高于未妊娠組(P<0.01)。GSH水平變化：未妊娠組小鼠在0～6 h出現(xiàn)短暫降低后，又于12～48 h內(nèi)恢復到正常水平；妊娠中期組小鼠則是在0～48 h內(nèi)持續(xù)降低；而妊娠晚期組小鼠在0～48 h內(nèi)無明顯波動。值得注意的是，妊娠中期組小鼠血清GSH水平的基礎(chǔ)值(0 h)均明顯高于未妊娠組(P<0.01)。

Fig 2 Liver histological evaluation of APAP-treated pregnant mice

Fig 3 Effects of APAP on the serum activity of ALT (A), AST (B), ALP (C) andon liver MDA (D), SOD (E), GSH (F) contents in pregnant n=10)

##P<0.01vs0 h of mid-pregnancy group;**P<0.01vsun-pregnant group

2.4APAP對不同妊娠期小鼠腎臟組織病理學的影響如Fig 4所示, 當給予各組小鼠500 mg·kg-1APAP后，各組小鼠在0～48 h內(nèi)，腎小球、腎小囊形態(tài)結(jié)構(gòu)正常，腎小囊未見沉積物，腎小管未見冠心，上皮細胞未見腫脹變性。上述結(jié)果表明，500 mg·kg-1APAP對妊娠各時期小鼠腎臟組織病理無明顯影響。

2.5APAP對不同妊娠期小鼠腎臟組織生化和氧化應激指標的影響如Fig 5所示, 當給予各組小鼠500 mg·kg-1APAP后，未妊娠組、妊娠中期組和晚期組小鼠的血清Cre和BUN水平在0～48 h內(nèi)無明顯波動。MDA和SOD水平變化：僅妊娠晚期組在6 h時出現(xiàn)了短暫升高，而后在12～48 h又降低恢復到正常水平；其余組在0～48 h內(nèi)無明顯變化。GSH水平變化：妊娠中期組在0～48 h內(nèi)有持續(xù)降低現(xiàn)象，而其他組未見明顯波動。

2.6不同妊娠期小鼠肝臟CYP450s活性的變化如Fig 6A所示，小鼠在妊娠中期(妊娠后10 d)的肝臟CYP1A2、2D6、3A4、2E1酶活性水平明顯高于未妊娠小鼠(P<0.01)，而上述代謝酶活性水平在妊娠晚期(妊娠后18 d)，恢復到未妊娠時水平。

APAP的毒性物質(zhì)基礎(chǔ)為其活性代謝產(chǎn)物NAPQI，其穩(wěn)定性較差，不能被直接檢測，但其可被GSH捕獲，生成NAPQI-GSH復合物，故研究中常用 NAPQI-GSH水平來反映NAPQI生成量。本研究也對給藥后，各組肝臟中的NAPQI-GSH生成量進行了檢測。如Fig 6B所示，給予APAP后，各組NAPQI-GSH水平在6 h時均有升高，但僅妊娠中期組存在明顯差異(P<0.05)，而在隨后的48 h內(nèi)，NAPQI-GSH在肝臟中水平急劇降低。

3 討論

妊娠是非常復雜的生理過程，是婦女的一段特殊時期，該時期用藥應尤為謹慎。肝臟作為人體最大的代謝器官，含有豐富的藥物代謝酶系統(tǒng)，妊娠期激素水平變化影響著肝臟各種代謝或抗氧化酶的水平變化。臨床和實驗研究表明，妊娠期間CYP450s活性的變化可影響美托洛爾、咖啡因、羅紅霉素等藥物藥代動力學的變化[3]。本研究也證實，妊娠中期肝臟CYP450s主要代謝酶的活性水平上調(diào)，這與之前的研究結(jié)果相一致[3, 14]。Ning等[15]研究表明，肝細胞核因子4α激活介導了妊娠期小鼠Cyp2d40的表達上調(diào)，而其他CYP450s表達上調(diào)是否也與該轉(zhuǎn)錄因子相關(guān)，還有待進一步研究。本研究所觀察到的妊娠晚期小鼠肝臟CYP450s活性又趨于正常，這可能跟妊娠期間激素的周期性變化有關(guān)，而究竟是哪種激素還有待進一步研究。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)，妊娠中期和晚期組小鼠血清SOD水平，中期組小鼠的GSH水平均明顯高于未妊娠組。該結(jié)果提示，在妊娠時期機體自身抗氧化能力增強，可應對突發(fā)的自由基水平升高，由于SOD等抗氧化酶表達主要由Nrf2信號通路調(diào)控，故妊娠期間的激素水平是否會影響Nrf2信號通路的下游蛋白調(diào)控，也有待于進一步研究。

Fig 4 Kindy histological evaluation of APAP-treated pregnant mice

Fig 5 Effects of APAP on the activity ofBUN and Cre in serum, and on theactivity of SOD, the levels of GSHand MDA in kidney tissue of pregnant

Fig 6 The CYP450s activity(A)and the contents of NAPQI-GSH(B)in liver of different pregnant mice

*P<0.05,**P<0.01vsun-pregnant mice

綜上所述，本研究表明，500 mg·kg-1APAP可致妊娠中期小鼠產(chǎn)生急性輕微肝損傷，這可能是妊娠中期小鼠肝CYP450s活性升高，以及SOD活性、GSH水平上調(diào)共同調(diào)節(jié)的結(jié)果。本研究提示妊娠中期由于CYP450s活性上調(diào)，發(fā)生經(jīng)CYP450s介導產(chǎn)生肝毒性的風險上升，臨床用藥應更關(guān)注該時期的用藥方案。

(致謝：本實驗在西南大學藥學院中藥藥理學實驗室完成，感謝給予實驗指導、幫助的老師和同學。)