陳睿 佘燕玲 江婷 周珊瑤 史華彩 黎程

1廣東省第二人民醫(yī)院，廣東省傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)與運動傷害康復(fù)研究所（廣東廣州 510317）2中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院放射科（廣東廣州 510630）

氧是細(xì)胞生存及能量代謝的重要底物，缺氧可影響機體代謝功能及細(xì)胞存活。缺氧誘導(dǎo)的肌萎縮可見于過度訓(xùn)練、高原低氧、下肢動脈閉塞癥和慢性非阻塞性肺疾病等[1-3]。近些年來研究認(rèn)為，自噬參與骨骼肌細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)平衡及肌萎縮相關(guān)疾病的生理病理過程[4，5]。自噬是細(xì)胞通過形成雙層膜結(jié)構(gòu)的自噬體，將自身受損的細(xì)胞器和大分子物質(zhì)包裹并運送至溶酶體進行分解代謝的過程。適當(dāng)?shù)淖允捎欣诩?xì)胞在不良環(huán)境中進行防御，而過量的自噬則可能導(dǎo)致細(xì)胞死亡[6]。本實驗探討二氯化鈷（cobaltous chloride，CoCl2）誘導(dǎo)缺氧對肌細(xì)胞萎縮的調(diào)控機制。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與材料

CO2培養(yǎng)箱：賽默飛世爾科技公司。多功能酶標(biāo)儀：Bioteck公司。透射電子顯微鏡：日本電子株式會社。熒光定量PCR儀：美國ABI公司。電泳轉(zhuǎn)印系統(tǒng)：北京凱元公司?；瘜W(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)：上海天能科技有限公司。高糖DMEM培養(yǎng)基購于Gibco。胎牛血清、馬血清購于Hyclone。CoCl2購于Sigma。3-Methyladenine（3MA）購于Selleck。吉姆薩染色液、ECL發(fā)光試劑盒購于南京凱基生物科技發(fā)展有限公司?；钚匝酰╮eac?tive oxygen species，ROS）檢測試劑盒、誘導(dǎo)因子-1 α（hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α）、Bcl2/腺病毒E1B 19kDa相關(guān)蛋白3（Bcl2/adenovirus E1B19kDa in?teracting protein 3，BNIP3）、肌肉萎縮盒F基因（mus?cle atrophy F-box，MAFbx）一抗購于abcam。微管相關(guān)蛋白1輕鏈-3（microtubule associated protein1 light chain 3，LC3）、tubulin一抗、辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔購于ABclonal。轉(zhuǎn)錄試劑盒及聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）擴增試劑盒購自Takara公司。引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

C2C12小鼠骨骼肌細(xì)胞系購買于中國科學(xué)院干細(xì)胞庫，使用含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基，置于37℃，體積分?jǐn)?shù)5%CO2的培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，隔天換液，觀察細(xì)胞形態(tài)和生長情況。當(dāng)細(xì)胞達(dá)到90%～100%融合時吸去完全培養(yǎng)液，使用含2%馬血清的高糖DMEM進行誘導(dǎo)分化，隔天換液。5天后觀察細(xì)胞分化為多核長條狀肌管。正常組不加藥物處理，CoCl2組加入200 μM CoCl2誘導(dǎo)缺氧，正常+3MA組加入5 mM 3MA，CoCl2+3MA組加入200 μM CoCl2及5 mM 3MA。24小時后收集細(xì)胞，進行后續(xù)實驗。

1.3 多功能酶標(biāo)儀檢測ROS ROS含量

將細(xì)胞培養(yǎng)于96孔黑色底透培養(yǎng)板中，誘導(dǎo)細(xì)胞缺氧后去除培養(yǎng)液。加入100 μl 1×Buffer清洗細(xì)胞。去除Buffer，加入100 μl 濃度為20 μM DCFDA溶液，于37℃避光孵育45分鐘后移除DCFDA溶液，加入100 μl 1×Buffer，使用多功能酶標(biāo)儀于488 nm激發(fā)波長，525 nm發(fā)射波長進行檢測。

1.4 吉姆薩染色

使用預(yù)冷甲醇固定細(xì)胞10分鐘，磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）清洗后使用吉姆薩染色液染色20分鐘，自來水沖洗。晾干后置于光學(xué)顯微鏡下觀察拍照。

1.5 透射電鏡觀察自噬體形成情況

收集細(xì)胞后，2.5%戊二醛中前固定4小時，經(jīng)PBS清洗后放入1%鋨酸中后固定2 h，梯度乙醇（50%、70%、80%、90%、100%）依次脫水，epson812中進行包埋。包埋后放入烤箱中聚合72小時，之后于超薄切片機上進行切片，再經(jīng)硝酸鉛和醋酸鈾雙重染色，使用JEM-1200EX型透射電鏡觀察并拍照。

1.6 實時熒光定量PCR PCR檢測相關(guān)基因的表達(dá)

加入1 m l TRIzol于6孔板中裂解細(xì)胞，室溫放置5分鐘后提取RNA并使用NanoDrop2000進行RNA濃度及質(zhì)量測定。反轉(zhuǎn)錄按照Takara試劑盒說明書進行。10 μl反應(yīng)體系如下:5×PrimeScriptRT Master Mix 2 μl，total RNA 1 μl（500 ng），DEPC水補足到10 μl。PCR條件：95℃ 30 s，95℃ 5 s，60℃ 30 s，40個循環(huán)。引物序列如下：18 s上游：GTAACCCGTT?GAACCCCATT；18 s下 游 ：CCATCCAATCGGTAG?TAGCG；MAFbx上游：GAGTGGCATCGCCCAAAAGA；MAFbx下游：TCTGGAGAAGTTCCCGTATAAGT；HIF-1α上游：ACCTTCATCGGAAACTCCAAAG；HIF-1α下游：CTGTTAGGCTGGGAAAAGTTAGG；BNIP3上游：TGAATCTGGACGAAGTAGCTCC；BNIP3下游：CAGAC?GCCTTCCAATGTAGATC；LC3 上 游 ：CGATA?CAAGGGGGAGAAGCA；LC3下游：ACTTCGGAGAT?GGGAGTGGA。

1.7 免疫蛋白印跡檢測相關(guān)蛋白的表達(dá)

6孔板加入含蛋白酶抑制劑、磷酸蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液，冰上裂解4℃，12000 rpm離心10 min。BCA法檢測蛋白含量。取30 μg蛋白，進行電泳，再將蛋白電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，室溫封閉1 h。加入一抗（1∶1000）4℃孵育過夜。洗膜5次后室溫孵育二抗（1∶5000）。洗膜，ECL發(fā)光液顯色，天能系列全自動化學(xué)發(fā)光成像分析系統(tǒng)掃描成像。以Tubulin作為內(nèi)參，目的蛋白條帶與內(nèi)參比較作為條帶的相對表達(dá)值。

1.8 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS21.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行分析，重復(fù)3次實驗數(shù)據(jù)采用x±s表示，兩組間比較采用Stu?dent'st檢測，正態(tài)分布的計量資料多組間比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CoCl CoCl2 2誘導(dǎo)C C2 2C C1212骨骼肌細(xì)胞萎縮

正常組可見長條狀肌管形成，CoCl2處理后肌管萎縮、斷裂（圖1）。

圖1 兩組形態(tài)學(xué)比較（×40，bar=100μm）

2.2 CoCl CoCl2 2誘導(dǎo)C C2 2C C1212骨骼肌細(xì)胞ROS ROS含量

使用熒光標(biāo)記的 ROS分子探針孵育細(xì)胞，檢測結(jié)果（圖2）顯示：與正常對照組（0.999±0.287）比較，200 μM CoCl2處理C2C12細(xì)胞24小時后，熒光強度明顯增強（1.833±0.043），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=-4.965，P=0.008）。

圖2兩組ROS的含量比較

2.3 CoCl CoCl2 2誘導(dǎo)自噬體形成

正常組具有清晰的雙層膜結(jié)構(gòu)的線粒體，呈梭形或者橢圓形，偶見自噬體。CoCl2處理C2C12細(xì)胞24小時后，可見空泡化結(jié)構(gòu)，具有清晰雙層膜結(jié)構(gòu)的自噬體及髓鞘樣結(jié)構(gòu)（圖3）。

圖3 兩組自噬體的形成情況（×10000，bar=0.5 μm）

2.4 CoCl CoCl2 2誘導(dǎo)自噬相關(guān)基因mRNA mRNA表達(dá)

使用CoCl2可誘導(dǎo)BNIP3、LC3B mRNA表達(dá)顯著增加。與正常組比較，CoCl2組BNIP3 mRNA相對表達(dá)量為8.843 ± 0.202，t=-67.239，P=0.000；LC3B mRNA相對表達(dá)量為1.348 ± 0.213，t=-2.836，P=0.048（見表1）。HIF-1α mRNA表達(dá)與正常組比較無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）。

表1 兩組HIF-1α、BNIP3、LC3B mRNA表達(dá)比較（xˉ± s）

2.5 CoCl CoCl2 2誘導(dǎo)自噬相關(guān)蛋白表達(dá)

使用CoCl2可誘導(dǎo)HIF-1α、BNIP3、LC3蛋白表達(dá)顯著增加。與正常組比較，CoCl2組HIF-1α蛋白表達(dá)為（14768.720 ± 2045.420）%，t=-12.421，P＜0.01；BNIP3蛋白表達(dá)為（34181.006 ± 3130.082）%，t=-18.859，P＜0.01；LC3B蛋白表達(dá)為（555.642 ± 66.625）%，t=-11.845，P＜0.01（見表2）。

表2 兩組HIF-1α、BNIP3、LC3蛋白表達(dá)比較（xˉ± s）

2.6 抑制CoCl CoCl2 2誘導(dǎo)的自噬對MAFbx MAFbx蛋白表達(dá)的影響

使用CoCl2處理24 h后，可觀察到MAFbx蛋白表達(dá)明顯上升。與正常組比較，CoCl2組MAFbx蛋白表達(dá)約為正常組的2倍。加入3MA后，MAFbx蛋白表達(dá)較CoCl2處理組下降。各組間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（F=18.246，P＜0.01）（圖4）。

圖4抑制自噬后MAFbx蛋白表達(dá)變化

3 討論

缺氧可使骨骼肌萎縮，功能下降[5]。為了闡明低氧環(huán)境下肌萎縮機制，本研究采用CoCl2體外模擬低氧環(huán)境，觀察C2C12小鼠成肌細(xì)胞系變化。CoCl2模擬缺氧是國際上比較常用的模擬缺氧的方法，鈷離子能競爭血紅蛋白卟啉環(huán)中的鐵離子，抑制氧合血紅蛋白的形成而喪失與O2結(jié)合的能力，誘發(fā)一系列類似缺氧的反應(yīng)，從而模擬缺氧[7]。在細(xì)胞中，CoCl2抑制脯氨酰羥化酶的羥化作用，從而使細(xì)胞處于缺氧狀態(tài)[8]。當(dāng)機體處于缺氧環(huán)境時，線粒體電子傳遞鏈中氧分子供應(yīng)不足，導(dǎo)致大量的ROS產(chǎn)生，產(chǎn)生的ROS會導(dǎo)致細(xì)胞形態(tài)功能紊亂或細(xì)胞死亡[9]。本研究結(jié)果顯示低氧環(huán)境下ROS濃度顯著提高。有文獻報道細(xì)胞內(nèi) ROS產(chǎn)生是誘發(fā)自噬的主要原因[10]。

本研究中，CoCl2誘導(dǎo)缺氧后可觀察到雙層膜結(jié)構(gòu)的自噬體形成，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比例上調(diào)，表明自噬參與了CoCl2誘導(dǎo)的骨骼肌缺氧。自噬是近年研究的熱點之一，是細(xì)胞應(yīng)激過程中產(chǎn)生的一種適應(yīng)性的代謝活動。自噬形成時，胞漿型LC3（即LC3-Ⅰ）會酶解掉一小段多肽，轉(zhuǎn)變?yōu)椋ㄗ允审w）膜型（即LC3-Ⅱ），因此，LC3-Ⅱ/Ⅰ比值的大小可估計自噬水平的高低[11]。另外，電鏡亦作為觀察自噬的金標(biāo)準(zhǔn)。自噬的激活受多通路調(diào)控，如哺乳類動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，m-TOR），AMP依賴的蛋白激酶[Adenosine 5‘ -monophosphate（AMP）-activated pro?tein kinase，AMPK]等[12，13]。為進一步研究 CoCl2誘導(dǎo)自噬過程中信號通路的改變，本研究檢測了HIF-1α及其下游BNIP3 mRNA及蛋白的表達(dá)。HIF-1α是機體維持氧穩(wěn)態(tài)信號系統(tǒng)中最為關(guān)鍵的異二聚體轉(zhuǎn)錄因子，其表達(dá)受氧濃度影響[14]。在常氧條件下，HIF-1α可被脯氨酸羥化酶羥化，羥基化的HIF-1α通過泛素-蛋白酶體系統(tǒng)迅速降解。低氧環(huán)境下，羥基化被抑制，HIF-1α降解受阻，從而激活下游靶基因的表達(dá)[15]。BNIP3是BH3-only家族中的一員，是HIF-1α的靶基因之一，在低氧時能被HIF-1α轉(zhuǎn)錄激活，表達(dá)后定位于線粒體，進一步激活線粒體自噬[16]。有文獻報道，HIF-1α/BNIP3參與了心肌缺血再灌注中的自噬過程。抑制BNIP3可減少缺氧引起的心肌細(xì)胞死亡，改善心功能[17，18]。另有文獻報道，LC3可與BNIP3二聚體上的LC3結(jié)合區(qū)域（LC3-interacting region，LIR）結(jié)合誘導(dǎo)自噬[19，20]。本研究結(jié)果顯示：HIF-1α、BNIP3、LC3表達(dá)上升，提示 HIF-1α/BNIP3參與了骨骼肌缺氧誘導(dǎo)的自噬。但BNIP3是否與LC3直接作用引起自噬需要進一步研究。

MAFbx是肌肉特異表達(dá)的泛素E3連接酶，被認(rèn)為是骨骼肌萎縮的標(biāo)記物[21]。Pomies等[22]用H2O2處理C2C12肌管18小時后，MAFbx基因表達(dá)增強，肌蛋白降解增加，從而導(dǎo)致肌萎縮，運用抗壞血酸處理后可減少ROS的產(chǎn)生及MAFbx的表達(dá)，肌管直徑變大。肌肉萎縮主要通過兩條蛋白降解途徑，一為泛素化介導(dǎo)的蛋白降解途徑，另一條為自噬-溶酶體途徑，但兩者間的關(guān)系尚有爭議[4]。有報道在急性間歇性缺氧（Acute in?termittent hypoxia，AIH）大鼠模型中MAFbx表達(dá)增加，自噬相關(guān)基因LC3和γ-氨基丁酸受體相關(guān)蛋白1（Gamma-aminobutyric acid receptor-associated pro?tein-like 1，GABARAPL1）基因mRNA表達(dá)上升[23]。另一報道則認(rèn)為LC3蛋白及自噬相關(guān)通路蛋白BNIP3及GABARAPL1與MAFbx表達(dá)并無直接關(guān)系[24]。本研究使用自噬抑制劑3MA，研究MAFbx與CoCl2誘導(dǎo)自噬間的關(guān)系。結(jié)果顯示，3MA與CoCl2共處理組MAFbx表達(dá)較單獨CoCl2處理減少，提示抑制自噬可減少MAFbx的表達(dá)。

綜上，CoCl2誘導(dǎo)C2C12骨骼肌細(xì)胞萎縮，可能與HIF-1α/BNIP3信號通路誘導(dǎo)的自噬發(fā)生有關(guān)，抑制缺氧條件下的自噬可部分減少肌萎縮。