李會琳, 何 燕, 張 靜, 王 嵐, 楊 宏, 彭正松,3, 路 璐①
(1.西華師范大學環(huán)境科學與工程學院, 四川 南充 637009; 2.西南野生動植物保護重點實驗室/ 西華師范大學生命科學學院, 四川 南充 637002; 3.西昌學院農業(yè)科學學院, 四川 西昌 615000)
多環(huán)芳烴(polycyclic aromatic hydrocarbons,PAHs)是廣泛存在于環(huán)境中的含有2個及以上苯環(huán)的一類持久性有機污染物[1],通過干濕沉降、污泥農用和污水灌溉等方式在土壤表面不斷累積[2],使土壤成為PAHs重要的載體之一。PAHs進入土壤后發(fā)生的一系列物理化學過程,如吸附、遷移、轉化和降解等,是PAHs在土壤中消減的主要途徑[3]。對PAHs土壤污染的研究主要集中在工業(yè)用地、城市區(qū)域[4]。近些年農業(yè)用地的PAHs污染也逐漸受到關注[4]。其中,水稻種植是我國主要的耕種方式之一,然而對我國不同區(qū)域水稻土壤中PAHs污染的降解響應過程研究仍十分有限。
土壤理化性質,如pH值、有機質含量、通氣性、鹽度、含水量等都會影響土壤中PAHs的降解過程[5-6]。對芘在土壤中吸附行為的研究結果表明,有機質含量越高,芘的不可逆吸附越強[7],直接影響PAHs的生物可利用性。有機質組分不同的土壤吸附PAHs的能力有很大差異[8],KE等[9]研究發(fā)現(xiàn)吸附在極性有機質上的PAHs更容易被降解。土壤環(huán)境差異造成土壤微生物地理分布不同[10],使得不同類型土壤中PAHs的生物降解率可能有顯著差異。此外,PAHs污染造成土壤中碳源急劇增加,使氮和磷等營養(yǎng)物質元素常常成為限制PAHs生物降解的主要因素[11]。由于不同類型土壤中含水量、土壤質地存在差異,由此形成的不同微環(huán)境氧氣濃度也是PAHs降解率的影響因素之一。此外,PAHs濃度和化學結構也是影響其在土壤中降解的重要因素之一[12]。NAM等[13]發(fā)現(xiàn),高分子量PAHs比低分子量PAHs更容易被土壤有機質吸附。此外,土壤微生物的改變是污染土壤生態(tài)環(huán)境中微生物活性的敏感指示。丁克強等[14]研究發(fā)現(xiàn)菲能刺激土壤中細菌生物量增加10倍以上。
由于發(fā)育母質和氣候條件等不同,我國從北到南形成了不同的土壤地帶譜。筆者在我國采集了8種稻田土壤,通過向土壤中添加菲、熒蒽和苯并[a]蒽等不同環(huán)數PAHs在室內模擬土壤PAHs污染,探究不同類型稻田土壤中PAHs降解率的差異,并初步分析土壤理化性質和PAHs降解率的關系,為探究我國不同類型稻田土壤PAHs積累消減機制以及區(qū)域稻田土壤生態(tài)風險預測和評價提供依據。
于2016年11月分別采集重慶長壽區(qū)中性紫色土(CQ)、湖南吉首市黃壤(HuN)、黑龍江佳木斯市黑土(HLJ)、安徽淮南市黃褐土(AH)、河南周口市潮土(HeN)、北京市潮土(BJ)、四川南充市石灰性紫色土(SC)和山西長治市褐土(SX)8個水稻種植區(qū)土壤樣品(表1)。采用網格布點法分別采集50 m×50 m范圍內表層土壤(0~10 cm),混合均勻,去除植物根系、石礫等,過2 mm孔徑不銹鋼篩,置于4 ℃ 冰箱內保存以備后續(xù)培養(yǎng)實驗。取部分土壤樣品自然風干后過0.90 mm孔徑篩,用于土壤理化性質測定。
表1采樣點信息
Table1Samplingsitesinformation
采樣點位置海拔/m經緯度土壤類型重慶長壽區(qū)32029°51'37.15″ N,107°04'35.65″ E中性紫色土湖南吉首市19528°16'11.85″ N,109°40'42.41″ E黃壤黑龍江佳木斯市8246°48'29.96″ N,130°20'59.39″ E黑土安徽淮南市2132°40'51.68″ N,117°01'19.62″ E黃褐土河南周口市6034°04'53.19″ N,114°38'57.14″ E潮土北京市5739°54'11.78″ N,116°24'03.31″ E潮土四川南充市32530°53'24.97″ N,106°03'54.03″ E石灰性紫色土山西長治市93136°11'44.27″ N,113°06'35.33″ E褐土
采用酸度計測定土壤pH值〔m(土)∶V(水)=1∶2.5〕,采用稱重法測定土壤含水量,采用重鉻酸鉀氧化-外加熱法測定土壤有機質,采用全自動間斷化學分析儀(Skalar,Breda,荷蘭)測定土壤銨態(tài)氮、硝態(tài)氮和總氮含量。
8種稻田土壤基本理化性質見表2。有機質含量有顯著差異(P<0.05),其中HLJ有機質含量最高,是含量最低的CQ的2.3倍,這可能是由于土壤母質和耕種施肥不同所致[15]。不同類型稻田土壤中總氮、硝態(tài)氮和銨態(tài)氮含量也有顯著差異。由表2可知,HLJ為強酸性,HuN為弱酸性,其余土壤均為堿性。土壤含水量相差很大,SC含水量最高,是含水量最低的BJ的7倍。
表2土壤基本理化性質
Table2Soilphysicochemicalproperties
土壤類型w(有機質)/(g·kg-1)w(TN)/(g·kg-1)w(NO3--N)/(μg·g-1)w(NH4+-N)/(μg·g-1)含水量w/%pH值HLJ49.11±0.13a1.23±0.01a30.56±4.92c19.29±0.52b18.60±1.71d5.37±0.41cBJ32.78±0.16c0.87±0.01b39.01±2.49b14.81±1.13d10.82±0.18e7.98±0.05aSX28.56±0.15d0.79±0.01c140.27±7.17a26.33±1.16a18.71±0.32d7.83±0.08aHeN23.61±0.36g0.71±0.01e40.56±2.90b16.96±0.18c14.30±0.28e7.87±0.03aAH27.12±0.02e0.80±0.01c36.78±3.28b18.49±0.35b13.10±0.11e7.99±0.08aCQ21.34±0.04h0.68±0.01f3.85±0.46f15.38±1.01d27.76±0.72b7.72±0.02aSC35.73±0.02b0.75±0.01d11.87±0.40e10.17±0.19e82.67±3.52a7.89±0.01aHuN24.56±0.19f0.76±0.01d23.64±2.09d16.99±0.58c23.00±1.00c6.10±0.15b
HLJ為黑龍江佳木斯市黑土,BJ為北京市潮土,SX為山西長治市褐土,HeN為河南周口市潮土,AH為安徽淮南市黃褐土,CQ為重慶長壽區(qū)中性紫色土,SC為四川南充市石灰性紫色土,HuN為湖南吉首市黃壤。同一列數據后英文小寫字母不同表示不同類型土壤之間某指標差異顯著(P<0.05)。
分別取50.0 g(干土重)新鮮土壤(HLJ、BJ、SX、HeN、AH、CQ、SC和HuN分別為59.5、55.5、59.5、57、56.5、64.0、91.0和61.5 g)放入滅菌玻璃培養(yǎng)皿中,加入菲、熒蒽和苯并[a]蒽混合丙酮溶液,使土壤中菲、熒蒽和苯并[a]蒽含量分別為2 μg·g-1。將玻璃培養(yǎng)皿置于通風廚中,使丙酮溶劑充分揮發(fā)后,再于25 ℃條件下自然光中培養(yǎng),好氧條件含水量為飽和持水量的50%~65%。分別在第0、7、17和28 d采集土壤樣品,用于測定PAHs含量和土壤理化性質。
土壤中PAHs含量采用氣相色譜-質譜法測定:稱取冷凍干燥土樣2.0 g與等體積無水硫酸鈉(400 ℃ 條件下烘干8 h)混勻,用濾紙包好放入索氏提取儀中,加入80 mL二氯甲烷在45 ℃條件下連續(xù)提取24 h后放入旋轉蒸發(fā)器(BUSHI,瑞士)中濃縮,添加2 mL正己烷溶解。選內徑1 cm、高20 cm玻璃層析柱,采用10 mL正己烷濕法裝入1 g硅膠,取2 ml溶液通過層析柱,并用V(正己烷)∶V(二氯甲烷)=1∶1 洗脫,洗脫液于氮吹儀(北京帥恩科技有限責任公司)上濃縮為1 mL,用正己烷定容至2 mL后采用氣相色譜質譜聯(lián)用儀(7890 GC system-240 Ion Trap,Agilent,美國)測定。
標準品菲、熒蒽、苯并[a]蒽購自Sigma-Aldrich公司,標準儲備液采用正己烷配置。色譜柱和質譜條件參照文獻[16]。
土壤中PAHs降解率計算公式為
Rn=(m0-mn)/m0×100% 。
(1)
式(1)中,Rn為培養(yǎng)n天時土壤中PAHs降解率,%;m0為培養(yǎng)零時刻時土壤中PAHs總量,ng;mn為第n天時土壤中PAHs總量,ng。
每個時段土壤中PAHs降解速率計算公式為
Vr,n=(cn-cr)/tr,n。
(2)
式(2)中,Vr,n為培養(yǎng)第n到r天PAHs在土壤中的平均降解速率,ng·g-1·d-1;cn和cr分別為土壤培養(yǎng)n和r天時土壤中PAHs質量含量,ng·g-1;tr,n為第n到r天的時間,d。
分別于培養(yǎng)0、7和28 d時取0.6 g(干土重)土壤用于提取土壤中微生物總DNA。土壤DNA提取采用FastDNATMSPIN Kit for Soil試劑盒(MP Biomedicals,美國)提取。DNA濃度采用紫外可見分光光度計(NanoDrop 2000,美國)測定。
實時熒光定量PCR擴增分析采用SYBR?Premix EX TaqTM試劑盒(Tli RNaseH Plus)在熒光定量PCR儀(CFX96 Optical Real-Time PCR System,Bio-Rad Laboratories,美國)上進行。實時熒光定量PCR的標準曲線采用向載體質粒中分別導入含有細菌16S rRNA基因和菲降解雙加氧酶基因phnAc的克隆子制備,將含有目標基因的克隆子在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜,使用MiniBEST Plasmid Purification Kit試劑盒(Takara)進行質粒提取和純化后,采用分光光度計測定DNA濃度,并結合質粒的分子質量計算其拷貝數。對質粒標線按10倍梯度稀釋,得到7個數量級的標準曲線,其標準曲線質粒濃度變化范圍為102~108拷貝·L-1。定量PCR的反應體系為20 μL,包括10 μL SYBR?Premix EX TaqTM(Tli RNaseH Plus)、1 μL DNA模板和正向、反向引物各0.1 μL(引物濃度10 μmol·L-1)和8.8 μL滅菌雙蒸水。陰性對照用滅菌雙蒸水代替樣品模板。實驗中所使用的引物見表3[17-18]。
表3實時熒光定量PCR擴增引物及反應條件
Table3Primersandconditionsusedinthestudy
名稱引物序列靶基因實時熒光定量PCR反應程序來源文獻515F5-GTG CCA GCM GCC GCG G-3Universal 16S rRNA95 ℃ 3 min;40×(95 ℃,30 s;55 ℃,30 s;[17]907R5-CCG TCA ATT CMT TTR AGT TT-372 ℃,30 s讀數);溶解曲線從65 ℃降至95 ℃,溫度每秒增加0.5 ℃,5 s讀數P80735-TTC GAG CTG GAA TGT GAG C-3phnAc95 ℃ 3 min;40×(95 ℃,30 s;55 ℃,30 s;[18]P90475-AAT AAC CGG CGA TTC CAA AC-372 ℃,30 s讀數);溶解曲線從65 ℃降至95 ℃,溫度每秒增加0.5 ℃,5 s讀數。
所有處理均設3個重復,Duncan多重比較分析采用SPSS 20.0軟件,PAHs和各環(huán)境因子變化相關性冗余分析(redundancy analysis,RDA)采用Canoco 4.5軟件,制圖采用Origin 8.1軟件。
8種類型稻田土壤總細菌數量在不同培養(yǎng)時段為3.89×109~1.07×1012拷貝·L-1(圖1)。而特異參與菲降解的雙加氧酶對應的功能基因phnAc在不同培養(yǎng)時段為4.27×105~6.48×107拷貝·L-1(圖1)。結果顯示,不同類型稻田土壤微生物數量差異顯著,添加PAHs后,除CQ和SC外微生物數量顯著變化(P<0.05),說明PAHs對微生物從數量上沒有毒性作用。添加菲后,除CQ、SC和AH外,其他5種土壤培養(yǎng)7 d內phnAc基因數量顯著增加(P<0.05),表明菲降解微生物數量在菲的刺激下有所增加。這說明PAHs對土壤中降解微生物的生長有促進作用,這與BLAKELY等[19]研究結果一致。低環(huán)PAHs(2~3環(huán))比高環(huán)PAHs更容易引起微生物群落結構改變,以適應PAHs污染脅迫[20]。所以,在土壤中添加菲、熒蒽和苯并[a]蒽后,能特異參與菲降解的雙加氧酶所對應的功能基因phnAc數增加,說明微生物在PAHs的降解中有重要貢獻。然而,復雜的土壤生態(tài)環(huán)境中PAHs的消除是一個生物和非生物因素共同作用的結果,尤其低環(huán)PAHs的消除受揮發(fā)、水解等物理化學因素影響較大,仍需進一步探究。
PAHs進入土壤后可通過揮發(fā)、光氧化、化學氧
化、生物積累、土壤吸附和微生物降解等去除方式降低含量[21]。PAHs在不同土壤中降解受到如PAHs和土壤理化性質等多種因素影響。8種稻田土壤中菲、熒蒽和苯并[a]蒽3種PAHs降解率和降解速率隨時間變化情況見圖2和表4。
HLJ為黑龍江佳木斯市黑土,BJ為北京市潮土,SX為山西長治市褐土,HeN為河南周口市潮土,AH為安徽淮南市黃褐土,CQ為重慶長壽區(qū)中性紫色土,SC為四川南充市石灰性紫色土,HuN為湖南吉首市黃壤。直方柱上方英文小寫字母不同表示不同類型土壤之間某指標差異顯著(P<0.05)。圖1 8種稻田土壤基于16S rRNA基因所測定的總細菌數量和phnAc基因數量隨時間的變化Fig.1 Changes of the copy number of bacterial 16S rRNA gene and phnAc gene in 8 paddy soils incubated with PAHs
HLJ為黑龍江佳木斯市黑土,BJ為北京市潮土,SX為山西長治市褐土,HeN為河南周口市潮土,AH為安徽淮南市黃褐土,CQ為重慶長壽區(qū)中性紫色土,SC為四川南充市石灰性紫色土,HuN為湖南吉首市黃壤。 直方柱上方英文小寫字母不同表示不同類型土壤之間某指標差異顯著(P<0.05)。圖2 8種稻田土壤中菲、熒蒽和苯并[a]蒽降解率隨時間變化Fig.2 Changes of the degradation ratio in the incubation experiments with phenanthrene, fluoranthene and benzo[a] anthracene of different paddy soils
7 d時,HuN和AH中菲降解率分別為33.9%和45.6%,顯著低于其他5種土壤(P<0.05)。21 d時,土壤中菲降解率均高于75%。SC、CQ和HLJ中菲降解速率最高,7 d時降解率分別達82.76%、78.25%和76.08%,菲平均降解速率在前7 d分別為87.72、110.84和182.94 ng·g-1·d-1。28 d后,菲降解率都達92%以上。7 d時,HLJ和CQ中熒蒽降解率最高,分別為70.19%和76.23%;SC、BJ和AH中熒蒽降解率最低,分別為40.5%、43.3%和44.4%。28 d后熒蒽降解率均達97%以上。7 d時,AH中苯并[a]蒽降解率僅為24.78%,HLJ和CQ中降解率最高,分別為51.29%和48.35%。21 d時,CQ和HLJ中苯并[a]蒽降解率分別為90.64%和90.44%,SC中為75.62%,其余均低于60%。28 d時,除HuN中苯并[a]蒽降解率為56.87%外,其他均達70%以上。
表4土壤中PAHs降解速率隨時間變化
Table4Degradationrateofpolycyclicaromatichydrocarbonsindifferentperiodsofincubation
土壤類型菲降解速率/(ng·g-1·d-1)熒蒽降解速率/(ng·g-1·d-1)苯并[a]蒽降解速率/(ng·g-1·d-1)0~7 d>7~21 d>21~28 d0~7 d>7~21 d>21~28 d0~7 d>7~21 d>21~28 dHLJ182.94±5.84a 10.73±1.46c35.23±7.03b185.86±32.09a33.19±0.78b14.91±4.09de198.34±9.55a 76.33±13.71ab18.83±4.12aBJ111.51±18.78b23.04±4.35b49.95±4.84a134.33±14.18b53.03±14.98a79.90±1.99a151.85±4.96bc61.52±12.31bc22.60±1.17aSX116.40±11.50b19.07±7.13b48.97±4.75a180.85±32.97a23.21±2.36bc42.25±2.86b86.53±13.39de20.26±0.37d16.15±0aHeN102.93±29.70b8.67±4.54c14.83±5.24cd79.49±18.92c13.00±0.43cd32.34±3.54c181.34±31.64ab25.82±0d71.39±13.13aAH61.38±15.61cd19.52±1.17b35.24±3.98c47.39±7.34cd9.46±2.76cd31.26±5.40c51.25±7.93e28.22±0.26d39.70±9.09aCQ110.84±0.39b5.49±3.11c17.82±6.72c115.49±7.53b3.04±0.97d27.78±6.66c194.99±34.23a85.23±11.99a8.60±0.88aSC87.72±3.98bc7.42±3.26c7.44±1.56d26.11±2.23d14.10±1.51cd9.43±2.50e124.27±0.85cd43.31±2.25cd21.73±0aHuN52.04±8.83d35.15±2.50a21.84±5.97c77.51±15.02c28.50±7.45b19.40±0.34d102.01±12.55d21.55±6.27d4.77±0a
HLJ為黑龍江佳木斯市黑土,BJ為北京市潮土,SX為山西長治市褐土,HeN為河南周口市潮土,AH為安徽淮南市黃褐土,CQ為重慶長壽區(qū)中性紫色土,SC為四川南充市石灰性紫色土,HuN為湖南吉首市黃壤。同一列數據后英文小寫字母不同表示不同類型稻田土壤間在某一時間段的降解速率差異顯著(P<0.05)。
土壤中菲、熒蒽和苯并[a]蒽降解主要發(fā)生在前7 d。PAHs降解速率隨含量降低也顯著降低。如前7 d時SC中菲、熒蒽和苯并[a]蒽降解速率分別是后21 d降解速率的16.1、2.2和2.4倍。該結果與KUPPUSAMY等[24]發(fā)現(xiàn)的4環(huán)及以下PAHs在土壤中降解行為曲線一致,表明土壤中生物和非生物途徑能快速對污染物做出響應。
8種稻田土壤中菲、熒蒽和苯并[a]蒽降解率與7個環(huán)境因子的RDA分析結果見圖3。
HLJ為黑龍江佳木斯市黑土,BJ為北京市潮土,SX為山西長治市褐土,HeN為河南周口市潮土,AH為安徽淮南市黃褐土,CQ為重慶長壽區(qū)中性紫色土,SC為四川南充市石灰性紫色土,HuN為湖南吉首市黃壤。箭頭表示變量方向和大小。圖3 不同稻田土壤對PAHs的降解行為與環(huán)境因子的冗余分析Fig.3 Redundancy discrimination analysis(RDA) of the relationship between the soil physicochemical parameters, sampling site and the degradation behavior of different paddy soils.
圖3顯示,AH和HuN分布在第1象限,HLJ和CQ在第2象限,BJ、SX和HeN在第3象限,SC在第4象限,PAHs在同一象限稻田土壤中降解特征較相似,同時也表明PAHs在不同類型土壤中降解行為有差異。
RDA分析對7個環(huán)境因子進行評估,從中提取2組主成分因子,以分析環(huán)境因子對PAHs降解行為的影響。影響土壤PAHs降解速率的第1排序軸和第2排序軸特征值分別為71.6%和14.6%,可以解釋降解速率差異總方差值的86.2%,說明這2個排序軸能夠真實反映環(huán)境因子對PAHs降解速率的影響。第1排序軸表明,影響土壤中PAHs降解的主要環(huán)境因子為w(有機質)(得分為0.49)、含水量(得分為0.44)、w(TN)(得分為0.37)、w(NO3--N)(得分為-0.28)、pH值(得分為-0.25)、w(NH4+-N)(得分為-0.22)和海拔(得分為0.13)。第2排序軸中主要環(huán)境因子為pH值(得分為-0.73)、w(NO3--N)(得分為-0.25)、海拔(得分為-0.32)、含水量(得分為-0.26)、w(TN)(得分為0.24)、w(有機質)(得分為-0.01)和w(NH4+-N)(得分為-0.01)。結果表明,土壤基本理化性質等環(huán)境因子不同可能是造成土壤中PAHs降解行為差異的原因[23]。
相關性分析顯示土壤中菲和熒蒽降解行為顯著相關(P<0.05,表5),這可能是由于菲和熒蒽都含有3個苯環(huán),在土壤中留存時間和吸附-降解行為相似[25]。菲和熒蒽的降解速率與pH值和含水量呈負相關,與海拔以及NO3--N、NH4+-N、有機質和全氮含量呈正相關,其中土壤中菲降解速率與有機質含量呈顯著正相關(P<0.05),熒蒽降解速率與NH4+-N含量呈顯著正相關(P<0.05)。PAHs在土壤中長期滯留通常是由于被土壤有機質吸附,進入土壤微空隙中,從而影響PAHs生物有效性[26]。
pH值是影響PAHs降解的主要原因之一,PAHs降解一般發(fā)生在pH值為5.0~9.0時,中性條件下生物降解率最高[30]。ZAIDI等[31]研究發(fā)現(xiàn)pH值大于8時,菲生物降解過程被顯著抑制。同時pH值也可通過影響PAHs在土壤溶液中的溶解性來影響PAHs的生物可降解性[32]。
苯并[a]蒽在土壤中降解與7個環(huán)境因子均無顯著相關性(P>0.05)。苯并[a]蒽與菲和熒蒽在水溶性和生物可利用性上的差異,也是導致其與環(huán)境因子間相關性差異的主要原因。此外,3種PAHs降解率均與土壤含水量呈負相關。VIDALI[33]提出有利于有機污染物降解的土壤最佳含水量應為土壤飽和持水量的30%~90%。含水量過高會造成土壤微環(huán)境中氧濃度降低,形成厭氧環(huán)境,抑制PAHs的好氧氧化過程。由以上分析可知,土壤環(huán)境因子會影響土壤中PAHs降解過程和留存時間,土壤中PAHs降解和吸附行為由多種土壤理化性質和其他環(huán)境條件綜合決定。
表5土壤中PAHs降解速率與環(huán)境因子的相關性分析
Table5PearsoncorrelationbetweensoilPAHsdegradationrate,soilchemicalpropertiesandsamplingsitealtitude
*表示相關顯著(P<0.05)。
(1)不同類型稻田土壤中PAHs降解率有差異,7 d時菲、熒蒽和苯并[a]蒽降解率分別為62.70%、54.29%和37.44%,28 d后降解率均達80%以上。不同類型稻田土壤中PAHs降解率由大到小依次為SC、HLJ、CQ、SX、BJ、AH、HeN和HuN。PAHs在不同類型土壤中環(huán)境行為有差異。
(2)不同類型稻田土壤微生物量有顯著差異,除CQ和SC外,PAHs污染能促進微生物數量顯著變化(P<0.05)。除CQ、SC和AH外,參與菲降解的雙加氧酶功能基因phnAc在其他5種土壤中均顯著增加(P<0.05)。
(3)稻田土壤與菲和熒蒽的降解行為顯著相關,含4個苯環(huán)的苯并[a]蒽的降解速率顯著低于含4環(huán)以下PAHs的降解速率。這3種典型PAHs易降解程度由大到小依次為菲、熒蒽和苯并[a]蒽。
(4)稻田土壤中PAHs降解速率受土壤和PAHs理化性質的綜合影響。菲和熒蒽降解速率與土壤總有機質和NH4+-N含量呈顯著正相關(P<0.05),與土壤pH值和含水量呈負相關。苯并[a]蒽降解速率與研究中土壤環(huán)境因子無顯著相關性(P>0.05)。