劉 夢，王 增，李淑芬，劉進英，馮玉梅，楊 燕

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院植物生物技術(shù)功能實驗室/內(nèi)蒙古自治區(qū)植物逆境生理與分子生物學(xué)重點實驗室，內(nèi)蒙古呼和浩特 010018)

小麥株高不僅影響產(chǎn)量，同時還與抗倒伏性密切相關(guān)[1]。在育種實踐中，一般認為株高分布在75～85 cm的小麥品種不易發(fā)生倒伏，且能發(fā)揮高產(chǎn)潛能[2]。小麥[3-4]、大麥[5]和燕麥[6]的植株莖稈直徑和莖壁厚度與抗倒伏性呈負相關(guān)，即抗倒伏品種較易倒伏品種表現(xiàn)出較大的基部直徑和較厚的稈壁[7]。小麥莖稈基部第一和第二節(jié)間長度與倒伏指數(shù)呈顯著負相關(guān)，且基部節(jié)間對小麥倒伏性的影響表現(xiàn)為第二節(jié)間>第一節(jié)間>第三節(jié)間[8]。李金才等[9]的研究也驗證了小麥莖稈基部第二節(jié)間長度與倒伏性密切相關(guān)。在由表皮、維管束、厚壁組織和髓腔組成的小麥莖稈橫切面中，厚壁組織的細胞壁堅硬而起到支持作用，與植株倒伏性狀密切相關(guān)[10]。

赤霉素作為植物重要的內(nèi)源性生長調(diào)節(jié)劑，在植物整個生長發(fā)育過程中起到重要的調(diào)節(jié)作用。GAMyb是參與GA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的正向調(diào)節(jié)因子，能夠促進種子成熟，胚乳和花的發(fā)育、莖稈伸長等過程[11-13]。目前，GAMyb同源基因已經(jīng)從大麥、水稻、小麥禾本科植物中鑒定出來，并確定其為單拷貝基因，通過結(jié)合到一個高度保守的由21個堿基對組成的GA應(yīng)答元件來誘導(dǎo)與發(fā)芽相關(guān)的水解蛋白酶和細胞壁降解酶的合成[14-18]。同時GAMyb也與植株的莖稈伸長密切相關(guān)[19]。在擬南芥中，GAMyb卻是一個具有三個拷貝的家族，并促進葉柄和節(jié)間伸長[20]。近些年對小麥TaGAMyb的研究較廣泛和深入，TaGAMyb已經(jīng)被克隆并定位在小麥染色體的3AL3-0.42-0.78、3BL7-0.63-1.00和3DL3-0.81-1.00位置上，且B和D基因組TaGAMyb的核酸多態(tài)性較保守的A基因組來說更豐富[20]。TaGAMyb基因在花藥形成和莖稈的伸長中起重要作用[19，21]。進一步研究發(fā)現(xiàn)，在雜交小麥后代中TaGAMyb基因?qū)ηo伸長的調(diào)節(jié)作用可能是因為TaGAMyb基因上調(diào)，導(dǎo)致GAMyb調(diào)節(jié)靶基因表達的增強[22]。這些數(shù)據(jù)初步表明，TaGAMyb促進小麥莖的伸長，但其在節(jié)間伸長中的作用需要進一步的驗證。劉進英等[23]在不同株高和不同遺傳背景材料中沒有發(fā)現(xiàn)TaGAMyb-A和TaGAMyb-D基因存在等位變異，只發(fā)現(xiàn)TaGAMyb-B存在兩種等位變異TaGAMyb-Ba和TaGAMyb-Bb；與TaGAMyb-Ba基因相比，TaGAMyb-Bb基因在第一內(nèi)含子上存在一個84 bp反向重復(fù)序列的插入。本研究在本課題組前期工作[23]的基礎(chǔ)之上，進一步探討TaGAMyb-Ba和TaGAMyb-Bb與小麥株高和第二節(jié)間細胞長度的關(guān)系，以期深入了解這兩種等位變異對小麥莖稈生長發(fā)育的調(diào)節(jié)作用。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料為93份春小麥育種材料的自然群體，由內(nèi)蒙古巴彥淖爾市農(nóng)科所提供。2015年和2016年播種于內(nèi)蒙古呼和浩特市，行長2 m，株距15 cm，行距20 cm，設(shè)置兩個重復(fù)。

1.2 株高測定

在小麥臘熟期，對93份春小麥育種材料進行株高測量，每個重復(fù)統(tǒng)計10株。

1.3 引物的設(shè)計

根據(jù)TaGAMyb-A、TaGAMyb-B和TaGAMyb-D基因序列差異位點[22]以及RT-qPCR引物片段適中性原則設(shè)計引物對TaGAMyb-Bup/TaGAMyb-Bdown(表1)，對第二節(jié)間的TaGAMyb-B基因進行RT-qPCR定量檢測，同時用小麥管家基因β-actin表達量作為TaGAMyb-B基因相對表達量的參照標準，引物為Actin up/Actin down(序列見表1)。用檢測TaGAMyb-B等位基因的引物GAMyb-B2 up/GAMyb-B2 down(表1)[23]對93份春小麥材料進行多態(tài)性檢測，所用引物序列均由華大基因合成。

1.4 TaGAMyb-B的RT-qPCR檢測分析

隨機選取分別屬于TaGAMyb-Ba和TaGAMyb-Bb等位基因類型的材料各三份，分別是08冬中788、08冬中1146和08冬中275(TaGAMyb-Bb類型)以及格蘭尼、拉繁8和青春37(TaGAMyb-Ba類型)，在小麥開花后30 d取基部第二節(jié)間為試驗材料，進行TaGAMyb-B基因RT-qPCR檢測分析。利用MiniBEST Plant RNA Extraction Kit(TaKaRa)提取總RNA，并取2 μL進行1%瓊脂糖凝膠電泳分析檢測總RNA的完整性，用核酸定量儀(Thermo Nanodrop-2000)測定核酸的濃度和檢測總RNA的純度。以總RNA為模板，利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒RTaseM-MLV(TaKaRa)(200 U·μL-1)合成第一條cDNA鏈。以反轉(zhuǎn)錄得到的第一條cDNA鏈為模板，利用小麥管家基因β-actin檢測反轉(zhuǎn)錄過程的完整性。反應(yīng)體系(15 μL)：ddH2O 10.55 μL、10×PCR Buffer 1.5 μL、dNTP Mix(2.5 mmol·L-1) 1.2 μL、上下游引物(20 mmol·L-1)各0.3 μL、LA Taq酶(5 U·μL-1，TaKaRa)0.15 μL和模板cDNA 100 ng。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，62 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠檢測。

表1 本研究引物信息Table 1 Information of primers in this study

RT-qPCR分析反應(yīng)體系為20 μL，包括SYBR Premix Ex Taq Ⅱ 10 μL，上下游引物(20 mmol·L-1)各1 μL，ddH2O 6 μL，cDNA(500 ng·μL-1)2 μL。每個材料進行三次生物學(xué)重復(fù)，反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃ 20 s，56 ℃ 20 s，循環(huán)40次。電腦自動分析計算CT值。

樣品中基因表達量變化倍數(shù)運用2-△△CT法計算[24]。其中△△CT=△CT(參照)-△CT(處理)，△CT=CT(目標基因)-CT(內(nèi)參基因)。

1.5 冷凍切片樣品的制備與觀察

選取小麥開花后30 d莖稈基部第二節(jié)間作為試驗材料。樣品剪成約0.5 cm的小段，用LEICA OCT包埋劑進行包埋。放于-20 ℃冰箱冷藏2 h，然后放于-80 ℃?zhèn)溆?。用LEICA CM3050S冷凍切片機進行切片，厚度為20 μm。用小毛刷將切片展平，用粘附載玻片粘樣，最后放于Nikon eclipse Ti下進行觀察，選用綠色濾光片。

1.6 數(shù)據(jù)的分析

用Microsoft Excel 2010對株高數(shù)據(jù)進行差異顯著性分析，用SPSS對株高數(shù)據(jù)進行相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 春小麥株高表型的差異

測定結(jié)果顯示，兩年中，93份春小麥株高分布范圍為51.25～97.97 cm，平均值為70.49 cm。其中，株高最高材料為拉繁8(97.97 cm)，株高最低材料為08冬中788(51.25 cm)。93份春小麥材料中，株高在75～85 cm間的有16份材料，占比為17.2%(表2)。該群體在2015年和2016年的株高呈極顯著正相關(guān)(R=0.719，P<0.01)，說明兩年的株高表現(xiàn)是一致的。

2.2 TaGAMyb-B等位基因的鑒定結(jié)果及相應(yīng)材料株高分布

用引物GAMyb-B2 up/GAMyb-B2 down對93份春小麥材料進行多態(tài)性檢測，在93份材料中檢測出TaGAMyb-Ba和TaGAMyb-Bb兩種等位基因(圖1和表2)，其中，有31份小麥材料屬于TaGAMyb-Ba等位基因型，62份小麥材料屬于TaGAMyb-Bb等位基因型。TaGAMyb-Ba等位基因型株高分布范圍為51.45～97.97 cm，最高株高材料為拉繁8(97.97 cm)，最低株高材料為寧春10號(51.45 cm)；分布在最適種植株高75～85 cm范圍的有8份材料，分別是05cm178、鑒56、沈太1號、拉2676-9、青春37、寧資08A751、34-206和沈免210848，占比為25.80%，株高分別為77.28、83.96、82.45、80.51、79.44、76.81、75.96和75.89 cm。TaGAMyb-Bb等位基因型的株高分布范圍為51.25～91.49 cm，最高株高材料為中國春(91.49 cm)，最低株高材料為08冬中788(51.25 cm)；分布在75～85 cm范圍的也有8份材料，分別為九三大穗/山東7788、甘春20號、小冰32、內(nèi)麥17號、08H274、G47、05-5371和張春11，占比為12.90%，株高分別為83.44、81.63、80.27、79.89、79.44、77.93、76.88和75.08 cm。由此可見，該自然群體中TaGAMyb-Ba等位基因型材料在最適種植株高75～85 cm范圍中的占比大于TaGAMyb-Bb等位基因型材料。

2.3 TaGAMyb-Ba和TaGAMyb-Bb與小麥株高的相關(guān)性

2015和2016年TaGAMyb-Ba基因型的株高平均值分別為70.00±9.36和76.86±9.57 cm，兩年均以拉繁8最高，寧春10號最低；TaGAMyb-Bb基因型的株高平均值兩年分別為65.79±7.81和72.07±9.74 cm，兩年分別以野貓和河套3號最高，以08冬中550和08冬中788最低。方差分析表明，同一年內(nèi)兩種基因型間株高差異均顯著(P2015=0.024，P2016=0.027)；兩個基因型的兩年平均值分別為73.43±8.62和68.93±8.18 cm，也存在顯著差異(P=0.016)。

M：Marker DL2000；1、5和6均為TaGAMyb-Bb等位基因型材料(08冬中788、08冬中1146和08冬中275)；2、3和4均為TaGAMyb-Ba等位基因型材料(格蘭尼、拉繁8和青春37)。

M:Marker DL2000; 1,5 and 6 areTaGAMyb-Bballele materials(08 dongzhong 788,08 dongzhong 1146 and 08 dongzhong 275); 2,3 and 4 are cultivars withTaGAMyb-Baallele(Gelanni,Lafan 8 and Qingchun 37).

圖1 GAMyb-B等位基因在93份春小麥材料中的部分擴增結(jié)果

(續(xù)表2Continuedtable2)

材料Material基因型Gene type株高 Plant height/cm2016年2015年兩年平均值A(chǔ)verage in two years07-6228TaGAMyb-Bb73.07 66.79 69.93 08-1783TaGAMyb-Bb75.46 66.83 71.15 青春37 Qingchun 37TaGAMyb-Ba86.84 72.04 79.44 08冬中275 08 dongzhong 275TaGAMyb-Bb65.00 58.99 62.00 08H274TaGAMyb-Bb81.86 77.01 79.44 永登麥 YongdengmaiTaGAMyb-Bb74.50 66.67 70.58 08冬中5378 08 dongzhong 5378TaGAMyb-Ba77.75 66.58 72.16 永2352 Yong 2352TaGAMyb-Ba73.33 67.13 70.23 武M27-2 Wu M27-2TaGAMyb-Ba74.75 59.02 66.89 河套3號 Hetao 3TaGAMyb-Bb99.75 77.02 88.39 沈太1號 Shentai 3TaGAMyb-Ba84.83 80.07 82.45 金穗0095 Jinsui 0095TaGAMyb-Ba77.75 61.17 69.46 巴豐3號 Bafeng 3TaGAMyb-Bb77.50 59.44 68.47 蘭優(yōu)5074 Lanyou 5074TaGAMyb-Ba78.06 61.90 69.98 寧資08A751 Ningzi 08A751TaGAMyb-Ba85.22 68.40 76.81 蘭雜7002 Lanza 7002TaGAMyb-Ba78.50 63.78 71.14 07-6751TaGAMyb-Ba77.50 70.30 73.90 y31TaGAMyb-Bb77.09 64.71 70.90 小冰32 Xiaobing 32TaGAMyb-Bb86.77 73.77 80.27 鑒56 Jian 56TaGAMyb-Ba84.91 83.01 83.96 福建7112 Fujian 7112TaGAMyb-Ba79.13 62.17 70.65 遼春10號 Liaochun 10TaGAMyb-Ba70.00 76.30 73.15 08-353TaGAMyb-Ba80.94 67.66 74.30 青海932 Qinghai 932TaGAMyb-Bb74.29 60.96 67.63 84加79 84 jia 79TaGAMyb-Bb68.25 67.38 67.81 82170-1TaGAMyb-Ba73.92 60.90 67.41 08冬中1807 08 dongzhong 1807TaGAMyb-Bb76.43 57.24 66.84 野貓 YemaoTaGAMyb-Bb86.56 85.47 86.02 甘春20號 Ganchun 20TaGAMyb-Bb83.08 80.17 81.63 輪選 LunxuanTaGAMyb-Bb73.17 63.65 68.41 臨優(yōu)一號 Linyou 1TaGAMyb-Bb77.11 66.53 71.82 巴優(yōu)1號 Bayou 1TaGAMyb-Bb78.38 64.85 71.62 九三大穗/山東7788 Jiusandasui/Shandong 7788TaGAMyb-Bb82.58 84.31 83.44 寧春10號 Ningchun 10TaGAMyb-Ba51.40 51.50 51.45 08-1312TaGAMyb-Bb69.25 65.99 67.62 巴豐6號 Bafeng 6TaGAMyb-Ba74.38 71.59 72.98 永2739 Yong 2739TaGAMyb-Bb73.00 62.08 67.54 08冬中6741 08 dongzhong 6741TaGAMyb-Bb55.79 53.00 54.39 07-6239TaGAMyb-Bb74.17 67.08 70.63 08-2294TaGAMyb-Bb84.23 65.75 74.99 08-3410TaGAMyb-Ba81.50 66.73 74.12 寧春35號 Ningchun 35TaGAMyb-Bb78.40 67.27 72.84 張春11 Zhanchun 11TaGAMyb-Bb80.38 69.79 75.08 張掖1號 Zhangye 1TaGAMyb-Bb75.75 64.00 69.88 中國春 Chinese SpringTaGAMyb-Bb98.00 84.99 91.49 武M437 Wu M437TaGAMyb-Ba71.90 63.95 67.93 08-1826TaGAMyb-Bb72.25 62.60 67.43 08-3348TaGAMyb-Bb77.58 63.33 70.45 08-1718TaGAMyb-Bb72.85 62.46 67.66 08-1699TaGAMyb-Bb75.90 63.29 69.59 矮孟牛 AimengniuTaGAMyb-Bb69.75 55.95 62.85 73B609TaGAMyb-Bb77.81 71.42 74.62 08冬中2455 08 dongzhong 2455TaGAMyb-Bb58.56 54.80 56.68 YK6-325TaGAMyb-Bb64.42 66.80 65.61 武E32-1 Wu E32-1TaGAMyb-Ba79.45 70.15 74.80 巴豐1號 Bafeng 1TaGAMyb-Bb69.40 58.89 64.14 臨優(yōu)二號 Linyou 2TaGAMyb-Bb64.69 64.94 64.81

2.4 TaGAMyb-B基因在小麥莖稈第二節(jié)間中的表達

在小麥莖稈第二節(jié)間中，TaGAMyb-Ba基因的表達量均高于TaGAMyb-Bb基因，但差異不顯著(P=0.120)(圖2)。

1：08冬中788(TaGAMyb-Bb)；2：08冬中1146(TaGAMyb-Bb)；3：08冬中275(TaGAMyb-Bb)；4：格蘭尼(TaGAMyb-Ba)；5：拉繁8(TaGAMyb-Ba)；6：青春37(TaGAMyb-Ba)。相對表達量以1(08冬中788)為標準進行均一化處理。

1:08 dongzhong 788(TaGAMyb-Bb); 2:08 dongzhong 1146(TaGAMyb-Bb); 3:08 dongzhong 275(TaGAMyb-Bb); 4:Gelanni(TaGAMyb-Ba); 5:Lafan(TaGAMyb-Ba); 6:Qingchun 37(TaGAMyb-Ba). The relative expression was homogenized with 08 dongzhong 788 as the standard.

圖2TaGAMyb-B在小麥莖稈第二節(jié)間中的表達量

Fig.2ExpressionofTaGAMyb-Binthesecondinternodeofwheatstem

2.5 小麥莖稈第二節(jié)間厚壁組織的變異

對6份小麥材料莖稈第二節(jié)間橫切面(圖3)的厚壁組織厚度進行測量，結(jié)果表明，屬于TaGAMyb-Bb基因型的08冬中788、08冬中1146和08冬中275的厚壁組織厚度分別為990.52、563.68和904.31 μm；屬于TaGAMyb-Ba基因型的格蘭尼、拉繁8和青春37的厚壁組織厚度分別為1 006.68、854.65和853.66 μm。進一步分析發(fā)現(xiàn)，兩種基因型材料間厚壁組織厚度無顯著差異(P=0.57)。對這6份材料第二節(jié)間進行縱切，除拉繁8沒能切出完整細胞外，其他5份材料均有完整細胞(圖4)。統(tǒng)計每種材料中連續(xù)分布的30個厚壁細胞的長度，結(jié)果表明，TaGAMyb-Ba基因型材料格蘭尼和青春37的厚壁細胞平均長度分別為240.67和267.45 μm，二者間差異不顯著；屬于TaGAMyb-Bb基因型的08冬中788、08冬中1146和08冬中275厚壁組織細胞的平均長度分別為212.70、202.47和185.28 μm，三者間差異不顯著。TaGAMyb-Ba和TaGAMyb-Bb基因型材料的厚壁組織細胞平均長度分別為254.06和200.15 μm，二者間差異顯著(P=0.03)。

圖3 兩種等位基因類型小麥的第二莖間橫切面

3 討 論

本研究中，TaGAMyb-Ba基因型小麥兩年平均株高(73.43 cm)顯著高于TaGAMyb-Bb基因型小麥(68.93 cm)(P<0.05)。然而田間表型鑒定中，有部分材料卻與此結(jié)論相悖。例如在TaGAMyb-Ba基因型小麥中，交原356和寧春10號的平均株高分別為58.10和51.45 cm；在TaGAMyb-Bb基因型小麥中，中國春、野貓和河套3號的平均株高分別為91.49、86.02和88.39 cm。這些材料的株高均與相應(yīng)變異類型的平均值差異較大，原因可能是株高作為一個多基因控制的數(shù)量性狀，在其建成過程中，除受TaGAMyb-B基因調(diào)控之外，還受 Rht8、Rht-B1、 Rht-D1、GA20ox、GA3ox等其他遺傳因素[17，24]以及環(huán)境因素的共同影響[27]。對6份材料莖稈第二節(jié)間的TaGAMyb-B相對表達量與相應(yīng)株高的相關(guān)分析結(jié)果顯示，兩者之間沒有顯著的相關(guān)性(R=0.768,P=0.074>0.05)，可能是由于試驗樣本少造成了結(jié)果的局限性。青春37(TaGAMyb-Ba)莖稈第二節(jié)間的厚壁細胞最長，并且在6份材料中TaGAMyb-Ba的表達量最高，但其平均株高卻不是最高。這一結(jié)果進一步體現(xiàn)出小麥株高性狀是一個多基因控制的復(fù)雜數(shù)量性狀，影響株高的因素還需要更加深入的探討。結(jié)合TaGAMyb-B在基部第二節(jié)間相對表達量TaGAMyb-Ba類型材料的轉(zhuǎn)錄本表達量均高于TaGAMyb-Bb類型材料，證明TaGAMyb-B是影響株高建成的主效基因之一。這一研究結(jié)果將會在重組自交群體(兩親本株高差異大，且分別屬于TaGAMyb-Ba和TaGAMyb-Bb兩種等位變異類型)中進一步進行驗證；并且通過轉(zhuǎn)基因的途徑來研究TaGAMyb-Ba和TaGAMyb-Bb兩種等位變異類型對小麥株高的影響。

圖4 兩種等位變異類型小麥的第二莖間縱切面

小麥莖稈結(jié)構(gòu)由外及里依次為表皮、厚壁組織、維管束、薄壁組織和髓腔，其中厚壁組織起到支撐莖稈的作用。組織學(xué)觀察表明，TaGAMyb-Ba和TaGAMyb-Bb兩種基因型材料間莖稈第二節(jié)間厚壁組織厚度沒有明顯差異，但厚壁組織的細胞長度存在顯著差異，且TaGAMyb-Ba基因型材料細胞長度顯著長于TaGAMyb-Bb基因型材料，進一步證明了TaGAMyb-B是影響細胞伸長的一個重要因子，TaGAMyb-Ba對小麥第二節(jié)間的細胞伸長具有促進作用，有助于株高的建成，不利于抗倒伏。

與TaGAMyb-Ba相比，等位基因TaGAMyb-Bb在第一內(nèi)含子中存在一個反向重復(fù)的84 bp 插入序列，該序列與小麥中國春的一個腳手架基因(GenBank登錄號為HG670306.1)有100%的同源性[23]。反向重復(fù)序列在雙鏈DNA中可能引起十字形結(jié)構(gòu)的形成，存在于某些轉(zhuǎn)座子末端，發(fā)揮重要作用[25]。對轉(zhuǎn)座子的研究表明，不同的轉(zhuǎn)座子產(chǎn)生不同的小RNA，對不同基因的表達進行調(diào)控[26]。結(jié)合莖稈第二節(jié)間縱切結(jié)果，推測TaGAMyb-Bb等位基因相對于TaGAMyb-Ba等位基因來說，第一內(nèi)含子中存在的84 bp插入可能扮演轉(zhuǎn)座子的角色，產(chǎn)生小RNA來調(diào)節(jié)細胞伸長相關(guān)基因的表達，從而造成細胞間長度的差異，影響株高。