張繼忠

摘 要 酶聯(lián)免疫吸附測定（enzyme-linked immunosorbent assay， ELISA）的基礎是抗原或抗體的固相化和抗原或抗體的酶標記。測定時，受檢標本（測定其中的抗體或抗原）需先與固相載體表面的抗原或抗體起反應，結合在固相載體表面（包被）。由于抗原或抗體包被時的濃度較低，故還需用大量不相關的蛋白充填固相載體表面空隙（封閉），使之避免在ELISA其后步驟中吸附干擾物質(zhì)而影響測定。本文概要介紹ELISA中各種常用封閉液的作用與選擇。

關鍵詞 酶聯(lián)免疫吸附測定 封閉液 包被物

中圖分類號：R446.61 文獻標志碼：A 文章編號：1006-1533（2018）11-0064-03

Role of blocking solution in enzyme-linked immunosorbent assay and its selection

ZHANG Jizhong*

（Biopharmaceutical Department， Shanghai Pharmaceutical School， Shanghai 200135， China）

ABSTRACT Enzyme-linked immunosorbent assay （ELISA） is based on the immobilization of antigen or antibody and the enzymatic labeling of antigen or antibody. At the time of determination， the specimen to be examined （antibody or antigen therein） needs to first react with the antigen or antibody on the surface of the solid support and then bind to the surface of the solid support （coating）. Due to the low concentrations of the coated antigen or antibody， a large amount of irrelevant proteins are also needed to fill the spacing on the solid support surface （closed）， thus to avoid adsorption of interfering substances that may affect the determination in the subsequent steps of the ELISA. The role and selection of various commonly used blocking solutions in ELISA are outlined in this article.

KEy WORDS enzyme-linked immunosorbent assay； blocking solution； coating substance

自1971年Engvall和Perlmann發(fā)表了應用酶聯(lián)免疫吸附測定（enzyme-linked immunosorbent assay， ELISA）法定量測定免疫球蛋白G的論文后，1966年開始用于抗原定位的酶標抗體技術逐漸發(fā)展成為測定液體標本中微量物質(zhì)的常用方法。

ELISA的基礎是抗原或抗體的固相化和酶標記。結合于固相載體表面的抗原或抗體仍保留了其免疫學活性，而酶標記的抗原或抗體既保留了抗原或抗體的免疫學活性，又保留了酶的活性。測定時，受檢標本與固相載體表面的抗原或抗體發(fā)生反應，隨后加入的酶標記的抗原或抗體也會通過反應結合于固相載體上。此時固相載體上的酶量與標本中待測物質(zhì)的量呈一定的比例關系。再加入酶反應底物，底物被酶催化形成有色產(chǎn)物，因該產(chǎn)物的量與待測物質(zhì)的量直接相關，故可根據(jù)其呈色深淺用于定性或定量分析。ELISA的敏感度很高，重復性亦好。

1 ELISA中的封閉及常用封閉液

抗原或抗體包被時的濃度較低，固相載體吸附后其表面尚有未被抗原或抗體占據(jù)的空隙。封閉就是讓大量不相關的蛋白充填這些空隙，從而使之避免在ELISA其后步驟中吸附干擾物質(zhì)、影響測定。換言之，封閉是固相載體繼被抗原或抗體包被后再為高濃度的無關蛋白溶液（被稱為“封閉液”）包被的過程。

理想的封閉液應滿足以下條件：①抑制待測物質(zhì)與固相載體表面的非特異性結合；②抑制非特異性蛋白-蛋白相互作用；③不與其后加入的試劑（抗體、蛋白A等）發(fā)生交叉反應；④能減少待測物質(zhì)因相轉(zhuǎn)變而發(fā)生的蛋白變性或幫助其復性；⑤與酶及可影響測定結果的其他物質(zhì)的反應性低；⑥不會引起特異性蛋白或活性分子與固相載體表面的脫結合；⑦與固相載體表面的結合牢固，批間重復性好。

常用的封閉劑有牛血清白蛋白（bovine serum albumin， BSA）、脫脂奶粉、明膠、全血清和乳化劑等[1]。

1.1 BSA

BSA的常用濃度為1% ～ 3%。BSA的售價較便宜，且可在4 ℃下以固體形態(tài)干燥保存或用滅菌水配成溶液保存。BSA用作封閉劑已獲普遍認可，其可很好地與中、高吸附強度的固相載體表面結合，且與蛋白A相容。

BSA封閉液的缺點是：①存在批間差異性，主要由所含脂肪酸引起，故BSA用作封閉劑時應盡可能地降低其中的脂肪酸含量；②含有磷酸酪氨酸，會與抗磷酸酪氨酸抗體發(fā)生交叉反應；③會發(fā)生抗體與BSA-半抗原（小分子半抗原，單獨不會引起免疫反應，但BSA與之結合后則可引起免疫反應）結合物的交叉反應；④不能封閉離子型、共價型和具疏水性的固相載體表面。

1.2 脫脂奶粉和酪蛋白

脫脂奶粉的常用濃度為0.1% ～ 5%，其售價相對便宜，但批間質(zhì)量差異較大。有研究顯示，在候選的幾種脫脂奶粉中只有一種有可接受的批間一致性和穩(wěn)定性[2]。此外，無論是國產(chǎn)、還是進口的脫脂奶粉，如保存不當，都會很快變質(zhì)。酪蛋白是脫脂奶粉的組分之一，其能用作一種穩(wěn)定的封閉劑。

脫脂奶粉在緩沖溶液中較純酪蛋白更易分散。鑒于這個特點，脫脂奶粉對一些硬塑料制固相載體表面的封閉效果較純酪蛋白好。但脫脂奶粉封閉液也存在著一些與反應性相關的缺點：①含有磷酸酪蛋白，會與抗磷酸酪蛋白抗體發(fā)生交叉反應；②有些脫脂奶粉含有組蛋白，會干擾抗DNA抗體的測定；③有些脫脂奶粉含有可抑制堿性磷酸酶活性的成分；④會與親合素發(fā)生交叉反應。

1.3 明膠

明膠用作封閉劑也較普遍，但其有一些較大的缺點：①單用明膠封閉液的封閉效果較差；②明膠主要通過蛋白-蛋白相互作用產(chǎn)生封閉作用，但其有時亦會遮蔽特異性的固相載體表面結合蛋白，從而影響免疫反應性；③明膠較差的封閉效果和蛋白遮蔽性質(zhì)還會導致測定時的系統(tǒng)本底偏高和敏感性降低；④明膠同樣存在批間質(zhì)量差異問題。

明膠封閉液的最大特點是不會與哺乳動物抗體和蛋白A發(fā)生交叉反應。

1.4 全血清

對于非常困難的固相載體表面封閉，一般推薦選用10%全血清。后者由于所含分子的多樣性，能有效封閉固相載體表面的非特異性位點。

用作封閉劑的全血清應盡量不選用兔或鼠來源的，因這兩種來源的全血清在親緣關系上與人類的非常接近，故與人抗體發(fā)生交叉反應的幾率較大，會導致測定時的系統(tǒng)本底偏高[3]。應選用來源于小牛、山羊等的全血清。

1.5 非蛋白物質(zhì)

甲醛可與聚偏氟乙烯制固相載體表面的微結構反應或結合，使之失去與蛋白結合的疏水力或空間結構域。

吐溫-20是一種非離子型去污劑，有使抗原復性的作用，可為固相載體表面疏水性吸附，具有很強的非特異性吸附洗脫作用，同時可降低蛋白間的疏水性相互作用，提高特異性抗體識別能力。不過，吐溫-20封閉液的封閉效果不穩(wěn)定，易被水或緩沖液洗脫。因此，在吐溫-20單獨用作一種封閉劑時，后續(xù)操作中的稀釋液和緩沖液里均應有一定量的吐溫-20成分。吐溫-20與蛋白類封閉劑聯(lián)用可洗脫其他已非特異性結合至固相載體表面的雜蛋白，此在ELISA中非常有用。但在脂多糖的測定中不能使用吐溫-20封閉液，因兩者間會發(fā)生交叉反應。

2 固相載體與封閉液的匹配

固相載體在ELISA中用作吸附劑和容器，不參與各種反應?？捎米鱁LISA中固相載體的材料很多，最常用的是聚苯乙烯。后者具有較強的蛋白吸附能力，抗體或蛋白類抗原被其吸附后仍保留原有的免疫學活性，加之價廉，在ELISA中得到廣泛應用。

2.1 不活潑的固相載體

1）疏水性固相載體 疏水性固相載體的吸附能力在不活潑固相載體中居中等，其表面可被吐溫-20或蛋白類封閉液很好地封閉。研究表明，聯(lián)用0.02%吐溫-20和1% BSA的封閉效果更好，可用作大多數(shù)疏水性固相載體表面的理想封閉液[4]。

2）兼有疏水型和離子型結合位點的固相載體 這是一類具有高吸附能力的固相載體，與免疫球蛋白G的結合能力很強，但對其表面的封閉較疏水性固相載體困難，聯(lián)用0.02%吐溫-20和一種蛋白類封閉液（1% BSA、0.2%脫脂奶粉或10%全血清等）可有效減少抗體的非特異性結合。

3）高電荷非疏水性固相載體 這類固相載體只適用于小分子離子型物質(zhì)的包被，因此其表面封閉也應選用相對分子量較小的封閉劑，以免遮蔽包被物，同時選用的封閉劑還需有一定的離子特性，以利于與帶電荷的固相載體表面發(fā)生相互作用。對高電荷非疏水性固相載體表面的封閉，一般可選用1% ～ 3%的BSA和0.2% ～ 2%的脫脂奶粉作為封閉液，但當包被的活性分子為小分子物質(zhì)時，則須選用10%氨基乙醇等作為封閉液。

2.2 共價型固相載體

1）胺類固相載體 對這類固相載體表面的封閉，應選用與惰性疏水性、離子型和共價型結合位點均可發(fā)生相互作用的蛋白類封閉液。如無特殊要求，一般選用0.2% ～ 2%的脫脂奶粉為封閉液。吐溫-20不能用于封閉胺類固相載體表面，但在洗液中加入吐溫-20可增強對固相載體表面吸附的非結合性活性分子的洗脫能力。

2）預激活共價型固相載體 這類固相載體含有疏水性和共價型結合位點，兼性蛋白是其表面封閉的最好選擇。

3 ELISA中封閉液的選用

3.1 與固相載體的關聯(lián)

固相載體是ELISA中的重要組成部分，其分為不活潑的和共價型兩大類，由于與測定相關的所有反應均發(fā)生于固相載體表面，所以固相載體對封閉液的選用有較大的影響。

疏水性和高電荷非疏水性固相載體均對封閉液有所要求，其中高電荷非疏水性固相載體因只適用于小分子離子型物質(zhì)的包被，故其封閉液也應選用相對分子量較小的物質(zhì)如氨基乙醇等來制備（常用濃度為10%）。不過，對同時含有疏水型和離子型結合位點的固相載體，封閉液的選用主要取決于待測活性分子的種類而非固相載體本身。

3.2 與包被物的關聯(lián)

目前常用的封閉液如牛血清白蛋白、脫脂奶粉、明膠、小牛血清等溶液均對包被物沒有影響，但在制備酶聯(lián)板的過程中需對板進行徹底的沖洗，以洗脫未包被在板上的封閉液內(nèi)蛋白和包被物，提高測定時的特異性和降低系統(tǒng)本底。

3.3 與待測活性分子的關聯(lián)

聯(lián)用0.02%吐溫-20和一種蛋白類封閉液（1% BSA、0.2%脫脂奶粉或10%全血清等）能有效減少固相載體表面與抗體或抗原的非特異性結合，其中蛋白類封閉液的選用取決于待測活性分子的種類。

3.4 封閉劑本身的特點

常用的封閉劑有BSA、脫脂奶粉、明膠、全血清、吐溫-20等。總的來說，脫脂奶粉是一種非常出色的封閉劑。由于具有分子多樣性和兼性的特點，對許多共價型固相載體表面來說，脫脂奶粉是首選的封閉劑。

全血清（小牛血清、山羊血清）為血清類封閉劑，但其封閉液的制備較其他封閉液復雜，主要體現(xiàn)在滅菌方面，傳統(tǒng)的氣壓式蒸汽滅菌或滅活均會降低其封閉效果，所以一般采用0.22 μm膜過濾滅菌，在滅菌量過小時有操作不便的弊端。

BSA、明膠、吐溫-20一般不單獨用作封閉劑，它們基本上多是與其他類封閉劑以適當比例混合后聯(lián)用的，其中聯(lián)用0.02%吐溫-20和1% BSA可用作大多數(shù)具有中等吸附能力的固相載體表面的理想封閉液。

4 結語

使用封閉液的目的在于提高ELISA的準確性，而選用封閉液則需考慮多種因素，包括固相載體的類型、待測活性分子的種類和封閉液自身的特點等。適宜的封閉液應能抑制各種非特異性結合，且不會與待測物質(zhì)和檢測試劑發(fā)生相互作用。

參考文獻

[1] 焦奎， 張書圣. 酶聯(lián)免疫分析技術及應用[M]. 北京： 化學工業(yè)出版社， 2004： 96-107.

[2] Gibbs J. Effective blocking procedures. ELISA technical bulletin No. 3 [EB/OL]. [2018-01-17]. http：//www.doc88. com/p-7864239831977.html.

[3] 李秀玲， 倪道明. 人抗動物抗體對免疫學測定的干擾作用[J]. 國外醫(yī)學：預防、診斷、治療用生物制品分冊， 2001， 24（6）： 266-270.

[4] 劉蘇燕， 董邦全， 周雪慧， 等. 吐溫20、BSA和8種血清在ELISA中抑制作用的比較[J]. 天津醫(yī)藥， 1991， 19（6）： 373-374.