歐虹雅, 韓冬苗, 黃茲寶, 張明康, 周聰聰, 高炳淼

海南醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院, ?？?571199

益智(AlpiniaoxyphyllaMiquel)為姜科山姜屬植物，其果實(shí)為常用中藥益智仁，味辛、性溫，具有暖腎固精縮尿、溫脾止瀉攝唾的功效[1,2]。野生益智主要生長于雨量充足、氣候濕潤的山坡林地。目前，益智的種植方式主要為人工栽培，常種植于海南島各山區(qū)或人工橡膠林下，此外，在廣東、廣西、云南、福建等地也有少量的種植[3]。益智的化學(xué)成分主要為萜類、黃酮類、二苯基庚烷類、酚類、甾醇類等，其中，倍半萜類、二苯基庚烷類是其重要活性成分[4～6]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，益智具有抗癌、強(qiáng)心、舒張血管、鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛、抗過敏、抗衰老、抗氧化、提高免疫力、保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞等多方面的藥理活性[7～9]。

海南島地處中國最南端，位于熱帶和亞熱帶，擁有獨(dú)特的氣候和地理環(huán)境，藥用植物資源豐富。全島已知的藥用植物資源達(dá)3 100種以上，其中，1 000多種被《全國中草藥匯編》收錄，135種載入《中國藥典》[10]。近幾年，隨著益智藥食功能的開發(fā)，市場(chǎng)需求量不斷增加，使人們開始無節(jié)制的采挖益智，導(dǎo)致野生益智資源逐年減少。因此，保護(hù)南藥益智資源刻不容緩。隨著分子遺傳學(xué)的快速發(fā)展，基于PCR技術(shù)的各種分子標(biāo)記技術(shù)得到了廣泛應(yīng)用，并且因其簡(jiǎn)單易行、快速準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好、成本低、抗污染等優(yōu)點(diǎn)，具有十分廣闊的應(yīng)用前景[11]。序列相關(guān)擴(kuò)增多態(tài)性(sequence-related amplified polymorphism，SRAP)標(biāo)記技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于藥用植物種質(zhì)資源的鑒定、藥用植物的分子機(jī)制和遺傳多樣性的研究，并成為被相關(guān)研究人員使用的熱門技術(shù)之一[12,13]。SRAP標(biāo)記的優(yōu)點(diǎn)是將擴(kuò)增片段長度多態(tài)性(amplified fragment length olymorphism，AFLP)標(biāo)記和隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA(random amplified polymorphism DNA，RAPD)標(biāo)記有機(jī)地結(jié)合在一起，具有簡(jiǎn)單穩(wěn)定、產(chǎn)量中等、高頻共顯性的優(yōu)勢(shì)，同時(shí)，該方法與其他方法相比，如RAPD標(biāo)記、AFLP標(biāo)記、簡(jiǎn)單重復(fù)序列(simple sequence repeat，SSR)標(biāo)記，更能反映表型多樣性和進(jìn)化歷史，故成為近年來比較流行的分子標(biāo)記技術(shù)之一[13,14]。

本研究以南藥益智為材料，采用L16(45)正交試驗(yàn)優(yōu)化并建立適用于南藥益智的SRAP-PCR體系，再以優(yōu)化后的SRAP-PCR體系篩選引物，以期為南藥益智的遺傳多樣性研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)材料 22份樣品材料均為采集于海南不同地理居群的益智的新鮮葉片，采收后使用硅膠干燥，室溫保存。全部樣品經(jīng)海南醫(yī)學(xué)院潘坤副教授鑒定為姜科植物益智。

1.1.2實(shí)驗(yàn)試劑Taq酶、Mg2+、dNTPs、DNA Marker D2000、RNaseA和植物基因組DNA提取試劑盒均來自天根生化科技(北京)有限公司；SRAP引物由深圳華大基因科技有限公司合成；瓊脂糖(Biowest Agarose)購自海南合輝實(shí)業(yè)有限公司；核酸染料(Goidview)購自上海賽百盛公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.3實(shí)驗(yàn)儀器 WD-9402B型PCR擴(kuò)增儀(北京六一生物科技有限公司)；HYQ-2110型微型渦旋混勻器(美國精騏有限公司)；DYY-6D型電泳儀電源(北京六一生物科技有限公司)；核酸蛋白測(cè)定儀(德國Eppendorf公司)；HH-3型恒溫水浴鍋(邦西儀器科技(上海)有限公司)；DYCP-31DN型SDS-電泳槽(北京六一生物科技有限公司)；SIGMA 1-14微型離心機(jī)(德國Sigma公司)；Tanon 4100凝膠成像系統(tǒng)(上海天能科技有限公司)。

1.2 益智DNA提取及其濃度、純度檢測(cè)

將采集的22份益智樣品經(jīng)酒精消毒后，剪碎放入已滅菌的缽體中，添加液氮迅速研磨后，稱取100 mg裝到離心管中，然后根據(jù)植物基因組DNA提取試劑盒的操作步驟提取其DNA。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其濃度，用核酸蛋白測(cè)定儀檢測(cè)其純度。

1.3 SRAP-PCR反應(yīng)體系優(yōu)化

采用L16(45)正交試驗(yàn)(表1)對(duì)Taq酶、dNTPs、Mg2+、引物、DNA模板5個(gè)影響因素進(jìn)行優(yōu)化。然后，隨機(jī)挑選1對(duì)SRAP引物(引物序列見表2)，以最優(yōu)反應(yīng)體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)程序?yàn)?4℃ 3 min；94℃ 1 min，35℃ 1 min，72℃ 1 min，共5個(gè)循環(huán)；94℃ 1 min，50℃ 1 min，72℃ 1 min，共35個(gè)循環(huán)；72℃ 5 min。最后，將PCR產(chǎn)物置于4℃保存。

1.4 SRAP-PCR特異性引物篩選

將合成的正、反向引物(各12條)進(jìn)行自由組合，得到144對(duì)隨機(jī)配對(duì)引物，利用最優(yōu)SRAP-PCR反應(yīng)體系從中篩選出擴(kuò)增效果良好的引物。

表1 正交試驗(yàn)L16(45)設(shè)計(jì)表Table 1 The table of orthogonal test L16 (45) design.

表2 SRAP-PCR所用引物Table 2 Primers used in SRAP-PCR.

2 結(jié)果與分析

2.1 益智DNA樣品提取及其濃度、純度檢測(cè)

采用植物基因組DNA提取試劑盒提取22份來自海南不同地理居群的益智基因組DNA，提取的DNA樣品經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定(圖1)，DNA條帶均明亮、整齊且未見明顯降解。經(jīng)核酸蛋白測(cè)定儀檢測(cè)，A260/A280比值均在1.8～2.0之間，表明RNA和蛋白質(zhì)去除較為完全。結(jié)合電泳鑒定結(jié)果和A260/A280比值可以確定，提取的益智基因組DNA滿足SRAP-PCR對(duì)DNA質(zhì)量的要求。

2.2 SRAP-PCR反應(yīng)體系優(yōu)化

采用正交試驗(yàn)優(yōu)化SRAP-PCR擴(kuò)增過程中的各影響因素，以表1中的16個(gè)反應(yīng)體系進(jìn)行SRAP-PCR，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定(圖2)。正交試驗(yàn)結(jié)果分析如表3所示，由此得出各因素影響順序：Mg2+>TaqDNA聚合酶>DNA模板=dNTPs>引物，其中，Mg2+以2 mmol/L為佳，TaqDNA聚合酶以0.25 U或0.5 U為佳，DNA模板以10 ng為佳，dNTPs以2 mmol/L最佳，引物以1 μmol/L或4 μmol/L為佳。結(jié)合電泳鑒定結(jié)果，判斷最優(yōu)反應(yīng)體系為7號(hào)，擴(kuò)增后條帶大小在100～2 000 bp之間，且條帶數(shù)最多。

圖1 益智基因組DNA提取樣品鑒定Fig.1 The electrophoresis result of extracted Alpinia oxyphylla Mique genome DNA samples.

圖2 正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化SRAP-PCR體系Fig.2 The optimization of SRAP-PCR system by orthogonal test.

表3 正交結(jié)果分析Table 3 Analysis of orthogonal results.

因此，最優(yōu)反應(yīng)體系(總體積為25 μL)為：Taq酶 0.5 U，dNTPs 4 mmol/L，Mg2+2 mmol/L，引物各 2 μmol/L，DNA模板10 ng，10×PCR buffer 2.5 μL。

2.3 引物初篩與多態(tài)性分析

將正、反向引物(各12條)自由組合，得到144對(duì)引物，以最優(yōu)反應(yīng)體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增，利用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定擴(kuò)增產(chǎn)物后，獲得24對(duì)引物(圖3)。再對(duì)初步篩選出的24對(duì)引物的多態(tài)性條帶數(shù)和多態(tài)率進(jìn)行分析，由表4可知，總條帶數(shù)為164條，其中多態(tài)性條帶數(shù)為138條，平均總多態(tài)率達(dá)84.1%。由24對(duì)引物擴(kuò)增出的總條帶數(shù)最多達(dá)11條，最少為4條，平均每對(duì)引物的擴(kuò)增條帶數(shù)為6.83條，平均多態(tài)性條帶數(shù)為5.75條。多態(tài)率在85%以上的引物共有11對(duì)：f1r2、f6r12、f8r1、f9r1、f9r10、f9r12、f10r2、f10r10、f10r11、f12r6、f12r11，其中f9r10和f10r11的多態(tài)率為100%。結(jié)合擴(kuò)增產(chǎn)物多態(tài)性分析和瓊脂糖凝膠電泳的結(jié)果，獲得7對(duì)適合南藥益智的SRAP-PCR擴(kuò)增引物，分別為f8r1、f9r1、f9r10、f10r2、f10r10、f10r11、f12r6。最后，以f10r11引物為例對(duì)不同地理居群的益智基因組DNA樣品進(jìn)行SRAP-PCR擴(kuò)增，結(jié)果表明篩選獲得的引物能夠滿足南藥益智遺傳多樣性的分析需求(圖4)。

圖3 SRAP-PCR引物篩選電泳結(jié)果Fig.3 The electrophoresis result of primers screened by SRAP-PCR.注：M：Marker；1～24：不同引物(與表4中的編號(hào)相對(duì)應(yīng))的SRAP-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。

表4 SRAP-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物多態(tài)性分析Table 4 The polymorphic analysis of SRAP-PCR amplified products.

圖4 不同地理居群的益智基因組DNA SRAP-PCR鑒定結(jié)果Fig.4 The SRAP-PCR identification result of Alpinia oxyphylla Miquel genomic DNA in different geographical groups.

3 討論

近年來，隨著分子生物學(xué)的快速發(fā)展，分子標(biāo)記技術(shù)在植物學(xué)研究中得到了廣泛而深入的應(yīng)用。DNA分子標(biāo)記技術(shù)是建立在藥用植物遺傳物質(zhì)的基礎(chǔ)上，其結(jié)果不受環(huán)境條件、樣品形態(tài)和物質(zhì)來源的影響，可為藥用植物資源的研究提供更準(zhǔn)確、可靠的信息[15]。劉曉靜[16]應(yīng)用簡(jiǎn)單重復(fù)序列間擴(kuò)增(inter simple sequence repeat，ISSR)分子標(biāo)記方法對(duì)采自海南和廣東的7個(gè)野生益智居群進(jìn)行遺傳多樣性分析。鄒穎[17]采用SSR標(biāo)記技術(shù)對(duì)所采集到的不同地理居群的益智樣品進(jìn)行了遺傳多樣性、遺傳結(jié)構(gòu)和居群親緣關(guān)系的研究。高炳淼等[18,19]利用正交設(shè)計(jì)方法對(duì)益智的AFLP-PCR和ITS-PCR的擴(kuò)增條件進(jìn)行了優(yōu)化。

SRAP標(biāo)記是近年來發(fā)展的一種基于PCR的分子標(biāo)記技術(shù)[11]，已在大黃[20]、甘草[21]、人參[22]、石斛[23]等中藥的研究領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用。但是，尚無該技術(shù)在益智研究中應(yīng)用的報(bào)道。本試驗(yàn)緊密結(jié)合海南省南藥產(chǎn)業(yè)化發(fā)展的實(shí)際情況，針對(duì)南藥益智野生資源不斷受到破壞、其栽培品質(zhì)不斷下降等問題進(jìn)行研究，為野生益智種質(zhì)資源保護(hù)、鑒定和評(píng)價(jià)提供了科學(xué)依據(jù)，同時(shí)也為海南益智的中藥材生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范(good agricultural practices，GAP)種植基地進(jìn)行種質(zhì)資源篩選和藥材地道性評(píng)價(jià)提供了理論基礎(chǔ)。

本研究利用正交試驗(yàn)優(yōu)化SRAP-PCR反應(yīng)中的影響因素，從而快速、省時(shí)地獲得了最優(yōu)PCR擴(kuò)增體系，同時(shí)避免了單因素試驗(yàn)不能兼顧各因素間的交互作用的問題。正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，TaqDNA聚合酶、dNTPs、Mg2+、引物、DNA模板等對(duì)SRAP-PCR擴(kuò)增均有一定的影響，其影響順序?yàn)镸g2+>TaqDNA聚合酶>DNA模板=dNTPs>引物。首先，Mg2+對(duì)益智SRAP-PCR體系的影響最大，高濃度Mg2+易影響酶的活性、擴(kuò)增的可靠性及特異性，而低濃度Mg2+會(huì)影響擴(kuò)增產(chǎn)量甚至導(dǎo)致無法擴(kuò)增出條帶。其次，TaqDNA聚合酶的量過低可導(dǎo)致PCR反應(yīng)不完全，而過高又會(huì)增加非特異性產(chǎn)物，所以TaqDNA聚合酶的用量也是關(guān)鍵。再者，DNA模板和dNTPs兩者對(duì)反應(yīng)體系的影響程度相當(dāng)。高濃度dNTPs會(huì)導(dǎo)致TaqDNA聚合酶的復(fù)制出現(xiàn)錯(cuò)誤，非特異性產(chǎn)物增多；而低濃度會(huì)造成過早用完原料，達(dá)不到理想的擴(kuò)增效果。同樣地,DNA模板濃度過高可導(dǎo)致非特異性產(chǎn)物增多，而濃度過低又會(huì)使擴(kuò)增產(chǎn)物較少。最后，在本研究結(jié)果中，引物濃度對(duì)SRAP-PCR反應(yīng)體系的影響較小。本試驗(yàn)各因素對(duì)反應(yīng)體系的影響順序與唐古特大黃[20]的研究結(jié)果相似，其與本試驗(yàn)不同的是引物和dNTPs的影響順序，這可能是DNA模板差異導(dǎo)致的。本研究通過正交實(shí)驗(yàn)得出SRAP-PCR反應(yīng)擴(kuò)增的最優(yōu)反應(yīng)體系(總體積25 μL)：TaqDNA聚合酶0.5 U，dNTPs 4 mmol/L，Mg2+2 mmol/L，引物各2 μmol/L，DNA模板10 ng，10×PCR buffer 2.5 μL。

引物序列是SRAP-PCR擴(kuò)增過程中的關(guān)鍵，即使建立了最優(yōu)PCR擴(kuò)增體系，倘若引物沒有良好的選擇性和特異性，也無法獲得準(zhǔn)確的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。因此，在獲得最優(yōu)PCR擴(kuò)增體系的基礎(chǔ)上，本研究對(duì)144對(duì)引物進(jìn)行了大量的篩選工作。從中初步篩選出24對(duì)引物，再對(duì)這些引物進(jìn)行SRAP-PCR的多態(tài)性數(shù)據(jù)分析，得出益智總條帶數(shù)為164條，其中多態(tài)性條帶數(shù)達(dá)138條，多態(tài)率為84.1%。最后，篩選出7對(duì)特異性引物，其擴(kuò)增產(chǎn)物片段大小均在100～2 000 bp以內(nèi)且分布較均勻，多態(tài)性條帶比率皆達(dá)85%以上。

本研究通過正交試驗(yàn)對(duì)SRAP-PCR體系各影響因素進(jìn)行優(yōu)化，建立了最優(yōu)的適用于南藥益智的SRAP-PCR體系。又利用最佳SRAP-PCR體系對(duì)特異性引物進(jìn)行篩選，獲得7對(duì)適用于益智遺傳多樣性分析的引物，為南藥益智的遺傳多樣性研究、品種鑒定、親緣關(guān)系分析、遺傳圖譜構(gòu)建等奠定了基礎(chǔ)。