彭 志, 陳剛毅, 劉雪飛, 黃新河*

1.西南交通大學生命科學與工程學院, 成都 611756;2.中國科學院成都生物研究所, 成都 611041

由病原體引起的感染性疾病一直嚴重威脅著人體健康，其可分為傳染性和非傳染性。而抗生素是用于預(yù)防和治療細菌性傳染病的重要藥物，但抗生素的濫用導致具有多重耐藥性的菌株不斷產(chǎn)生，極大地增加了臨床治療的難度，也導致了嚴重的公共衛(wèi)生污染問題。與此同時，各種流感病毒的變異速度也不斷加快，使病毒性疾病的防控和治療面臨著嚴峻的挑戰(zhàn)。病原體檢測是傳染病防控的重要環(huán)節(jié)，然而，傳統(tǒng)的病原體檢測方法存在耗時長、對培養(yǎng)環(huán)境要求高、檢測的樣品量少、檢測價格高等弊端，難以滿足臨床需求。隨著分子生物學研究的發(fā)展和深入，快速、準確、低成本、高通量、適用范圍廣的核酸檢測技術(shù)被廣泛應(yīng)用于病原體檢測中。

脫氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)對于所有形式的生命都是至關(guān)重要的，同時核酸也是生物學研究和醫(yī)學診斷中的重要生物標志物[1]。隨著核酸研究工作的不斷開展，核酸擴增成為基礎(chǔ)研究、傳染病防控、臨床診斷等領(lǐng)域非常重要的工具。聚合酶鏈式反應(yīng)(polymerase chain reaction,PCR)是目前使用最為廣泛的核酸擴增技術(shù)[2]，但PCR有其固有的局限性，如擴增過程需要升降溫度，對PCR儀的依賴性較強，同時對操作人員的專業(yè)技術(shù)要求較高等，從而使其耗時長、成本高，難以實現(xiàn)現(xiàn)場快速檢測。

自20世紀90年代以來，產(chǎn)生了多種等溫核酸擴增技術(shù)，其共同特點是可在固定的溫度條件下實現(xiàn)核酸的快速擴增或檢測。由于反應(yīng)不依賴熱循環(huán)，檢測成本大幅降低，且可實現(xiàn)對食品、農(nóng)作物和病原體等現(xiàn)場快速檢測，極大地提高了檢測效率。在現(xiàn)有的等溫核酸擴增技術(shù)中，關(guān)于環(huán)介導等溫擴增技術(shù)的研究開展最多，其應(yīng)用也最為廣泛。其他較為常見的等溫擴增方法有依賴核酸序列擴增、依賴解旋酶擴增、重組酶聚合酶擴增。本文綜述了上述等溫擴增技術(shù)的核酸擴增原理、重要特性及其在病原體檢測中的應(yīng)用進展，以期為此類技術(shù)的推廣和應(yīng)用提供參考。

1 等溫核酸擴增技術(shù)

得益于分子生物學和體外模擬核酸擴增技術(shù)的快速發(fā)展，自20世紀90年代初以來，已開發(fā)了數(shù)十種采用各種放大機制的等溫核酸擴增技術(shù)。其中，大多數(shù)技術(shù)對于核酸的檢測具有相當高的靈敏度，且部分技術(shù)已經(jīng)取得了商業(yè)上的成功[3,4]。因而，在此綜述幾種研究較多、應(yīng)用較廣的等溫擴增技術(shù)的原理、特性等，如依賴核酸序列擴增(nucleic acid sequence-based amplification，NASBA)、環(huán)介導等溫擴增(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)、依賴解旋酶擴增(helicase-dependent amplification，HDA)、重組酶聚合酶擴增(recombinase polymerase amplification，RPA)。

1.1 依賴核酸序列擴增技術(shù)

依賴核酸序列擴增技術(shù)是1991年由Compton[5]提出的用于擴增單鏈RNA序列的技術(shù)。其過程依賴于3種酶：禽成髓細胞瘤病毒(avian myeloblastosis virus，AMV)反轉(zhuǎn)錄酶、核糖核酸酶H(RNase H)和T7 RNA聚合酶，以及2種特異性引物：引物1的3′端與目標序列的3′端互補，5′端帶有可被T7 RNA聚合酶識別的啟動子，而引物2來源于目標序列的5′端。

其擴增單鏈RNA中特定序列的過程可分為非循環(huán)階段和循環(huán)階段。在非循環(huán)階段，引物1與模板RNA中的目標序列結(jié)合，在AMV反轉(zhuǎn)錄酶的作用下，從引物1的3′端開始延伸，合成模板RNA的1個cDNA拷貝，從而形成RNA:DNA雜合體，再由RNase H消化RNA，余下的單鏈DNA與引物2結(jié)合，與啟動子區(qū)域互補，形成雙鏈DNA。T7 RNA聚合酶通過識別啟動子，將其轉(zhuǎn)錄為與初始RNA互補的目標序列RNA(-)，每個初始RNA可產(chǎn)生100個拷貝，而新合成的RNA(-)又可作為循環(huán)階段的模板。在循環(huán)階段，引物2先與模板結(jié)合，并在反轉(zhuǎn)錄酶的作用下延伸，從而形成RNA:DNA雜合體，再由RNase H消化RNA。而引物1與余下的單鏈DNA結(jié)合，反轉(zhuǎn)錄合成帶有啟動子的雙鏈DNA，然后在T7 RNA聚合酶的作用下，又轉(zhuǎn)錄為RNA(-)。

上述步驟不斷循環(huán)最終獲得大量的與初始RNA互補的目標序列RNA(-)。在41℃條件下，NASBA技術(shù)在1.5～2 h內(nèi)可實現(xiàn)109倍的擴增，擴增效率與逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(yīng)(reverse transcription-PCR，RT-PCR)相當。由于單鏈RNA易產(chǎn)生二級結(jié)構(gòu)，因此，擴增復(fù)雜的RNA需要先于65℃孵育消除二級結(jié)構(gòu)，從而更利于擴增反應(yīng)的進行。此外，由于RNA易降解，所以整個擴增和檢測反應(yīng)都需要嚴格控制反應(yīng)條件以防止RNA降解。NASBA也可用于DNA的擴增，最常用的方式是在擴增前將DNA加熱變性，再依照同樣的原理和步驟進行反應(yīng)，擴增產(chǎn)物仍是RNA[6]。

1.2 環(huán)介導等溫擴增技術(shù)

環(huán)介導等溫擴增技術(shù)于2000年首次被Notomi等[7]提出，受到了世界衛(wèi)生組織、各國學者和相關(guān)政府部門的高度關(guān)注。之后，關(guān)于LAMP技術(shù)的研究陸續(xù)開展。該方法利用4條引物[外引物F3和B3、正向內(nèi)引物(forward inner primer，F(xiàn)IP)和反向內(nèi)引物(backward inner primer，BIP)]來識別待擴增的DNA序列兩端的6個特異性結(jié)合位點(引物與模板鏈之間的序列關(guān)系如圖1A,彩圖見圖版二)，以實現(xiàn)等溫擴增反應(yīng)。LAMP反應(yīng)依賴于具有鏈置換活性的DNA聚合酶來進行延伸，包括2個階段：起始結(jié)構(gòu)產(chǎn)生階段(第一階段)和循環(huán)擴增階段(第二階段)。

在第一階段(如圖1B)中，F(xiàn)IP與模板結(jié)合延伸產(chǎn)生的單鏈DNA被通過外引物F3延伸產(chǎn)生的單鏈DNA置換出來，隨后，此單鏈DNA充當2個引物(BIP和B3)的模板，配對延伸形成啞鈴狀的DNA結(jié)構(gòu)。第二階段(如圖1C)中，內(nèi)引物識別結(jié)合啞鈴狀DNA的loop區(qū)域，循環(huán)擴增過程由2對內(nèi)引物交替啟動，使得靶序列以指數(shù)倍增長，可在1 h內(nèi)積累109個拷貝。

2002年，Nagamine等[9]提出通過加入loop引物的方法來加速整個擴增過程，使擴增時間縮短了一半。2003年，Mori等[10]發(fā)現(xiàn)LAMP擴增反應(yīng)中產(chǎn)生的焦磷酸與溶液中的鎂離子結(jié)合產(chǎn)生的沉淀可使整個體系變得渾濁，從而提出了通過檢測濁度變化對反應(yīng)進行實時監(jiān)測。但通過濁度監(jiān)測擴增過程并不具有特異性，即如果擴增的是非目標序列也能產(chǎn)生沉淀。2011年，Kubota等[11]設(shè)計了一種包含熒光標記(fluorescence label)和淬滅基團(quencher)的同化吸收探針(assimilating probe)來實時監(jiān)測擴增過程。因探針只能和目標序列特異結(jié)合，從而解決了檢測信號的特異性問題。最近，Qin等[12]將免疫磁珠分離技術(shù)與LAMP相結(jié)合，從而快速、特異地檢測出碎牛肉中的大腸桿菌。由于LAMP具有在擴增核酸靈敏度上的優(yōu)越性能，使其能夠捕獲和檢測到肉樣品中濃度低至3×101CFU/mL的細菌。因而，適合作為基礎(chǔ)實驗室和實地檢測中的篩選實驗。然而，由于LAMP技術(shù)中所使用的4種引物要與6個目標區(qū)域覆蓋，使得LAMP的引物設(shè)計非常復(fù)雜，這也是該擴增方法在實際應(yīng)用中的難點。此外，啞鈴狀的DNA結(jié)構(gòu)一旦產(chǎn)生，其后的循環(huán)擴增反應(yīng)便不需要外引物也能非常靈敏、高效的進行，但若在同一個環(huán)境對同一段目標序列進行重復(fù)實驗，則極易造成陰性對照組的污染[13]。故市面上利用LAMP技術(shù)的商業(yè)病原體檢測試劑盒多為一次性使用產(chǎn)品。

1.3 依賴解旋酶擴增技術(shù)

依賴解旋酶擴增是一種通過模擬體內(nèi)DNA復(fù)制來進行擴增的方法[14]。與聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)不同的是，該方法能等溫擴增更長的DNA序列，而這正是目前醫(yī)學臨床診斷和生物學基礎(chǔ)研究所迫切需要的。在HDA中，DNA解旋酶(helicase)被用來解開初始目標序列，隨后，引物再與產(chǎn)生的DNA單鏈結(jié)合，在DNA聚合酶(polymerase)的作用下形成新的目標DNA序列。與PCR類似，HDA反應(yīng)也分為3步：模板分離、引物結(jié)合與引物延伸，只是雙鏈DNA是通過解旋酶打開的，而不是PCR中利用溫度升高而實現(xiàn)的DNA變性解旋。最初的HDA反應(yīng)中，由于大腸桿菌UvrD解旋酶的熱穩(wěn)定性很弱，反應(yīng)溫度固定為37℃[15]。后來，Motré等[16]發(fā)現(xiàn)一種熱穩(wěn)定蛋白質(zhì)酶，該酶實質(zhì)上是Tte-UvrD和Bst DNA聚合酶通過卷曲螺旋域連接在一起的復(fù)合體，使得該反應(yīng)能在較高的溫度(60～65℃)下高效率地進行，提高了對病原體和單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphisms，SNPs)位點檢測的特異性和靈敏度。PCR的添加劑(如二甲基亞砜、甜菜堿、山梨糖醇等)可減少DNA二級結(jié)構(gòu)的產(chǎn)生，并有利于引物退火，同樣也可在HDA擴增中有效地提高目標序列的產(chǎn)量和特異性[17]。但是，這些添加劑也會極大地降低聚合酶的活性。因此，測試不同濃度以找出每個擴增系統(tǒng)的最佳條件非常重要。HDA還可與納米技術(shù)結(jié)合，2017年，Sedighi等[18]開發(fā)了一種納米顆粒輔助的新型HDA,稱為nanoHDA。該方法利用對單鏈DNA(single-stranded DNA, ssDNA)具有優(yōu)先親和力的金納米顆粒(Au nanoparticles，AuNPs)來提高解旋酶的變性效率。同時，納米顆粒的相同親和性還可以抑制引物二聚體的形成，從而提高特異性。目前，Sedighi等[18]已經(jīng)實現(xiàn)用nanoHDA對來自結(jié)直腸癌患者的基因組DNA樣品中的KRAS基因進行基因分型。

1.4 重組酶聚合酶擴增技術(shù)

重組酶聚合酶擴增是利用重組酶解開雙鏈模板的一種等溫擴增方法，其無需預(yù)處理DNA樣品即可實現(xiàn)核酸的指數(shù)擴增。Piepenburg等[19]證明了該技術(shù)能檢測少于10個拷貝的基因組DNA，反應(yīng)敏感、特異且快速。在重組酶聚合酶擴增中，通過重組酶-引物復(fù)合體識別雙鏈模板同源區(qū)域來啟動整個過程。一旦復(fù)合物找到特定的結(jié)合位點，重組酶即可解開雙鏈，允許引物和靶序列的雜交。這個過程由單鏈DNA結(jié)合蛋白(single-stranded DNA-binding protein，SSB)輔助，將其結(jié)合到被打開的DNA單鏈上，從而使整個過程得以延續(xù)。然后引物延伸合成新的DNA單鏈，取代舊鏈。新合成的雙鏈又可作為下一個周期的模板，從而實現(xiàn)指數(shù)放大。RPA可在低溫(37～42℃)條件下于40 min內(nèi)積累數(shù)百萬的目標DNA拷貝[19]。近幾年，研究人員發(fā)現(xiàn)在RPA中加入反轉(zhuǎn)錄重組聚合酶(reverse-transcription recombinase polymerase)，能實現(xiàn)RNA的擴增，進而為RNA病原體的檢測開辟新的道路[20]。最近，Garrido-Maestu等[21]對RPA進行了開發(fā)及廣泛的評估。在純細菌DNA的評估中，RPA比qPCR的靈敏度高10～100倍，并且針對真實食物樣品測試時，顯示了高度的一致性。此外，該方法的檢測限極低(低于10 CFU/25 g)。因此，證明了RPA的優(yōu)秀性能及其在食品工業(yè)中實施的充分性。

圖1 環(huán)介導等溫擴增方法的原理[8]Fig.1 Principle of loop-mediated isothermal amplification method[8].注：A：LAMP反應(yīng)的引物設(shè)計。為了便于解釋，在目標DNA上標出了6個不同的區(qū)域，從5′端標記為F3、F2、F1、B1c、B2c和B3。由于c代表互補序列，F(xiàn)1c序列與F1序列互補。在LAMP方法中使用2個內(nèi)部引物(FIP和BIP)和外部引物(F3和B3)。FIP(BIP)是由F1c(B1c)序列和F2(B2)序列組成的雜交引物；B：起始結(jié)構(gòu)產(chǎn)生階段。從FIP開始的DNA合成如下：F2區(qū)與目標DNA上的F2c區(qū)結(jié)合并啟動延伸，以類似的方式用BIP進行DNA擴增。F3引物與目標DNA上的F3c區(qū)域結(jié)合，并發(fā)生鏈置換DNA合成。從FIP延長的DNA鏈被替換并釋放，釋放的單鏈在其3′端形成環(huán)結(jié)構(gòu)(結(jié)構(gòu)3)。DNA合成以單鏈DNA為模板進行，BIP和B3引物按照上述的相同方式產(chǎn)生結(jié)構(gòu)5，結(jié)構(gòu)5兩端具有環(huán)狀結(jié)構(gòu)(整體呈啞鈴狀結(jié)構(gòu))；C：循環(huán)擴增階段。使用自身結(jié)構(gòu)作為模板，從3′端F1區(qū)開始自引發(fā)的DNA合成，并且延伸從FIP與環(huán)結(jié)構(gòu)中F2c區(qū)的單鏈結(jié)合開始。經(jīng)過上述步驟，產(chǎn)生與結(jié)構(gòu)5互補的結(jié)構(gòu)7，并且結(jié)構(gòu)5由類似于從結(jié)構(gòu)5～7引出的反應(yīng)的結(jié)構(gòu)8產(chǎn)生。結(jié)構(gòu)9和10分別由結(jié)構(gòu)6和8制成，并且還制造更多的細長結(jié)構(gòu)[8]。(彩圖見圖版二)

表1對上述核酸擴增技術(shù)的參數(shù)及性能進行了概括，并分析比較了各自的優(yōu)缺點。

表1 核酸擴增技術(shù)概括比較Table 1 Comparison of nucleic acid amplification techniques.

2 等溫核酸擴增技術(shù)在病原體檢測中的應(yīng)用

核酸序列的檢測在現(xiàn)代生物學和醫(yī)學中是至關(guān)重要的，自20世紀90年代以來，這一領(lǐng)域開展的研究和成果呈指數(shù)級增長，并且在未來的幾十年可能會持續(xù)增加[22]。病人樣本中病原細菌、病毒和癌癥基因的檢測對于影響病人恢復(fù)起著至關(guān)重要的作用。聚合酶鏈式反應(yīng)是使用最為廣泛的DNA擴增的方法，用于檢測和鑒定傳染病、遺傳病及其他方面的研究。由于PCR循環(huán)期間需要通過加熱以解鏈雙鏈，因此，PCR不適合用于檢測活細胞中的核酸序列。等溫核酸擴增技術(shù)，特別是可在細胞適宜溫度(30～37℃)下工作的技術(shù)可以用于旨在了解活細胞中基因時序表達模式的相關(guān)研究。對于體外檢測，有時有限的資源配置無法滿足進行PCR測定的需求。由于上述PCR所具有的DNA/RNA檢測分析中的局限性，促進了各種等溫檢測技術(shù)與平臺的開發(fā)。在實際的病原體檢測中，已有許多研究報道將等溫核酸擴增技術(shù)應(yīng)用其中[22]。

2.1 以DNA為遺傳物質(zhì)的病原體檢測

大多數(shù)等溫擴增技術(shù)能以極高的靈敏度擴增和檢測DNA。在這些方法中，由于LAMP、HDA和RPA在序列擴增中的出色表現(xiàn)而被更為廣泛的用于病原體基因組DNA的檢測中。

結(jié)核病是一種乙類傳染病，病死率約為12.5%。傳統(tǒng)的臨床檢測方法需要涂布培養(yǎng)細菌，時間較長，而Motré等[23]利用HDA快速檢測結(jié)核分枝桿菌(mycobacterium tuberculosis，MTB)，通過逐步優(yōu)化引物和酶的用量，使得擴增2個拷貝的MTB基因組DNA的放大時間從60 min減少到30 min以內(nèi)。該反應(yīng)在65℃的恒定溫度下進行，且不需要將模板進行熱變性，使其成為真正的等溫。同時，該方法使用無需儀器的自攜式一次性紙盒即可實現(xiàn)檢測，從而將交叉污染的可能性降至最低。因此，整個檢測程序只需要一個便宜的加熱塊，適用于資源有限的地區(qū)。

沙門氏菌是一種主要的食源性病原體，在環(huán)境中普遍存在，并可導致嚴重的人畜疾病，傳統(tǒng)的沙門氏菌檢測方法費時費力。依賴嗜熱解螺旋酶擴增(thermophilic helicase-dependent amplification，tHDA)是一種較新的等溫核酸擴增技術(shù)，該技術(shù)利用解旋酶在恒定溫度下解鏈雙鏈DNA，實現(xiàn)等溫核酸擴增。Du等[24]將該技術(shù)與側(cè)向流動測定相結(jié)合，開發(fā)了一種快速、簡單和便攜的沙門氏菌檢測方法，可以在90 min內(nèi)提供可視化的檢測結(jié)果，適用于設(shè)備有限的地區(qū)。

快速、靈敏地檢測大量樣品中的低量病原體對于患者的早期診斷和治療十分關(guān)鍵。Dao等[25]將RPA和微流體平臺結(jié)合，開發(fā)了一種新型病原體富集平臺。利用新平臺檢測10 mL含沙門氏菌尿液和含布魯氏菌尿液的靈敏度分別比無富集過程的實時PCR高20倍和10倍。該技術(shù)通過提高對大樣本中病原體的捕獲效率來更好地診斷病原體，提高了對于致病DNA的檢測極限，具有良好的應(yīng)用前景。

早期診斷對于依賴種子傳播的真菌病原體是十分重要的，從而可以避免病原體的繁殖，減少經(jīng)濟損失和不必要的殺菌劑的使用。傳統(tǒng)的檢測種子真菌的技術(shù)是基于孵化和成長，該方法雖然簡單但是耗時，需要真菌學實驗相關(guān)操作技能。最近，基于DNA分析的新鑒定技術(shù)已被應(yīng)用，且由于其具有的高靈敏度和特異性，使其在應(yīng)用中非常高效、實用。如LAMP已被廣泛用于相關(guān)檢測中。蔓枯病菌是一種引起葫蘆科作物果皮枯萎的致病真菌，Yao等[26]開發(fā)了一種快速、直觀和靈敏的LAMP分析方法，用于檢測葫蘆科作物中的真菌病原體。而黑穗病是一種在甘蔗種植區(qū)廣泛流行的真菌病，Su等[27]利用LAMP開發(fā)的黑穗病真菌病原體檢測方法的靈敏度比常規(guī)PCR檢測方法高100倍。由于等溫核酸擴增技術(shù)具有諸多優(yōu)點，其在未來也可延伸用于種子中真菌病原體的檢測。

HDA可以將復(fù)雜生物基質(zhì)的目標序列(如粗細菌裂解液或血液)擴增106倍[14]，也可以用于檢測多種目標序列，如基于大腸桿菌UvrD的HDA系統(tǒng)可以擴增來自幽門螺桿菌、大腸桿菌、淋病奈瑟菌、齒密螺旋體、馬來絲蟲和人細胞的各種基因組DNA的靶序列[14]。最近，Andresen等[28]在芯片上實現(xiàn)了用HDA來進行DNA擴增，為該技術(shù)應(yīng)用于臨床快速檢測提供了實際依據(jù)，同時也展現(xiàn)了HAD所具有的巨大潛力。

2.2 以RNA為遺傳物質(zhì)的病原體檢測

目前，艾滋病在世界范圍內(nèi)廣泛流行，對人類健康、經(jīng)濟發(fā)展和社會穩(wěn)定都產(chǎn)生了嚴重的威脅。而快速、可靠地檢測艾滋病毒感染有助于促進早期治療，可顯著提高治療效果。重組酶聚合酶擴增(RPA)技術(shù)，可以在不需要復(fù)雜設(shè)備的情況下，在20 min內(nèi)快速擴增來自多種HIV-1亞型的原病毒DNA。同時，等溫核酸擴增技術(shù)也適用于以RNA為遺傳物質(zhì)的病原體檢測。Lillis等[29]將逆轉(zhuǎn)錄酶和RPA相結(jié)合(RT-RPA)，用于檢測HIV-1病毒RNA及其前病毒的DNA，這種RT-RPA HIV-1檢測方法的檢測限為10～30個確切序列匹配的DNA或RNA拷貝，是一種新型的、可以快速、準確診斷HIV的高度敏感的工具，同時也適用于診斷嬰兒HIV。

嚴重急性呼吸系統(tǒng)綜合癥(SARS)呈現(xiàn)出死亡率高、蔓延速度快的特點，且其臨床表現(xiàn)不明確，沒有已知的治療或預(yù)防方法，這些因素強調(diào)了對其進行早期診斷的必要性。Keightley等[30]進行了SARS-CoV的實時依賴核酸序列擴增(NASBA)的測試，設(shè)計了許多引物/信標組以針對SARS-CoV基因組的不同區(qū)域，并進行了敏感性和特異性檢測，發(fā)現(xiàn)N目標序列始終比Pol目標序列更為敏感。目前，多靶實時NASBA檢測已被成功開發(fā)，并用于SARS-CoV的敏感檢測。

為了快速檢測高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒(highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syn-drome virus，HP-PRRSV)2型，Yang等[31]開發(fā)了一種基于熒光探針的實時逆轉(zhuǎn)錄重組酶聚合酶擴增(real-time RT-RPA)的測定方法，通過在反應(yīng)體系中加入熒光探針使結(jié)果可視化。實時RT-RPA可高特異性地擴增HP-PRRSV，與經(jīng)典PRRSV、經(jīng)典豬瘟病毒、偽狂犬病病毒和口蹄疫病毒無交叉反應(yīng)。

2.3 其他類型的病原體檢測

阿米巴病被列為世界上10種最常見的寄生蟲病之一。傳統(tǒng)的顯微鏡檢查法、培養(yǎng)法操作時間長、技術(shù)要求高，且檢出率低，而抗原檢測法雖然更為準確，但有些情況下還是會發(fā)生檢測遺漏[32]。Nair等[33]開發(fā)了一種利用重組酶聚合酶擴增特異性檢測溶組織內(nèi)阿米巴的方法，由于其成本低、靈敏度高、適用于現(xiàn)場診斷，使其具有更高的可用性，有助于在流行地區(qū)快速診斷和治療阿米巴病。

Doseeva等[34]闡述了用于檢測沙眼衣原體(Chlamydiatrachomatis，CT)和淋病奈瑟氏球菌(Neisseriagonorrhea，NG)的4重tHDA測定的發(fā)展和優(yōu)化。該測定方法顯示出較高的CT/NG同時檢測分析的靈敏度和特異性，且與各種樣品類型、培養(yǎng)基兼容，同時，測定中使用的等溫反應(yīng)條件和均相終點檢測非常適用于實驗室自動化、高通量篩選應(yīng)用以及即時測試(point-of-care testing)。

立克次體病是一類威脅人類健康的人獸共患病，其病原體均可通過媒介昆蟲與動物宿主之間進行傳播，導致流感樣癥狀。診斷感染立克次體的標準是間接免疫熒光試驗，但這是一種血清學方法，不適用于疾病急性期的病原鑒定。針對這一問題，Kissenk?tter等[35]開發(fā)了一種快速、無限制的方法來檢測所有感染立克次體的物種。以23S和16S rRNA基因作為RPA的擴增序列，10個以內(nèi)的目標序列拷貝可以在7～10 min內(nèi)檢測出來。這種RPA分析方法可在移動手提箱實驗室中實施，以方便偏遠農(nóng)村地區(qū)使用，也為家庭自助式疾病檢測提供了可行的方法。

表2分析比較了不同等溫核酸擴增技術(shù)應(yīng)用于病原體檢測的優(yōu)缺點。

表2 不同等溫核酸擴增技術(shù)應(yīng)用于病原體檢測比較Table 2 Comparison of isothermal amplification techniques detecting pathogen.

3 展望

在過去的二三十年里，多種在等溫條件下即可實現(xiàn)擴增的核酸檢測技術(shù)取得了長足發(fā)展[36]。其中多種方法已被證實可用于擴增模板量極少的序列，并在臨床檢測中展現(xiàn)出巨大的潛力。

隨著生物、化學、納米材料等研究的不斷深入，等溫檢測也從中獲益，檢測目標已經(jīng)從DNA/RNA擴大到細胞、蛋白質(zhì)、小分子甚至離子。此外，研究人員充分證明了這些方法也可應(yīng)用于測序、原位標記和細胞內(nèi)生物成像等領(lǐng)域，更有研究表明使用等溫擴增方法產(chǎn)生的擴增子可用于構(gòu)建通用的核酸納米材料[37]，這顯示出其在生物醫(yī)學生物成像和生物傳感等方面也具有廣闊的應(yīng)用前景[38～42]。最近，研究人員發(fā)現(xiàn)，加入生長增殖由DNA分析物觸發(fā)的微生物，可降低可視化的核酸診斷試劑的成本[43]，這為等溫核酸擴增技術(shù)廣泛應(yīng)用于病原體檢測提供了有利條件。此外，將等溫擴增集成到微系統(tǒng)或便攜式設(shè)備中，促進了基于核酸的POC診斷技術(shù)的發(fā)展，大量研究表明，現(xiàn)有的等溫核酸擴增技術(shù)可表現(xiàn)出與基于PCR的分析相媲美、甚至更好的性能[44]。隨著溶液系統(tǒng)復(fù)雜度的降低，相關(guān)診斷設(shè)備和試劑盒已逐漸走向市場，并已開發(fā)出多種商業(yè)化產(chǎn)品。

不僅限于上文所涉及到的幾種等溫核酸擴增技術(shù)，其他技術(shù)在病原體檢測中也有重要的應(yīng)用。到目前為止，已將滾環(huán)擴增技術(shù)(rolling circle amplification，RCA)整合到芯片中。Reiss等[45]在流通系統(tǒng)中進行RCA，可以在熒光顯微鏡下觀察擴增產(chǎn)物。此外，美國馬薩諸塞州沃爾瑟姆的Alere公司發(fā)布了一種基于粘連和延伸擴增反應(yīng)(nicking and extension amplification reaction，NEAR)的檢測試劑盒，可在15 min內(nèi)檢測到A型和B型流感病毒，總成本約為40美元。

然而，現(xiàn)有的等溫核酸擴增技術(shù)用于病原體檢測中，仍存在以下問題：①核酸指數(shù)擴增的過程中存在放大偏差和非特異性擴增，這對模板基因組的有效濃度提出了更高的要求；②盡管便攜式POC診斷設(shè)備的商業(yè)產(chǎn)品已經(jīng)面世，但其集成技術(shù)仍存在較大的進步空間(如基于試紙或微流控芯片的檢測平臺需要控制無溶劑的反應(yīng)環(huán)境，尚無法實現(xiàn))，其改進依賴于工程、物理和生物科學的進一步發(fā)展。

總而言之，等溫核酸擴增技術(shù)的良好性能有助于其與前一代非等溫的核酸擴增技術(shù)(如PCR)進行競爭，并可廣泛應(yīng)用于樣品檢測。這些方法的簡便性、恒溫性以及對小型化與自動化的高度適應(yīng)性，在開發(fā)可用于臨床或現(xiàn)場檢測的手持式DNA診斷設(shè)備中展現(xiàn)出巨大潛力。