劉 敏,張紀(jì)亮,張春暖,齊 茜,崔 偉,馮海洋 (河南科技大學(xué)動物科技學(xué)院,水環(huán)境與動物安全實(shí)驗(yàn)室,河南 洛陽471023)

有機(jī)錫化合物廣泛應(yīng)用多種工業(yè)用途.其中,三丁基錫(TBT)因其作為海洋船只的防污涂料添加劑被廣泛使用,造成全球水體環(huán)境的普遍污染[1].最近,在水體、海洋水產(chǎn)品和生活用品中均檢測到TBT[2-4].人類通過攝入海洋水產(chǎn)品暴露于TBT已被廣泛報(bào)道,一些污染嚴(yán)重地區(qū)居民每天人均攝入量可高達(dá)上百微克[5-8].通過對我國部分城市市售海產(chǎn)品中的污染物水平調(diào)查,顯示丁基錫污染普遍存在[9-10].研究得出我國居民 TBT攝入濃度范圍為 0.003～0.006μg/(kg?d)[11].另外,人類還可能通過接觸聚氯乙烯塑料制品等方式暴露于有機(jī)錫.在人體血液和肝臟中已經(jīng)檢測出TBT存在[12-13].TBT對哺乳動物的毒性效應(yīng)主要體現(xiàn)在免疫、神經(jīng)、生殖和肝毒性外,并引起細(xì)胞發(fā)生凋亡、壞死或自噬[14-19].因此,目前TBT對人的暴露可能成為常態(tài),環(huán)境水平TBT暴露對人類健康的威脅應(yīng)引起重視.

近年來,在傳統(tǒng)毒理學(xué)的基礎(chǔ)上,預(yù)測毒理學(xué)不斷發(fā)展.大量毒理學(xué)數(shù)據(jù)庫開始出現(xiàn),如比較毒理組學(xué)數(shù)據(jù)庫(CTD),京都基因和基因組百科全書(KEGG),注釋、可視化和集成發(fā)現(xiàn)數(shù)據(jù)庫(DAVID),化學(xué)物生物活性預(yù)測系統(tǒng)(PASS)等.這些數(shù)據(jù)庫提供的“大數(shù)據(jù)”是非常高效的分析工具,通過多種分析方法與工具的靈活應(yīng)用,可以有效從大量數(shù)據(jù)中發(fā)現(xiàn)潛在的生物影響信息,為毒理學(xué)研究開辟新的方向.例如,通過結(jié)合KEGG和CTD,能夠預(yù)測黃酮類化合物和雌激素受體結(jié)合對生物影響[20];結(jié)合 Gene Ontology(GO)能夠?qū)θ祟惣膊〉闹虏C(jī)制進(jìn)行推測[21];結(jié)合 ToxCast預(yù)測毒性機(jī)制,能夠分析體內(nèi)藥物誘發(fā)潛力[22];還可以應(yīng)用CTD開發(fā)新的疾病和藥物相關(guān)性預(yù)測系統(tǒng)[23].我國預(yù)測毒理學(xué)研究尚處于起步階段,本研究通過應(yīng)用預(yù)測毒理學(xué)數(shù)據(jù)庫,預(yù)測分析TBT暴露與人類相關(guān)疾病的關(guān)系,預(yù)測結(jié)果將為TBT毒理學(xué)進(jìn)一步的研究指明方向,為TBT的環(huán)境政策決策提供依據(jù).

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來源

CTD(http://ctdbase.org)提供了從文獻(xiàn)手動策劃的化學(xué)-基因、基因-疾病和化學(xué)-疾病的關(guān)聯(lián).本研究根據(jù)2017年7月CTD更新的數(shù)據(jù)[24]進(jìn)行分析.更新后,核心CTD包括14672種化學(xué)物質(zhì)、42761個基因和 6401個疾病的手動策劃相互作用(包括 1379105化學(xué)物-基因、202085化學(xué)物-疾病和33 583基因-疾病直接相互作用).CTD還可以通過手動策劃產(chǎn)生預(yù)測推論.例如,某化學(xué)物(A)與某基因(B)相互作用,如基因 B單獨(dú)與某疾病(C)相關(guān),則化學(xué)物A被推斷與疾病C(通過基因B)有關(guān)聯(lián).

1.2 CTD分析

CTD提供了一套基于網(wǎng)絡(luò)的分析工具(http://ctdbase.org/tools/).本研究中主要應(yīng)用了 Set Analyzer(http://ctdbase.org/tools/analyzer.go),其可對化合物或基因集合進(jìn)行富集分析,如疾病、通路以及基因間的相互作用.進(jìn)入CTD的TBT界面后,應(yīng)用Set Analyzer分析CTD手動策劃篩選出的與TBT具有相互作用的基因(共計(jì) 488個).另外,CTD 整合了來自BioGRID的基因-基因和蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用信息.將這488個基因(NCBI基因符號或IDs)輸入CTD的 Set Analyzer,即可快速得到這些基因間的相互作用網(wǎng)絡(luò)圖.CTD的超幾何分布計(jì)算和Bonferroni法多重檢測校正[25]可進(jìn)行疾病富集性研究.系統(tǒng)默認(rèn)顯著性校正P值為0.01.通過分析,生成與488個基因具有相互關(guān)系的疾病,共計(jì)492個.

1.3 基因功能和網(wǎng)絡(luò)分析

KEGG(http://www.kegg.jp/;http://www.genome.jp/kegg/),是一個包含了基因組、生物學(xué)途徑、疾病、藥物、化合物集合的數(shù)據(jù)庫.KEGG PATHWAY是該數(shù)據(jù)庫的核心資源,將許多實(shí)體(包括基因、蛋白質(zhì)、RNAs、化合物、聚糖和化學(xué)反應(yīng))以及疾病基因和藥物靶標(biāo)整合的途徑圖集合,作為個體條目存儲在KEGG的其他數(shù)據(jù)庫中[26].CTD整合了KEGG通路信息.為了進(jìn)一步挖掘信息,利用注釋、可視化和集成發(fā)現(xiàn)數(shù)據(jù)庫(DAVID,https://david.ncifcrf.gov/)對TBT基因集進(jìn)行功能富集分析[27-28],以基因符號作為輸入內(nèi)容,可以觀察到TBT和疾病之間豐富的KEGG途徑的重疊.

1.4 PASS預(yù)測TBT生物活性

PASS是使用計(jì)算機(jī)輔助,通過化學(xué)結(jié)構(gòu)來預(yù)測生物活性的工具.在 PASS中生物活性被定性描述為有活性和無活性.將TBT簡化分子式SMILES輸入系統(tǒng),可得到活性概率(Pa)和無活性概率(Pi).通過Delta=Pa-Pi,可以預(yù)測TBT的生物活性[29].Delta值越大,表示相關(guān)的生物活性越高.

2 結(jié)果與討論

2.1 CTD分析與TBT相關(guān)的基因

在CTD中,通過手動策劃,共篩選出與TBT具有相互作用的基因488個.PPARG是出現(xiàn)頻次最高的基因(表1).PPARG主要負(fù)責(zé)脂類的分解代謝[30].研究證實(shí)TBT能夠通過PPARG誘導(dǎo)脂肪細(xì)胞分化,引起小鼠體內(nèi)脂肪沉積[31].在作者的研究中也發(fā)現(xiàn)伴隨TBT誘導(dǎo)的魚類精巢脂質(zhì)的蓄積,PPARG表達(dá)增加[32].

表1 應(yīng)用CTD分析與TBT相互作用出現(xiàn)頻次最高的10個基因Table 1 10genes with the highest frequency of interactions with TBT in CTD analysis

圖1顯示了與TBT具有相互作用的488個基因之間相互作用網(wǎng)絡(luò)圖.圖中的每個圈代表一個基因,直線代表基因存在相互作用.圈越大,顏色越深,表明與其他基因的相互作用越強(qiáng),越處于中心地位.可看出,基因TP53擁有相關(guān)聯(lián)基因最多,處于中心地位;其次是ESR1和FN1.TP53為著名的抑癌基因,可在多個腫瘤類型中發(fā)生突變[33];ESR1為雌激素受體alpha,對于雌性的生殖活動起重要作用[34];FN1基因可影響糖尿病并發(fā)癥中的 RET信號和 AGE-RAGE信號通路[35].因此這些基因表達(dá)的改變可能是 TBT誘導(dǎo)相關(guān)疾病中的關(guān)鍵事件.

2.2 CTD分析與TBT相關(guān)的疾病

如圖2所示,與488個基因具有直接相互作用關(guān)系的疾病為 492個.其中,癌癥的比例最高.這和 TBT與抑癌基因TP53相關(guān)性最高的結(jié)果一致.在前10類疾病中,基本都與已經(jīng)報(bào)道的TBT能夠誘導(dǎo)免疫、神經(jīng)、生殖毒性以及引起細(xì)胞發(fā)生凋亡、壞死或自噬的結(jié)果[14-19]一致.值得注意的是,代謝疾病在所有疾病中的比例為10.2%.然而,TBT與代謝疾病的關(guān)系卻很少引起關(guān)注.

圖1 應(yīng)用CTD分析與TBT相關(guān)的基因間相互作用網(wǎng)絡(luò)Fig.1 Network map of genes interacted with TBT in CTD analysis

圖2 CTD分析與TBT可能相關(guān)的前10類疾病Fig.2 Top 10diseases induced by TBT in CTD analysis

2.3 CTD分析與TBT相關(guān)的KEGG通路

表2顯示了與TBT相關(guān)的前10個KEGG通路,可以發(fā)現(xiàn)基因注釋較多的途徑包括代謝、信號傳導(dǎo)、癌癥、免疫系統(tǒng)等.其中與免疫有關(guān)的通路3個(免疫系統(tǒng)、先天免疫系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)驗(yàn)證因子信號通路),與代謝有關(guān)的通路4個(代謝、脂質(zhì)和脂蛋白代謝、代謝通路、蛋白代謝).TBT免疫毒性已經(jīng)開展了較多的研究[36],而 TBT與代謝類疾病的關(guān)系研究還較少,更需要在以后的研究中關(guān)注.在作者的研究中[37],已經(jīng)發(fā)現(xiàn)TBT可能通過誘導(dǎo)肝臟中與脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)、脂質(zhì)存儲、脂酶以及脂生成因子等基因的表達(dá)進(jìn)而誘導(dǎo)肝臟脂肪變性.

2.4 DAVID對KEGG中代謝通路的基因注釋

結(jié)合前述結(jié)果,對TBT所影響的代謝途徑和代謝性疾病進(jìn)行更加深入的分析和研究.應(yīng)用 DAVID對KEGG PATHWAY數(shù)據(jù)庫中人類所有代謝的通路圖進(jìn)行注釋.如圖3所示,發(fā)現(xiàn)基因注釋大多分布于糖的生物合成與代謝途徑區(qū)域,說明TBT可能干擾糖的合成與代謝.

2.5 PASS分析TBT生物活性

表3顯示,TBT可能具有多種與糖代謝相關(guān)的生物活性.如對糖磷酸酶的抑制作用將影響體內(nèi)葡萄糖水平的穩(wěn)態(tài)[38].糖代謝異?？梢鹑梭w多種疾病,其中以糖尿病最為常見[39].因此,可以推測 TBT暴露能夠干擾生物體糖類代謝過程,與人類糖類代謝性疾病有關(guān),如糖尿病、胰島素抵抗等.

表3 PASS分析TBT影響糖代謝的生物活性Table 3 Biological activity of TBT on glucose metabolism predicated by PASS

3 結(jié)論

3.1 在CTD中,共篩選出與TBT具有相互作用的基因488個;基因相互作用網(wǎng)絡(luò)圖顯示TP53處于中心地位,其次是ESR1和FN1.

3.2 CTD分析結(jié)果表明,與TBT相關(guān)疾病中癌癥比例最高;另外,代謝類疾病應(yīng)引起關(guān)注,其在所有疾病中的比例高達(dá)10.2%.

3.3 KEGG通路和DAVID基因功能注釋分析,發(fā)現(xiàn)TBT不僅和代謝性疾病有較高的關(guān)聯(lián)性,其相互作用基因在糖代謝途徑上亦有較密集的基因功能注釋.

3.4 PASS的活性預(yù)測發(fā)現(xiàn)TBT可能影響多種與糖代謝相關(guān)的酶生物活性,提示TBT對糖代謝相關(guān)疾病的影響在今后研究中應(yīng)引起注意.