陸 上， 畢穎敏， 楊 洋， 胡付品， 楊 帆

由于抗菌藥物的廣泛和不合理使用，細菌耐藥問題日益突出。多重耐藥革蘭陰性菌如碳青霉烯類耐藥腸桿菌科細菌（carbapenem-resistantEnterobacteriaceae，CRE）的出現(xiàn)，使現(xiàn)有多數(shù)抗菌藥物失去效力。與此同時，新型抗菌藥物的研發(fā)卻相對滯后，在此困境下，發(fā)現(xiàn)于1947年，后由于腎毒性和神經(jīng)毒性被臨床棄用多年的多黏菌素，憑借其對需氧革蘭陰性菌的良好抗菌活性被重新應用于臨床，并成為治療廣泛耐藥革蘭陰性菌感染的重要選擇[1-2]。

然而，隨著多黏菌素臨床應用的增加，不可避免地出現(xiàn)對其耐藥的菌株。過去認為多黏菌素耐藥都由染色體相關基因的突變引起，如phoP/phoQ，pmrA/pmrB，crrA/crrB等雙組份調控系統(tǒng)相關基因的突變或其負反饋調控基因mgrB的滅活等[3]；2015年，中國學者Liu等[4]首次發(fā)現(xiàn)質粒攜帶多黏菌素基因mcr-1，通過編碼MCR-1，一種磷酸乙醇胺轉移酶，催化磷酸乙醇胺與細菌外膜脂多糖的結合，介導多黏菌素耐藥。隨后mcr-1基因在意大利、南非、美國等多個國家被報道，見于大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌、沙門菌等不同菌屬中[5]。質粒介導mcr-1基因的發(fā)現(xiàn)，表明多黏菌素耐藥基因可在不同菌屬中水平傳播，提示多黏菌素耐藥威脅上升。

為了解國內臨床mcr-1基因的流行情況，本研究對臨床分離腸桿菌科細菌進行了mcr-1基因的篩查，并對mcr-1陽性菌株進行藥敏分析。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源 收集2015—2016年來自全國13個城市不同醫(yī)院的臨床分離腸桿菌科細菌共計1 617株，各醫(yī)院按統(tǒng)一操作規(guī)程將菌株鑒定到種，并記錄菌株的相關標本信息，置甘油肉湯管中-80 ℃冰箱保存。剔除同一患者相同部位的重復分離菌株。藥敏試驗所用質控菌株為大腸埃希菌ATCC 25922，本院抗生素研究所保存菌株。

1.1.2 培養(yǎng)基和抗菌藥物 抗菌藥物包括多黏菌素E、美羅培南、頭孢噻肟等16種抗菌藥物，為中國藥品生物制品檢定所標準品。藥敏試驗所用陽離子調節(jié)肉湯（CAMHB）為美國BD公司產(chǎn)品；LB瓊脂，LB肉湯為英國OXOID公司產(chǎn)品；PCR引物由上海生工生物工程有限公司合成；rTaq酶、蛋白酶K、Xba I限制性內切酶等相關試劑為日本TaKaRa公司產(chǎn)品；低熔點瓊脂糖（Incert）和脈沖場凝膠電泳（PFGE）電泳級瓊脂糖（SeaKem Gold Agarose）購自Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1 藥敏試驗及結果判定 微量肉湯稀釋法測定9株mcr-1陽性菌株對16種抗菌藥物的敏感性，操作步驟和結果判讀參考2017年版美國臨床和實驗室標準化協(xié)會（CLSI）標準[6]。多黏菌素E藥敏結果根據(jù)歐洲抗菌藥物敏感性試驗委員會（EUCAST）標準進行判讀，MIC≤2 mg/L為敏感，MIC＞2 mg/L為耐藥[7]；替加環(huán)素藥敏結果根據(jù)美國食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）標準判讀，MIC≤2 mg/L為敏感，MIC＞8 mg/ L為耐藥；頭孢哌酮-舒巴坦藥敏結果按照CLSI頭孢哌酮的折點判讀，MIC≤16 mg/L為敏感，MIC≥64 mg/L為耐藥[8]；藥敏試驗數(shù)據(jù)采用WHONET 5.6軟件分析。

1.2.2mcr-1基因檢測 煮沸法提取細菌DNA模板，具體步驟參照相關文獻[9]；PCR方法檢測mcr-1基因，所用引物按文獻設計[4]， PCR擴增產(chǎn)物送上海生工生物工程公司測序，測序結果經(jīng)NCBI網(wǎng)站（www.ncbi.nlm.nih.gov）BLAST程序比對分析證實擴增產(chǎn)物基因的正確性。

1.2.3mcr-1陽性菌株PFGE分析 參照美國CDC PulseNet中用于大腸埃希菌的PFGE標準方法進行操作，選用沙門菌H9812作為標準菌。在細胞懸浮液CSB中加入過夜培養(yǎng)細菌，調整菌液濃度至4.0～4.5麥氏單位，取300 μL至1.5 mL離心管中，再加入適量蛋白K和1% Seakem Gold凝膠，凝固后加入裂解液和蛋白酶K裂解，隨后用水和TE buffer重復洗滌。膠塊經(jīng)Xba I進行酶切后電泳、染色成像。圖像轉換后應用BioNumeric數(shù)據(jù)庫軟件處理，選擇Dice相關系數(shù)和UPGMA 進行聚類分析[10-11]。

2 結果

2.1 腸桿菌科細菌mcr-1陽性菌株檢測

1 617株臨床分離腸桿菌科細菌，包括肺炎克雷伯菌（682/1 617，42.2%）、大腸埃希菌（625/1 617，38.7%）、腸桿菌屬（99/1 617，6.1%，其中陰溝腸桿菌68株，產(chǎn)氣腸桿菌31株）、變形桿菌屬（96/1 617，5.9%，其中奇異變形桿菌72株、普通變形桿菌24株）、黏質沙雷菌（48/1 617， 3.0%）、枸櫞酸桿菌屬（34/1 617，2.1%，其中弗氏枸櫞酸桿菌33株，布氏枸櫞酸桿菌1株）、摩根摩根菌（24/1 617，1.5%）和普羅威登菌（9/1 617， 0.6%）。PCR檢測及DNA測序結果顯示，1 617株臨床分離腸桿菌科細菌中，僅9株（0.6%）細菌mcr-1基因檢測呈陽性，9株中1株為肺炎克雷伯菌，8株為大腸埃希菌，其他菌屬未檢測到mcr-1基因。

2.2 mcr-1陽性菌株對常見抗菌藥物的藥敏試驗結果

藥敏結果顯示，9株mcr-1陽性菌株對多黏菌素E均耐藥，多黏菌素E的MIC為4～8 mg/L；全部菌株對頭孢美唑、碳青霉烯類藥物及替加環(huán)素均敏感；除1株大腸埃希菌外，其余菌株對第三、第四代頭孢菌素和氨曲南均耐藥。8株大腸埃希菌對哌拉西林-他唑巴坦均敏感； 9株細菌對慶大霉素、環(huán)丙沙星和左氧氟沙星均耐藥，其中15-W25-21、16-W16-15、16-W16-81同時對阿米卡星耐藥，MIC均＞128 mg/L；環(huán)丙沙星和左氧氟沙星對9株細菌的MIC分別為＞8 mg/L和＞ 16 mg/L，見表1。

表1 mcr-1陽性菌株對常用抗菌藥物的MIC及其臨床資料Table 1 The minimum inhibitory concentrations of antimicrobial agents against mcr-1 positive strains and the corresponding clinical data

2.3 mcr-1陽性菌株的標本來源及PFGE分析

9株mcr-1陽性菌株先后于2015年10－12月和2016年5－12月分離獲取，標本來源包括血液、痰、引流液和傷口滲出液，見表1；對其中8株mcr-1陽性大腸埃希菌的PFGE分析顯示，8株mcr-1陽性大腸埃希菌Xba I酶切PFGE，條帶數(shù)目在14～20，條帶分子量25 kb～600 kb， Dice-UPGMA聚類分析8株細菌分屬8個不同型別，未出現(xiàn)同源性高于80%的菌株，見圖1。

圖1 8株mcr-1陽性大腸埃希菌的標本來源及PFGE聚類分析Figure 1 Pulsed- fi eld gel electrophoresis-based clustering analysis of 8 mcr-1 positive Escherichia coli strains

3 討論

在過去的數(shù)十年間，盡管多黏菌素因腎毒性和神經(jīng)毒性一度被臨床棄用，但是在畜牧業(yè)，長期以來各國一直將多黏菌素E用于畜禽的促生長或疾病的預防和治療，其中，中國更是獸用多黏菌素E的最大生產(chǎn)國，亞洲各國（包括中國在內）在多黏菌素E的全球生產(chǎn)中所占的比例為73.1%，其中28.7%出口至歐洲[12]。2015年， 歐盟和北美分別進口了480噸和700噸來自中國的多黏菌素E[12]。全球范圍內多黏菌素E的大量使用，給動物及環(huán)境中的細菌造成強大的選擇壓力，加速了多黏菌素耐藥菌株的選擇，促進了mcr-1的播散。目前，mcr-1基因已在美國、意大利、丹麥、尼日利亞、英國、法國、德國、突尼斯、加拿大等全球35個國家相繼報道，在動物性食品、水、蔬菜、臨床分離樣本和健康人群體內都有發(fā)現(xiàn)，且已擴散到多種腸桿菌科細菌中，如大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌、產(chǎn)氣腸桿菌、陰溝腸桿菌、沙門菌屬等[13]。其中，mcr-1在動物源性菌株中的檢測率較高，在臨床菌株及健康人類中檢測率維持在較低水平，表明mcr-1基因已經(jīng)廣泛存在于環(huán)境中并可能通過某種途徑由動物傳播給人類[5，14]。

質粒介導mcr-1的出現(xiàn)，引發(fā)了對于多黏菌素耐藥的高度關注和憂慮。本研究篩查了來自全國多個省份和地區(qū)共1 617株臨床分離腸桿菌科細菌，僅9株（0.6%）細菌mcr-1基因檢測呈陽性，其中682株肺炎克雷伯菌中僅1株mcr-1陽性，625株大腸埃希菌中8株（1.3%）mcr-1陽性，其他菌屬中并未檢測到mcr-1基因，表明臨床分離腸桿菌科細菌中mcr-1的檢出率仍比較低，推測這可能與前數(shù)十年我國臨床使用該類藥物較少有關。本研究檢測出的9株mcr-1陽性菌株多黏菌素MIC值僅4～8 mg/L，其他作者報道多黏菌素對mcr-1陽性菌株的MIC值基本上介于2～16 mg/L，處于較低水平[15-16]，同時，藥敏結果顯示，8株mcr-1陽性大腸埃希菌中，除菌株16-W57-09外，其他細菌對頭孢他啶、頭孢噻肟、頭孢吡肟均高度耐藥，但對頭孢美唑及哌拉西林-他唑巴坦卻均高度敏感，大多數(shù)菌株同時也對頭孢哌酮-舒巴坦顯示敏感，高度提示這7株mcr-1陽性大腸埃希菌為AmpC酶陰性但同時攜帶有ESBL基因的多重耐藥菌株。進一步藥敏分析發(fā)現(xiàn)，盡管mcr-1陽性菌株對頭孢菌素、氨曲南、喹諾酮類藥物及慶大霉素敏感性差，但對頭孢美唑、碳青霉烯類藥物、替加環(huán)素均敏感，8株mcr-1陽性大腸埃希菌對哌拉西林-他唑巴坦也大多敏感。因此，質粒攜帶mcr-1基因介導的多黏菌素耐藥相比染色體介導耐藥而言，在目前分離臨床菌株更為少見，耐藥水平相對較低，仍有多種抗菌藥物可供選擇，目前造成的威脅可能不如后者。

8株mcr-1陽性大腸埃希菌來源于不同的省市，且分屬8個不同的PFGE型別，提示其間并無mcr-1陽性菌株的克隆傳播。但既往研究表明，mcr-1存在于多種類型的質粒上如IncI2、IncHI2、IncX4等[17]，這些質粒常常攜帶多種耐藥基因如β 內酰胺酶基因（blaCTX-M、blaSHV-2、blaCMY-2等）、磷霉素耐藥基因fosA3和喹諾酮耐藥基因oqxAB等[18-19]，并可通過結合轉移至多種臨床常見的宿主細菌如大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌和銅綠假單胞菌等，威脅耐藥革蘭陰性菌的治療[4]。因此在我國多黏菌素恢復供應、使用日益增長情況下，攜帶mcr-1和其他藥物耐藥基因的質?？稍谄溥x擇壓力下發(fā)生水平傳播，導致對β內酰胺類、多黏菌素、磷霉素、氟喹諾酮類等重要抗菌藥物多重耐藥的威脅亦隨之增長，因此，應對mcr-1基因在臨床分離菌的檢出情況和攜帶該基因菌株的藥敏進行持續(xù)監(jiān)測和密切關注。