張 翅 吳建國 徐慧燕 唐 莉 朱雅寧 潘德林△

[1.華潤三九（雅安）藥業(yè)有限公司，四川 雅安 625000；2.成都中醫(yī)藥大學，中藥資源系統(tǒng)研究與開發(fā)利用省部共建國家重點實驗室培育基地，四川 成都 611137]

參附強心顆粒是以古代經(jīng)典名方 “參附湯”為依據(jù)，在中藥大品種參附注射液基礎(chǔ)上開發(fā)的創(chuàng)新型中藥新藥，主要由紅參、附片兩味藥材和相應的輔料組成[1]，治療領(lǐng)域是慢性心力衰竭（CHF）。 CHF 是各種心血管疾病發(fā)展的終末階段[2]，病情復雜，預后不良，成為世界范圍重要健康問題[3]。心力衰竭患者的臨床表現(xiàn)越典型，經(jīng)常伴隨心力衰竭的許多合并癥也越明顯，如高血壓、房顫、糖尿病、貧血和腎臟受損等，一般病程較長，需要長期服藥[4]。現(xiàn)代藥理研究表明，鹽酸多巴胺為附子的水溶性強心成分，能夠加強心肌收縮力以及加快心肌的收縮速度[5]，靜脈注射 40 μg/kg 可使大鼠血壓升高50%，3 μg/mL則可使豚鼠的右心房和頻率分別增加250%和120%[6-7]。鹽酸多巴胺在臨床上治療頑固性心力衰竭，其臨床效果顯著[8-9]，可提高患者的心排血量，降低患者左心室充盈壓，改善患者的臨床癥狀，促進患者的治療和恢復，且并未出現(xiàn)明顯的不良反應[10]。本實驗旨在建立能夠測定參附強心顆?；钚猿煞种畸}酸多巴胺的高效液相法，以便為更好的控制參附強心顆粒質(zhì)量提供科學依據(jù)。

1 材 料

1.1 儀器 AE-240電子天平（METTLER）；Agilent1 100高效液相色譜儀；AS20500超聲儀（SCIENCE）；pH計（SARTORIUS pH-10）；KQ-500 型超聲儀（40 KHz，500W）；XP26百萬分之一電子分析天平（METTLER TOLEDO）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

JADE-PAK ODS-AQ-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動相：0.1%磷酸水（A）-乙腈（B），梯度洗脫，0～15 min，100%～97%A。流速 0.6 mL/min，柱溫 35 ℃，進樣量 10 μL，檢測波長 280 nm[11-13]。 理論塔板數(shù)按鹽酸多巴胺計算應不低于3000。

2.2 對照品溶液的制備

精密量取鹽酸多巴胺對照品5.35 mg，置50 mL容量瓶中，加蒸餾水定容，得到質(zhì)量濃度為107.000 μg/mL的溶液，再精密量取1 mL置10 mL容量瓶中，加蒸餾水定容，即得到質(zhì)量濃度為10.700 μg/mL的對照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備

精密稱取參附強心顆粒4.1634 g，加pH等于1的鹽酸水100 mL超聲溶解，得到質(zhì)量濃度為41.634 mg/mL供試品溶液。取適量供試品溶液用0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，按照“2.1”項下方法進行檢測。

2.4 陰性對照溶液的制備

取除附片藥材外的其余藥材按處方比例和工藝條件制成缺附片陰性樣品，再按“2.3”項下方法制成陰性對照溶液。

2.5 檢測波長的選擇

采用紫外分光光度計對鹽酸多巴胺對照品溶液在波長210～400 nm[6]的范圍內(nèi)進行掃描，結(jié)果表明鹽酸多巴胺對照品溶液在波長280 nm處有最大吸收，與文獻一致。故選擇波長280 nm為測定波長。

2.6 方法學考察

2.6.1 線性范圍考察 見表1，圖1。精密吸取對照品1、2、4、8、12、16、20 μL，進樣，按照“2.1“項下方法進行檢測。以色譜峰面積為縱坐標，對照品鹽酸多巴胺進樣量（μg）為橫坐標繪制標準曲線，得到回歸方程Y=1099.3X+0.4694（r=1），說明鹽酸多巴胺在0.0107～0.2138 μg范圍內(nèi)與范圍內(nèi)峰面積呈良好線性關(guān)系。

2.6.2 精密度試驗 見表2。精密吸取鹽酸多巴胺對照品溶液10 μL，重復進樣6次，按照“2.1”項下相應色譜條件檢測，記錄峰面積，結(jié)果鹽酸多巴胺的峰面積RSD為0.257%，表明儀器精密度良好。

圖1 對照品鹽酸多巴胺液相圖

表1 對照品線性關(guān)系

表2 精密度試驗結(jié)果

2.6.3 穩(wěn)定性試驗 見表3。精密量取常溫放置同一供試品溶液，分別于 0、1、2、4、8、24 h 進樣，按照“2.1”項下相應色譜條件檢測，記錄峰面積，結(jié)果樣品中鹽酸多巴胺的平均質(zhì)量濃度為4.92 μg/mL，RSD為0.99%，表明該供試品溶液在室溫24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

表3 穩(wěn)定性試驗結(jié)果

2.6.4 重復性試驗 見表4。精密稱量供試品，按照“2.3”項下方法制備供試品溶液，各6份，按照2.1項下相應色譜條件檢測，記錄峰面積，結(jié)果樣品中鹽酸多巴胺的平均含量為0.1194 mg/g，RSD 1.51%，表明該方法重復性良好。

研發(fā)投入強度(RD)：創(chuàng)新與制造業(yè)結(jié)構(gòu)緊密相關(guān)，本文使用研發(fā)投入占GDP的比重衡量創(chuàng)新程度，記為RD。

表4 重復性試驗結(jié)果

2.6.5 加樣回收試驗 見表5。精密吸取已知鹽酸多巴胺含有量的供試品溶液（4.98 μg/mL）10 mL，平行 6份，置25 mL容量瓶中，分別加入對照品溶液5 mL，用蒸餾水定容至25 mL，搖勻，濾過，取適量續(xù)濾液按照“2.1”項下相應色譜條件檢測，記錄峰面積，計算加樣回收率。

表5 加樣回收試驗結(jié)果

2.6.6 陰性干擾試驗 見圖2。按“2.1”項下色譜條件，測定缺附片陰性對照樣品，結(jié)果陰性對照樣品在鹽酸多巴胺對照品相同保留位置上未見有相同保留時間的吸收峰，說明參附強心顆粒中其他組分對測定鹽酸多巴胺含量無干擾。

圖2 陰性樣品液相圖

2.7 樣品含量測定

見表6。取3批樣品，按照“2.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下相應色譜條件測定，采用外標法，對3批參附強心顆粒樣品進行測定，有效成分鹽酸多巴胺的含量測定結(jié)果分別為 117.9、116.8 、119.2 μg/g。

表6 樣品含量測定試驗結(jié)果

圖3 對照品液相圖

3 討 論

3.1 慢性心衰是一種嚴重的進行性疾病，患者的心臟泵血功能會逐漸衰退，具有發(fā)病率高，死亡率高等特點，是當今最重要的心血管疾病之一[14-16]。參附強心顆粒是本公司以古代經(jīng)典名方“參附湯”為依據(jù)，在參附注射液基礎(chǔ)上，開發(fā)的新型口服藥物。為保證其臨床療效，制定穩(wěn)定可控的質(zhì)量標準非常必要。

3.2 采用本法測定參附強心顆?；钚猿煞种畸}酸多巴胺，在一定范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，回收率高，精密度高，無陰性干擾。

3.3 本試驗考察了酸水和純水兩種溶劑，結(jié)果酸水溶劑測得鹽酸多巴胺含量為117.9 μg/g，純水溶劑測得鹽酸多巴胺的含量為37.7 μg/g，酸水溶劑較純水溶劑效果好（見圖4，圖5），這可能和鹽酸多巴胺的結(jié)構(gòu)有關(guān)：在酸性條件下呈分子狀態(tài)，易于溶出（見圖6）。

圖4 酸水溶解樣品液相圖

圖5 純水溶解樣品液相圖

圖6 鹽酸多巴胺結(jié)構(gòu)圖

3.4 本實驗考察了多種色譜系統(tǒng)，如：甲醇-水、乙腈-水、甲醇-0.1%磷酸水溶液等，分離效果均不理想，采用乙腈-0.1%磷酸水溶液系統(tǒng)，分離效果較佳。

3.5 本實驗建立的質(zhì)量控制方法對于參附強心顆?；钚猿煞种笜说目刂铺峁┝擞幸鎱⒖?，為今后該產(chǎn)品研發(fā)的質(zhì)量標準制定提供了依據(jù)。