鐘 慧 劉利英 任曉紅 黨 潔 渠淑云 周衛(wèi)東

（1.陜西省核工業(yè)215醫(yī)院，陜西 咸陽 712000；2.陜西省榆林市第一醫(yī)院，陜西 榆林 718000）

卵巢癌是女性生殖器癌癥中病死率較高的惡性腫瘤之一，盡管目前患者的治療效果及生存率有所提高，但由于卵巢癌具有易轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)、耐藥性較強(qiáng)等特點(diǎn)，患者的預(yù)后仍不樂觀，5年生存率不足40%[1-2]。因此，探索出一種有效的腫瘤藥物治療方法，提高卵巢癌的抗腫瘤效果，已成為目前研究的熱點(diǎn)。復(fù)方紅豆杉膠囊是臨床常用的抗腫瘤中藥制劑，具有祛邪散結(jié)等功效，主要用于中晚期肺癌化療的輔助治療[3]。盡管有少數(shù)研究結(jié)果顯示復(fù)方紅豆杉膠囊中主要成分紅豆杉水提取物對(duì)卵巢癌細(xì)胞具有較好的抑制作用，但體內(nèi)實(shí)驗(yàn)卻尚未開展，而該藥物用于卵巢癌臨床治療的相關(guān)研究則更是鮮有報(bào)道[4]。為此，筆者對(duì)復(fù)方紅豆杉膠囊用于人卵巢癌SKOV3裸小鼠移植瘤模型的抗腫瘤作用進(jìn)行了研究，并對(duì)其主要機(jī)制進(jìn)行了探討，期望為卵巢癌的治療及該藥物的新型臨床使用提供思路與方法。現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器

CN-1r型多管架高速自動(dòng)離心機(jī) （美國安捷倫公司）；NM-09型顯微照相系統(tǒng)、Image-proplus 6.0圖像分析系統(tǒng)及Quantity-One軟件 （日本奧林匹斯公司）；TB-718型生物組織包埋機(jī)（武漢安達(dá)科技實(shí)業(yè)有限公司）；HM325型石蠟切片機(jī) （德國米克公司）；Trans-Blot Turbo全能型半干式免疫蛋白轉(zhuǎn)印系統(tǒng)（德國安義生物科技有限公司）。

1.2 藥物及試劑

復(fù)方紅豆杉膠囊（重慶賽諾制藥有限公司，批號(hào)：2016010291）；陽性藥環(huán)磷酰胺片（通化茂祥制藥有限公司，批號(hào)：2017012309）；羧甲基纖維素鈉（美國SIGMA 公司，批號(hào)：91092317）；β-actin（武漢博士德生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：2017031209）；一抗 C型-半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶-3（C-caspase-3）抗體、多重腫瘤抑制因子（MTS）抗體、B淋巴細(xì)胞瘤-2（BCL-2）抗體及細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶（CDK4）抗體（美國SIGMA 公司；批號(hào)依次為：11646811、11664671、11463467 及 11574578）， 二 抗 C-caspase-3、MTS、BCL-2及CDK4抗體 （美國SIGMA公司；批號(hào)依次為：19803461、18928745、 19804826 及 10987467），微量BCA蛋白定量試劑盒 （武漢博士德生物科技有限公司，批號(hào)：2015112109）。

1.3 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞與動(dòng)物

1.3.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞 人卵巢癌SKOV3細(xì)胞購自陜西省疾病控制中心，批號(hào)：201610-2，將SKOV3細(xì)胞置于含100 U/mL青霉素、10%胎牛血清及100 U/mL鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基中，在5%CO2、37℃及飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期，采用生理鹽水沖洗，并制備單細(xì)胞懸液，將細(xì)胞密度調(diào)整至1×107/mL備用。

1.3.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 40只清潔級(jí)BALB/cA-nude雌性裸小鼠購自陜西省疾病控制中心，動(dòng)物使用許可證號(hào)：SCXK（陜）2016-0892，鼠齡 6～8 周，體質(zhì)量 18～22 g。所有小鼠飼養(yǎng)條件為晝夜各半，食物飲水不限制，室溫，55%濕度。

1.4 分組與造模[5]

各組小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后隨機(jī)分為模型對(duì)照組、環(huán)磷酰胺組、復(fù)方紅豆杉膠囊低劑量組及復(fù)方紅豆杉膠囊高劑量組，每組10只。將細(xì)胞密度為1×107/mL的SKVO3細(xì)胞懸液接種于裸小鼠胸壁皮下，細(xì)胞懸液接種量為0.2 mL，待腫瘤生長至100～250 mm3時(shí)即為建模成功。

1.5 給藥方法

根據(jù)復(fù)方紅豆杉膠囊及環(huán)磷酰胺的人體治療劑量，并結(jié)合文獻(xiàn)[6]中人體與動(dòng)物的劑量轉(zhuǎn)換公式來確定本研究中小鼠的治療劑量。小鼠給藥劑量（mg/kg）=12.3×成人劑量（mg/kg），成人體質(zhì)量以 60 kg 計(jì)，復(fù)方紅豆杉膠囊及環(huán)磷酰胺的人體一般劑量分別為1.8 g/d和 0.15 g/d， 換算成小鼠劑量分別為 0.369 g/（kg·d）和0.031 g/（kg·d），選取復(fù)方紅豆杉膠囊的一般給藥劑量為紅豆杉低劑量組 [0.369 g/（kg·d）]，2 倍一般給藥劑量為紅豆杉高劑量組[0.74 g/（kg·d）]。 將未成功建模或死亡的小鼠剔除后，對(duì)剩余小鼠進(jìn)行給藥，紅豆杉低、高劑量組小鼠分別給予0.369、0.74 g/kg的復(fù)方紅豆杉膠囊灌胃，而其余組則予等量生理鹽水灌胃，連續(xù)給藥14 d。

1.6 標(biāo)本采集與檢測(cè)

1.6.1 一般情況 末次給藥24 h后，采用脫頸法將小鼠處死，取其皮下腫瘤組織，檢測(cè)小鼠腫瘤組織長短徑及瘤體質(zhì)量，計(jì)算腫瘤體積與腫瘤抑制率，其中腫瘤抑制率=（模型對(duì)照組腫瘤體積－給藥組腫瘤體積）/模型對(duì)照組腫瘤體積×100%；腫瘤體積=[（長徑×短徑2）/2（mm3）]。

1.6.2 腫瘤組織病理切片 將上述小鼠的腫瘤組織平均分為6部分，取其中一部分，采用4%多聚甲醛液固定，依次經(jīng)過石蠟包埋、蘇木素/伊紅（HE）染色、連續(xù)切片、烤片與封片處理后觀察其病理組織學(xué)變化。

1.6.3 采用免疫熒光染色方法檢測(cè)腫瘤組織中C-caspase-3、MTS、BCL-2及CDK4表達(dá)量 取4份上述腫瘤組織樣本，根據(jù)試劑盒說明書中免疫熒光染色方法對(duì) C-caspase-3、MTS、BCL-2及 CDK4的表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè)：采用石蠟切片脫蠟、水化、抗原修復(fù)、一抗結(jié)合、二抗結(jié)合、復(fù)染及封片，并將封好的切片置于熒光顯微鏡中，對(duì)其進(jìn)行拍照，采用Image-proplus 6.0圖像分析軟件統(tǒng)計(jì)小鼠腫瘤組織中的陽性信號(hào)數(shù)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 復(fù)方紅豆杉膠囊對(duì)卵巢癌小鼠腫瘤病灶一般情況的影響

見表1。造模過程中，模型對(duì)照組及環(huán)磷酰胺組均成功造模且無小鼠死亡，而紅豆杉高劑量組及低劑量組均出現(xiàn)1只小鼠造模失敗但無小鼠死亡。與模型對(duì)照組比較，環(huán)磷酰胺組、紅豆杉高劑量組及紅豆杉低劑量組腫瘤體積與腫瘤質(zhì)量均顯著降低（P＜0.05）。與環(huán)磷酰胺組比較，模型對(duì)照組、紅豆杉高劑量組及紅豆杉低劑量組腫瘤體積與腫瘤質(zhì)量均顯著增高，而紅豆杉高劑量組及紅豆杉低劑量組腫瘤生長抑制率均顯著降低（P＜0.05）。

表1 各組小鼠腫瘤病灶一般情況比較（±s）

表1 各組小鼠腫瘤病灶一般情況比較（±s）

與模型對(duì)照組比較，*P＜0.05；與環(huán)磷酰胺組比較，△P＜0.05。下同。

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2.2 復(fù)方紅豆杉膠囊對(duì)卵巢癌小鼠腫瘤病灶病理學(xué)檢查的影響

見圖1。HE染色結(jié)果顯示，模型對(duì)照組腫瘤病灶中癌細(xì)胞形態(tài)與染色均正常，結(jié)構(gòu)完整且大小均勻。環(huán)磷酰胺組腫瘤病灶中癌細(xì)胞出現(xiàn)大面積凋亡及壞死，而紅豆杉高劑量組及紅豆杉低劑量組小鼠腫瘤病灶中癌細(xì)胞亦出現(xiàn)壞死，但壞死程度均不及環(huán)磷酰胺組。

2.3 熒光免疫組化法檢測(cè)小鼠 C-caspase-3、MTS、Bcl-2及CDK4的表達(dá)情況

圖1 小鼠腫瘤組織病理學(xué)檢查結(jié)果（HE染色，200倍）

見表2。熒光免疫組化染色中，C-caspase-3、MTS、Bcl-2及CDK4陽性均呈現(xiàn)橙紅色分布于腫瘤細(xì)胞中，且呈彌漫性或顆粒狀分布。熒光免疫組化結(jié)果表明，模型對(duì)照組小鼠腫瘤病灶中Bcl-2及CDK4均呈弱陽性或無明顯表達(dá)，而C-caspase-3及MTS均呈強(qiáng)陽性；環(huán)磷酰胺組、紅豆杉高劑量組及紅豆杉低劑量組小鼠腫瘤組織中Bcl-2及CDK4的陽性表達(dá)均呈弱陽性或無明顯表達(dá)，而C-caspase-3及MTS的陽性表達(dá)均呈強(qiáng)陽性。見圖2～圖5。半定量分析結(jié)果表明，與模型對(duì)照組比較，環(huán)磷酰胺組、紅豆杉高劑量組及紅豆杉低劑量組Bcl-2及CDK4相對(duì)表達(dá)量均明顯降低，而C-caspase-3及MTS相對(duì)表達(dá)量均明顯增高 （P＜0.05）。與環(huán)磷酰胺組比較，模型對(duì)照組、紅豆杉高劑量組及紅豆杉低劑量組Bcl-2及CDK4相對(duì)表達(dá)量均明顯增高，而C-caspase-3及MTS相對(duì)表達(dá)量均明顯降低（P＜0.05）。

表 2 各組小鼠 Bcl-2、CDK4、C-caspase-3及 MTS熒光免疫組化相對(duì)表達(dá)量比較（±s）

表 2 各組小鼠 Bcl-2、CDK4、C-caspase-3及 MTS熒光免疫組化相對(duì)表達(dá)量比較（±s）

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圖2 小鼠腫瘤組織中Bcl-2的表達(dá)情況（熒光免疫組化染色，400倍）

圖3 小鼠腫瘤組織中CDK4的表達(dá)情況（熒光免疫組化染色，400倍）

圖4 小鼠腫瘤組織中C-caspase-3的表達(dá)情況（熒光免疫組化染色，400倍）

圖5 小鼠腫瘤組織中MTS的表達(dá)情況（熒光免疫組化染色，400倍）

3 討 論

卵巢癌是臨床常見的女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤，手術(shù)及化療是該疾病的主要治療方法，盡管上述治療手段均較為成熟可靠，但部分老年患者及晚期患者無法耐受手術(shù)治療，化療則存在著全身藥物不良反應(yīng)較大、易出現(xiàn)耐藥性等缺點(diǎn)，而中藥因其具有全身毒副作用小、療效確切及多靶點(diǎn)調(diào)控等優(yōu)點(diǎn)在臨床中備受重視[7-8]。復(fù)方紅豆杉膠囊主要由紅豆杉、紅參及甘草等中藥材所組成，具有活血祛瘀、消腫散結(jié)等功效，臨床常用于肺癌等多種惡性腫瘤的輔助治療[9]?，F(xiàn)代藥學(xué)研究結(jié)果表明，該藥物中主要成分紅豆杉水提取物具有較好的抗腫瘤活性，在體外對(duì)于乳腺癌細(xì)胞等惡性腫瘤細(xì)胞的增殖具有較強(qiáng)的抑制活性[10]。盡管復(fù)方紅豆杉膠囊的抗癌效果已被臨床普遍認(rèn)可，但將其用于乳腺癌治療的研究卻基本未見開展，鑒于該藥物具有較好的抗乳腺癌物質(zhì)基礎(chǔ)，筆者采用人卵巢癌SKOV3裸小鼠移植瘤模型，探討了復(fù)方紅豆杉膠囊對(duì)卵巢癌的抗腫瘤效果，并對(duì)其作用機(jī)制進(jìn)行了闡述，期望為該藥物的新應(yīng)用提供依據(jù)。

細(xì)胞凋亡指的是由基因編碼所調(diào)控的細(xì)胞主動(dòng)自殺，又被稱為程序性細(xì)胞死亡，該過程既是消除機(jī)體異常增殖細(xì)胞的理想途徑，也是生物體維持自身穩(wěn)定的一個(gè)重要機(jī)制，惡性腫瘤細(xì)胞的增殖與凋亡的失衡在癌癥的發(fā)展過程中起到至關(guān)重要的作用[11]。研究結(jié)果表明，C-caspase-3是機(jī)體中重要的促進(jìn)細(xì)胞凋亡因子，在蛋白酶級(jí)聯(lián)切割作用中處于核心位置，該蛋白被激活會(huì)造成腫瘤細(xì)胞大量死亡[12]。Bcl-2能夠提高細(xì)胞中線粒體膜電位水平，抑制C-caspase-3蛋白的表達(dá)與活化，從而阻滯C-caspase-3的促癌細(xì)胞凋亡作用[13]。MTS可有效調(diào)節(jié)細(xì)胞周期G1期的發(fā)展進(jìn)程，并可對(duì)CDK4的表達(dá)起到負(fù)調(diào)節(jié)作用，從而促進(jìn)癌細(xì)胞的凋亡[14]。CDK4則可造成腫瘤細(xì)胞凋亡異常，導(dǎo)致細(xì)胞平衡紊亂而引起癌細(xì)胞呈惡性生長趨勢(shì)[15]。由此可見，C-caspase-3、MTS、Bcl-2 及 CDK4 均是有效反映卵巢癌細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵蛋白，對(duì)于探討藥物對(duì)卵巢癌的治療效果及其作用機(jī)制具有重要意義。

在本研究中，高劑量及紅豆杉低劑量組小鼠病灶體積及腫瘤質(zhì)量均顯著低于模型對(duì)照組，且病理學(xué)觀察結(jié)果顯示腫瘤組織中均可見不同程度的癌細(xì)胞凋亡，提示復(fù)方紅豆杉膠囊可有效抑制卵巢癌腫瘤組織的增長。進(jìn)一步研究結(jié)果顯示，紅豆杉高劑量組及低劑量組小鼠腫瘤組織中Bcl-2及CDK4相對(duì)表達(dá)量均明顯低于模型對(duì)照組，而C-caspase-3及MTS相對(duì)表達(dá)量均明顯高于模型對(duì)照組，提示復(fù)方紅豆杉膠囊具有較好的促腫瘤細(xì)胞凋亡活性，該作用可能是其具有較好抗腫瘤活性的主要機(jī)制之一。

綜上所述，復(fù)方紅豆杉膠囊對(duì)人卵巢癌SKOV3裸小鼠移植瘤模型具有良好的治療作用，且其主要機(jī)制可能與該藥物促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡有關(guān)，值得進(jìn)行深入研究。然而本研究中仍存在藥物具體機(jī)制探討不清等問題，后期還需進(jìn)一步完善。此外，由于小鼠與人體的實(shí)際情況存在著一定的差別，故本研究的實(shí)驗(yàn)結(jié)論是否適用于臨床還需要進(jìn)行深入的驗(yàn)證。