蘇景深 劉恩順 孫增濤 鄭 莉 趙鑫民 陳善夫
(1.天津中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院,天津 300150;2.天津市津南區(qū)咸水沽醫(yī)院,天津 300073;3.天津中醫(yī)藥大學,天津 300193)
過氧化物酶體增殖物激活受體(PPAR)屬于Ⅱ型核受體超家族成員,可分為PPAR-α、PPAR-β(PPAR-δ或NUC-1)和 PPAR-γ 3種亞型,其中PPARγ除具有調節(jié)體內(nèi)糖、脂肪代謝、細胞分化等作用外,在抑制炎癥反應方面亦發(fā)揮重要作用,其在呼吸系統(tǒng)疾病的作用受到越來越多的重視[1]。 TOLL 樣受體 4(TLR4)是調控內(nèi)毒素(LPS)的主要受體和跨膜信號轉導分子,LPS/TLR4/核因子 κB(NF-κB)信號傳導途徑是介導炎癥反應重要的信號傳導通路[2]。目前認為急性肺損傷/急性呼吸窘迫綜合征(ALI/ARDS)的本質是一種炎癥反應,前期研究發(fā)現(xiàn),通腑瀉肺中藥能夠降低血清細胞因子水平,減輕肺組織和全身的炎癥損傷,但是其作用靶點不明確[3]。為此,筆者用LPS復制大鼠ALI/ARDS模型,觀察PPARγ-TLR4/NF-κB表達的改變,探討通腑瀉肺中藥的作用機制。
健康 SD 大鼠 27只,雄性,體質量(200±20) g,購自北京維通利華實驗動物技術有限公司,許可證號:SCXX(京)2012-0001,購入后置天津工程所實驗中心常規(guī)飼養(yǎng)。
1)試藥:自擬通腑瀉肺方(組成:葶藶子20 g,桑白皮 20 g,大黃 30 g,枳實 10 g,厚樸 10 g)中藥免煎顆粒劑,購自天津中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院藥房。生藥劑量比例按照文獻[4]進行換算,生藥質量濃度(0.1701 g/mL)。通腑瀉肺中藥用蒸餾水配置,4℃冰箱保存?zhèn)溆?。大腸桿菌內(nèi)毒素脂多糖(sigma)。超純RNA提取試劑(TaKaRa Code D9108B),反轉錄試劑盒(TaKaRa code DRRO47A),Real-time PCR 試 劑 盒(TaKaRa code DRR420A),5x RNA Loading Buffer(TaKaRa code DRR420A)。腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白介素-1β(IL-1β)、白介素-6(IL-6)、白介素-10(IL-10)ELISA試劑盒均購自上海博谷生物科技有限公司。PPARγ、NF-κB p65、TLR4 抗體均購自 Abcam 公司。免疫組化試劑盒購自北京中杉金橋生物公司。2)儀器:去離子水儀(PALL,Purelab Plu),高速離心機(Centrifuge 5415D,Eppendorf公司), 熒光定量 PCR 儀(ABI7500,Applied Biosystems),分光光度計(NANODROP 2000,Therno scientific),渦旋振蕩儀(QL-902,海門市其林貝爾儀器制造有限公司),轉移脫色搖床(TS-8,海門其林貝爾儀器制造公司)。
動物購入后適應性飼養(yǎng)1周,將大鼠隨機分為空白組、模型組、中藥組,每組9只。參照文獻[5]的造模方法將大鼠置于大鼠固定器,暴露尾部,空白組大鼠尾靜脈注射生理鹽水2 mL/kg;模型組與中藥組尾靜脈注射內(nèi)毒素8 mg/kg,復制ALI/ARDS模型。
空白組大鼠靜脈注射生理鹽水,每次0.01 mL/g。模型組在造模完成后灌服生理鹽水,每次0.01 mL/g。中藥組在造模完成后給予通腑瀉肺中藥灌胃,每次0.01 mL/g,每日1次。第7日各組大鼠予水合氯醛350 mg/kg腹腔麻醉,仰臥固定。打開胸腹腔,行支氣管肺泡灌洗、腹主動脈取血并取右下肺組織。
1.5.1 ELISA法檢測大鼠血清及肺泡灌洗液中TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-10表達 于大鼠腹主動脈取血,離心得到血清后進行ELISA檢測。以bulldog血管夾夾閉左主支氣管,套管針接5 mL空針注入4 mL PBS緩沖液可見右肺膨起,緩慢回抽,反復4~5次后可回收約 2~3 mL 液體。 1200 r/min、4 ℃,離心 10 min,上清,-20℃分裝保存,進行ELISA檢測。分別測定血清中及肺泡灌洗液中TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-10的表達情況,操作步驟按參照試劑盒說明書進行。
1.5.2 免疫組化染色方法檢測檢測肺組織PPARγ、NF-κB p65及TLR4蛋白的表達 將右下肺組織切片行脫蠟、水化處理后,高壓修復抗原,用3%過氧化氫溶液消除內(nèi)源性過氧化酶,血清封閉后各組切片分別加入兔源性PPARγ、NF-κB p65及TLR4多克隆抗體(均為1∶100稀釋),4℃過夜后加入兔二抗,經(jīng)二氨基聯(lián)苯胺蘭(DAB)顯色,光鏡下觀察。 PPARγ、NF-κB p65及TLR4的陽性反應產(chǎn)物均呈棕黃色。光學顯微鏡下隨機觀察5個視野、拍照,代表該動物肺組織蛋白表達強度。應用Image-Pro Plus6.0軟件分析陽性細胞數(shù),同時將空白對照組陽性細胞率設置為100%,計算其他組別的陽性細胞率,并對結果進行統(tǒng)計分析。
1.5.3 RT-PCR 檢測肺 PPARγ、NF-κB p65 及 TLR4 mRNA表達 按照總RNA提取試劑盒說明書提取大鼠肺組織總RNA,紫外分光光度計測總RNA濃度。再根據(jù)反轉錄試劑盒說明書,以大鼠肺組織總RNA為模板,反轉錄合成cDNA。隨后按照擴增試劑盒說明書進行 PCR 擴增。擴增程序為:95℃ 30 s,(95 ℃ 5 s,60℃34 s)×40個循環(huán)。根據(jù)Real-Time PCR原始檢測結果,采用2-△△cta法相對定量。PCR引物堿基序列見表1。
表 1 PPARγ mRNA、NF-κB P65 mRNA、TLR4 mRNA 和Actin 引物設計(5′to 3′)
見表2。與空白組相比較,模型組大鼠血清炎癥因子 TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10 表達水平均升高(P<0.05)。 中藥組TNF-α、IL-6, 表達水平均下降 (P<0.05)。 IL-1β、IL-10水平有下降趨勢(P>0.05)。 與空白組相比較,模型組大鼠BALF中炎因子TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10 表達水平均升高 (P<0.05)。 中藥組TNF-α、IL-6、IL-1β 表達水平均下降(P<0.05),IL-10水平有下降趨勢(P>0.05)。
表2 各組大鼠血清、BALF中TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-10表達比較(ng/L,±s)
表2 各組大鼠血清、BALF中TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-10表達比較(ng/L,±s)
與空白組比較,*P<0.05;與模型組比較,△P<0.05。 下同
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見表3。PPARγ蛋白以細胞核著色為主,為深棕色,細胞漿偶見表達(圖1);NF-κB p65蛋白主要表達于細胞漿,細胞核少量表達,為棕黃色顆粒 (圖2);TLR4蛋白屬于跨膜蛋白,主要表達于內(nèi)皮細胞上,呈淡棕黃色(圖3)。與空白組相比較,模型組大鼠肺組織中 NF-κB p65、TLR4 蛋白表達水平升高(P<0.05),模型組大鼠肺組織中PPARγ蛋白表達水平下降 (P<0.05);與模型組相比較,中藥組大鼠肺組織中NF-κB p65、TLR4蛋白表達顯著下降趨勢(P<0.05)。與模型組相比較,中藥組大鼠肺組織中PPARγ蛋白表達升高(P<0.05)。
表3 各組大鼠肺組織PPARγ、NF-κB p65及TLR4平均光密度值比較(±s)
表3 各組大鼠肺組織PPARγ、NF-κB p65及TLR4平均光密度值比較(±s)
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圖1 各組大鼠肺組織PPARγ表達(DAB染色,400倍)
圖2 各組大鼠肺組織NF-κB p65表達(DAB染色,400倍)
圖3 各組大鼠肺組織TLR4表達(DAB染色,400倍)
見表4。RT-PCR電泳結果顯示模型組較空白組大鼠肺組織中NF-κB p65、TLR4 mRNA表達水平升高(P<0.05),模型組大鼠肺組織中PPARγ mRNA表達水平降低(P<0.05);與模型組相比較,中藥組大鼠肺組織NF-κB p65、TLR4 mRNA表達水平與之相比明顯下降(P<0.05)。與模型組相比較,中藥組大鼠肺組織中PPARγ mRNA表達明顯升高(P<0.05)。
表4 各組大鼠肺組織PPARγ mRNA、NF-κB p65 mRNA及TLR4 mRNA 表達比較(±s)
表4 各組大鼠肺組織PPARγ mRNA、NF-κB p65 mRNA及TLR4 mRNA 表達比較(±s)
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ALI/ARDS狀態(tài)下,炎癥介質大量產(chǎn)生并相互作用,形成網(wǎng)絡,且不斷循環(huán)促進,形成“瀑布樣”反應[4]。近來研究發(fā)現(xiàn),PPARγ在炎癥反應中發(fā)揮重要作用,如潰瘍性結腸炎、動脈粥樣硬化和心肌炎等。其對于呼吸系統(tǒng)疾病的作用受到越來越多的重視[5-6],Cho 等[7]研究發(fā)現(xiàn)15d-PGJ2通過激活PPARγ明顯減輕高氧誘導肺部炎癥及水腫。Morin等[8]進一步研究發(fā)現(xiàn)激活PPARγ可調控p38-絲裂原活化蛋白激酶信號通路,從而在肺部急性炎癥中發(fā)揮抗炎作用。Xiao等[9]發(fā)現(xiàn)PPARγ配體-曲格列酮通過抑制Ⅱ型肺泡上皮細胞TNF-α分泌減輕其凋亡,并增加表面活性物質相關蛋白A的表達,從而對急性肺損傷起保護作用。有研究發(fā)現(xiàn)PPARγ抑制NF-κB介導的炎性信號以維持對于生理炎癥的適當控制。然而,當LPS激活TLR4信號通路時,NF-κB驅使PPARγ降低表達從而加速炎癥過程[10]。
根據(jù)ALI/ARDS臨床表現(xiàn)的呼吸窘迫、發(fā)紺、便秘、腹?jié)M等特點,中醫(yī)學從“肺與大腸相表里”這一體現(xiàn)臟腑相關的整體觀的理論出發(fā),將ALI/ARDS病機特點概括為肺腸同病,治療當以通腑瀉肺為法。通腑瀉肺中藥由大黃、枳實、厚樸、葶藶子、桑白皮組成。方中大黃、厚樸、枳實,可以輕下熱結,除滿消痞;葶藶子、桑白皮瀉肺平喘,行水消腫。全方藥簡力專,既能瀉肺平喘,又能通腑瀉熱,肺腸同治,具有改善患者臨床癥狀,提高生活質量作用。有研究表明通腑瀉肺方法治療肺系膿毒血癥在臨床上取得了較好的療效[11]。曲愛君等[12]研究證明,大黃能顯著降低全身炎性反應綜合征(SIRS)和多器官功能障礙綜合征(MODS)患者血清TNF-α水平。枳實總黃酮提取物可通過抑制COX-2、iNOS及促炎細胞因子(如TNF-α和IL-6)的表達阻斷脂多糖誘導小鼠巨噬細胞RAW264.7中的NF-κB和絲裂原活化蛋白激酶 (MAPK)信號通路,最終發(fā)揮抗炎作用[13-14]。桑白皮可以干預肺熱證,抑制 TNF-α、IL-1β炎癥因子表達可能是其減輕小鼠肺熱證肺組織損傷的主要途徑[15]。
本次實驗結果表明,由LPS復制大鼠ALI/ARDS模型出現(xiàn)炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-10的顯著升高,NF-κB p65、TLR4蛋白及其mRNA表達升高,PPARγ蛋白及其mRNA表達下降。使用通腑瀉肺中藥進行干預后血清中炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-10 的水平下降,NF-κB p65、TLR4 蛋白及其 mRNA表達降低,PPARγ蛋白及其mRNA表達升高。提示通腑瀉肺中藥可以上調ALI/ARDS狀態(tài)下PPARγ的表達,調控TLR4/NF-κB信號通路,降低TLR4介導的“瀑布樣”炎癥反應,控制炎癥反應程度。研究結論為臨床治療提供了新思路。但是由于ARDS發(fā)病過程復雜,通腑瀉肺中藥的作用可能為多環(huán)節(jié)、多靶點,因此需要進一步深入探索。