王根平，劉敏軒，2，張 婷，師志剛，張喜瑞，楊偉紅，李 琳，高 翔，董 立，程汝宏*

（1.河北省農(nóng)林科學(xué)院谷子研究所，國家谷子改良中心，河北省雜糧研究實(shí)驗(yàn)室，河北 石家莊 050035；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所，國家農(nóng)作物基因資源與基因改良重大科學(xué)工程，北京 100081）

自噬是真核生物在生長過程中抵御各種環(huán)境脅迫時(shí)細(xì)胞內(nèi)一種進(jìn)化保守的物質(zhì)代謝降解過程。在逆境脅迫下，細(xì)胞通過自噬將胞內(nèi)多余的蛋白質(zhì)或受損細(xì)胞器進(jìn)行降解并加以循環(huán)利用，從而維持細(xì)胞穩(wěn)定和應(yīng)答環(huán)境脅迫[1，2]。細(xì)胞自噬形式主要有巨自噬、微自噬和分子伴侶介導(dǎo)的自噬3種[3]。在植物中研究最多的是巨自噬[4]。巨自噬首先包被降解物于雙層膜結(jié)構(gòu)的自噬小體（Autophagosome）中，通過自噬小體外膜與液泡膜的融合將包裹物質(zhì)送入液泡腔并完成降解，從而應(yīng)對饑餓或逆境脅迫下營養(yǎng)物質(zhì)的不足[3]。

自噬需要自噬相關(guān)基因（Autophagy-related genes，ATG）編碼蛋白的參與。ATG最先在酵母中發(fā)現(xiàn)[5]，得益于酵母上的工作，目前在擬南芥[6，7]、煙草[8]、水稻[9]、玉米[10]和谷子[11]等植物中也發(fā)現(xiàn)了ATG同源基因。不同植物中已報(bào)道的ATG數(shù)量有30個(gè)左右，分布于基因組的不同位置。ATG蛋白參與細(xì)胞代謝和生長發(fā)育的多個(gè)進(jìn)程，如細(xì)胞程序性死亡、衰老、營養(yǎng)缺乏、液泡形成、逆境脅迫等[5-7]。在正常條件下，ATG處于低水平表達(dá)；在逆境脅迫，如饑餓、干旱、高鹽、氧化脅迫、病毒侵染等誘導(dǎo)下，其表達(dá)量升高[12]。如，谷子ATG8響應(yīng)低氮誘導(dǎo)，在氮源匱乏的條件下表達(dá)量升高[11，13]；煙草ATG6同源基因BECLIN1可以促使病毒感染位點(diǎn)細(xì)胞的死亡，從而阻止病毒向未侵染部分?jǐn)U張[14]；水稻OsATG7-1突變體植株出現(xiàn)生物量和氮利用率降低的缺陷；玉米ATG12突變體植株出現(xiàn)葉片衰老加速和穗發(fā)育畸形的表型[10]。

研究表明，ATG5在自噬體形成和逆境脅迫中起著重要作用。Romain等發(fā)現(xiàn)，擬南芥ATG5蛋白是自噬體形成的關(guān)鍵蛋白，在ATG5突變體植株中不能形成自噬體[15]；另外，擬南芥ATG5突變體植株在低氮和避光條件下出現(xiàn)葉片失綠變黃、葉斑增加、葉片衰老加速等表型特征，而ATG5正常植株可以存活較長時(shí)間[16，17]。然而，有關(guān)ATG5對干旱響應(yīng)的作用機(jī)理研究報(bào)道較少。因此，研究ATG5在干旱脅迫下的表達(dá)模式，對闡釋ATG5在抗旱中的功能作用具有重要意義。

谷子是我國北方重要的糧食作物之一，具有抗旱、耐瘠等特點(diǎn)。Li等[11]在全基因組水平上分析了谷子中ATG相關(guān)基因，共發(fā)現(xiàn)37個(gè)基因，其中有26個(gè)基因與抗旱相關(guān)，包括SiATG1、SiATG2等。以河北省農(nóng)林科學(xué)院谷子研究所育種研究室培育的優(yōu)質(zhì)抗旱、兼抗阿特拉津和拿捕凈除草劑谷子品種冀谷34為試材，分析其ATG5結(jié)構(gòu)及編碼蛋白特點(diǎn)，研究不同干旱處理?xiàng)l件下ATG5在冀谷34中的表達(dá)模式，旨為探索谷子SiATG5在響應(yīng)干旱脅迫中的作用以及冀谷34的抗旱機(jī)理奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

谷子試材為河北省農(nóng)林科學(xué)院谷子研究所育種研究室培育的優(yōu)質(zhì)抗旱、兼抗阿特拉津和拿捕凈除草劑品種冀谷34，其田間抗旱性為1級。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 基因克隆和序列分析 根據(jù)SiATG5登錄號XP_004952117，在Phytozome谷子基因組數(shù)據(jù)庫中搜索，獲得參考基因組SiATG5 DNA序列。以此序列為模板，用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)引物F1/R1（表1）。分別以冀谷34 DNA和干旱脅迫處理后的cDNA為模板，用高保真酶PrimeSTAR HS DNA Polymerase（大連寶生物）進(jìn)行擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為50μL：含5×PCR Buffer 10μL、0.25 mmol/L dNTP 4μL、10μmol/L引物各1μL、Prime SRAR HS DNA聚合酶0.5μL、模板1μL，ddH2O補(bǔ)齊至50μL。PCR反應(yīng)條件：98益熱激活5 s；98益變性10 s，59益退火30 s，72益延伸1.5 min，38個(gè)循環(huán)；72益保溫10 min。采用瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，切膠回收大小約1 400 bp的目的條帶，回收產(chǎn)物與pEASY-Blunt Zero載體連接（北京全式金）后，轉(zhuǎn)化Trans-T1感受態(tài)細(xì)胞，挑取菌落送至上海生工生物工程股份有限公司測序，陽性克隆菌液加甘油后-80益保存?？俁NA提取參照TransZol Up Plus RNA Kit（全式金）試劑盒說明書進(jìn)行；cDNA第一鏈合成按照NovoScript 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix試劑盒（近岸蛋白科技有限公司）說明書步驟進(jìn)行；葉片DNA提取參照植物基因組DNA提取試劑盒（康為世紀(jì)生物科技有限公司）說明書進(jìn)行。

利用DNAMAN軟件進(jìn)行DNA和cDNA序列比對，NCBI ORF Finder分析開放閱讀框（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html），PredictProtein （http：//www.predictprotein.org/）分析二級結(jié)構(gòu)，利用MEGA5.0軟件進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建。

表1 引物序列Table 1 Primers sequences

1.2.2 干旱脅迫處理 脅迫處理于2017年8月在河北農(nóng)林科學(xué)院谷子研究所實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。在裝有細(xì)沙-土混合物（事先已滅菌）的花盆（6 cm×12 cm）中播種谷子，然后置于人工氣候箱中，在16 h光/8 h暗、30益白天/26益夜間、相對濕度65% 條件下進(jìn)行培養(yǎng)。待谷子幼苗長至4-5片葉時(shí)，移至1/2 Hoagland營養(yǎng)液（pH值5.8）中培養(yǎng)；2 d后，選擇長勢一致的幼苗，分別移至PEG-6000濃度0（不含PEG-6000）、6% （輕度干旱）、18% （中度干旱）和30% （重度干旱）的1/2 Hoagland營養(yǎng)液中進(jìn)行干旱脅迫處理[18]。分別在處理后6、12、24 h取葉片，置于液氮中冷凍后在-80益冰箱中保存，備用。每個(gè)處理均3次生物學(xué)重復(fù)。

1.2.3 qRT-PCR 參照SYBR Premix Ex Taq II熒光定量試劑盒說明書（TaKaRa）進(jìn)行。以谷子Actin（Genbank：AF288226.1）作為內(nèi)參基因，SiATG5和內(nèi)參基因的qRT-PCR引物參考Li等[11]文獻(xiàn)，分別為F2/R2和F3/R3（表 1）。qRT-PCR在ABI StepOne Plus Real-Time PCR System上進(jìn)行。每個(gè)處理均3次生物學(xué)重復(fù)，每個(gè)生物學(xué)重復(fù)均3次qRT-PCR重復(fù)。根據(jù)擴(kuò)增曲線確定每個(gè)反應(yīng)的Ct，以Actin為內(nèi)參校正PCR模板的拷貝數(shù)。相對表達(dá)量采用2-駐駐Ct方法計(jì)算[19]。

2 結(jié)果與分析

2.1 SiATG5的克隆及序列分析

分別以抗旱品種冀谷34 DNA和6% PEG-6000干旱脅迫12 h后的cDNA為模板，擴(kuò)增獲得SiATG5gDNA和cDNA全長序列。測序結(jié)果表明二者序列一致，說明SiATG5無內(nèi)含子。序列分析表明，SiATG5ORF（open reading frame）全長1 092 bp，編碼363個(gè)氨基酸 （圖 1）。

圖1 SiATG5氨基酸序列Fig.1 The amino acid sequences of SiATG5

預(yù)測分子量為40.3 kD，理論等電點(diǎn)為5.03，平均疏水性-0.312。二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果表明，SiATG5蛋白二級結(jié)構(gòu)中琢-螺旋占34% ，茁-鏈占12% ，延伸鏈占17% ，無規(guī)則卷曲占37% ，其中含有跨膜螺旋4% （www.predictprotein.org）。YLoc在線軟件預(yù)測該蛋白位于細(xì)胞質(zhì)。酵母ATG5蛋白與自噬體形成有關(guān)，自噬體位于胞質(zhì)中，與SiATG5蛋白預(yù)測定位結(jié)果[20]一致。蛋白序列保守結(jié)構(gòu)域分析表明，SiATG5第77-331含有APG5結(jié)構(gòu)域（Pfam：PF04106），為植物和動(dòng)物ATG5特有結(jié)構(gòu)域。以人ATG12-ATG5復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)（PDB ID：c4gdkB）為模板，預(yù)測SiATG5蛋白三維結(jié)構(gòu)，有效預(yù)測范圍為SiATG5的262個(gè)氨基酸殘基，置信度100% ，覆蓋72% 序列。預(yù)測SiATG5蛋白三維結(jié)構(gòu)（圖2）含有7個(gè)螺旋結(jié)構(gòu)，7個(gè)茁片。

圖2 SiATG5蛋白的三維結(jié)構(gòu)Fig.2 The predicted protein structure of SiATG5

2.2 SiATG5蛋白同源性比較

為了比較SiATG5與其他作物的同源性高低，與單子葉植物、雙子葉植物、哺乳動(dòng)物和酵母中ATG5蛋白序列構(gòu)建進(jìn)化樹，10個(gè)物種共聚為4類，分別是單子葉植物、雙子葉植物、哺乳動(dòng)物和酵母（圖2）。其中，SiATG5與高粱和玉米的同源性最高，其次是水稻和小麥，與雙子葉植物的同源性較低。

圖3 ATG5蛋白進(jìn)化分析Fig.3 Evolutionary analysis of ATG5 in foxtail millet

2.3 PEG干旱脅迫下SiATG5表達(dá)模式分析

圖4 不同干旱脅迫下SiATG5在冀谷34中的表達(dá)水平Fig.4 The express level of SiATG5 in Jigu 34 under different drought stress

采用PEG-6000模擬干旱脅迫，設(shè)置輕度、中度、重度3個(gè)干旱脅迫條件，分析脅迫處理后0 h、6 h、12 h和24 h的SiATG5表達(dá)量變化情況。結(jié)果（圖4）表明，在干旱脅迫處理下，SiATG5的表達(dá)量均較對照升高。在輕度和中度干旱脅迫條件下，隨著脅迫時(shí)間的延長，SiATG5的表達(dá)量均逐漸升高，其中，輕度干旱脅迫6 h、12 h、24 h的表達(dá)量分別較對照提高了0.41倍、0.80倍和1.14倍，中度干旱脅迫6 h、12 h、24 h的表達(dá)量分別較對照提高了1.75倍、2.10倍和2.15倍。SiATG5表達(dá)量在輕度和中度干旱脅迫下隨著脅迫時(shí)間的延長而逐漸升高，以及中度干旱脅迫6 h的表達(dá)量（2.75）大于輕度干旱脅迫24 h的表達(dá)量（2.14），中度干旱脅迫下24h內(nèi)的平均表達(dá)量（3.0）顯著高于輕度干旱脅迫下的平均表達(dá)量（1.78），說明SiATG5參與冀谷34的抗旱反應(yīng)，該品種通過SiATG5表達(dá)量的提高應(yīng)對不同的干旱脅迫條件。重度干旱脅迫6 h時(shí)表達(dá)量達(dá)到最高值（3.13），并維持到12 h，在24 h時(shí)降低，說明重度干旱脅迫時(shí)冀谷34通過迅速提高SiATG5表達(dá)量來應(yīng)對干旱脅迫，但存在表達(dá)極值。

4 結(jié)論與討論

自噬相關(guān)基因在植物應(yīng)答逆境脅迫過程中起重要作用。ATG5是自噬體形成過程中的一個(gè)關(guān)鍵基因，然而谷子SiATG5在抗旱脅迫中的作用及在干旱響應(yīng)中的功能作用研究較少。Li等[11]利用谷子基因組數(shù)據(jù)庫鑒定了37個(gè)谷子ATG相關(guān)基因，其中26個(gè)基因受干旱、鹽脅迫誘導(dǎo)表達(dá)，在PEG（6% ）處理1 h和12 h后ATG5表達(dá)量均表現(xiàn)升高，說明ATG5與干旱脅迫相關(guān)。本研究采用PEG-6000模擬干旱脅迫，分析了輕度、中度、重度干旱脅迫6 h、12 h和24 h的SiATG5表達(dá)水平，結(jié)果表明，SiATG5在調(diào)控冀谷34的抗旱性中起著重要作用。SiATG5表達(dá)量與抗旱水平高度相關(guān)，隨著干旱程度的加重，SiATG5的表達(dá)量逐漸升高，說明SiATG5通過其表達(dá)水平的變化應(yīng)對不同程度的干旱脅迫；在輕度干旱脅迫下的最高表達(dá)量（2.14）低于中度（3.15）和重度（3.13）干旱脅迫下的表達(dá)量，以及中度和重度干旱脅迫下表達(dá)量達(dá)到最高值的時(shí)間點(diǎn)不同，表明輕度和中度干旱對冀谷34影響較小，SiATG5表達(dá)量隨著脅迫時(shí)間的延長而提高，但在重度干旱條件下脅迫處理6 h后其表達(dá)量即達(dá)到最高值，說明此時(shí)已對冀谷34影響較大，SiATG5通過迅速提高其表達(dá)量來應(yīng)對干旱脅迫。

植物抗旱是一個(gè)復(fù)雜的過程，Romain等[15]研究表明ATG5蛋白具有吞噬泡結(jié)構(gòu)域，蛋白位于自噬體形成部位，是自噬體形成所必須的。ATG5突變體不能形成自噬小體。其作用機(jī)理為ATG5通過與ATG12和ATG16形成ATG12-ATG5-ATG16復(fù)合體，ATG5復(fù)合體能夠與位于自噬體膜表面的ATG8結(jié)合，從而瞄定ATG8在自噬體上，參與自噬體膜的擴(kuò)展和自噬體閉合，這些基因是否參與植物的抗旱水平等也需進(jìn)一步研究。