殷劍美,王 立,張培通,韓曉勇

(江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 經(jīng)濟(jì)作物研究所,江蘇 南京 210014)

花青素是自然界一類廣泛存在于植物中的水溶性天然色素,它不僅可以使花朵和果實(shí)呈現(xiàn)鮮艷的顏色而具有觀賞價(jià)值,有利于吸引昆蟲和食草動(dòng)物協(xié)助傳粉和種子傳播,還有助于提高抗逆性,如抵御低溫和紫外線傷害,以及防治植物病害[1-2],同時(shí)還是迄今為止發(fā)現(xiàn)的最強(qiáng)效的自由基清除劑,具有抗氧化衰老、抗突變、抗癌與抗動(dòng)脈硬化等功能,對(duì)人體有保健功能[3-4]。

花青素是植物次生代謝的重要產(chǎn)物之一,其生物合成涉及多個(gè)酶,如苯丙氨酸裂解酶(PAL)、黃烷酮3-羥基化酶(F3H)、二氫黃酮醇4-還原酶(DFR)、花青素合成酶(ANS)和黃酮3-O-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶(UFGT),而這些酶各自因物種不同而成為主導(dǎo)花青素形成的關(guān)鍵酶。研究表明,F3H、DFR、ANS和UFGT分別是金魚草、矮牽牛、石竹和葡萄的關(guān)鍵酶基因[5-6]。目前大多數(shù)的研究集中在地上器官和組織中花青素方面,而對(duì)地下器官花青素的研究較少。

山藥作為藥食兩用的植物,其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值、藥用價(jià)值及抗病機(jī)理正逐步被發(fā)現(xiàn)和證實(shí),并愈來愈受到廣大消費(fèi)者的青睞,具有十分廣闊的市場(chǎng)前景[7]。紫山藥(DioscoreaalataL.)是天然紫色山藥品種,富含花青素,在南非和中國(guó)南部的栽培面積很廣[8]；紫山藥皮可作為提取紫色素的來源[9]；作為一種新型的天然色素資源,紫山藥在食品、化妝品及醫(yī)藥等行業(yè)中也將具有廣闊的應(yīng)用前景。因此對(duì)山藥花青素的研究不僅具有重要的理論意義,還具有較好的實(shí)用價(jià)值。

我們?cè)谇叭搜芯康幕A(chǔ)上,以紫肉山藥和白肉山藥為試驗(yàn)材料,分析了花青素合成基因在兩者之間的表達(dá)差異,以期找出紫山藥花青素合成的關(guān)鍵基因,為進(jìn)一步研究紫山藥花青素合成途徑中各個(gè)基因的調(diào)控機(jī)理提供理論依據(jù)和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 試材及取樣

供試材料為紫山藥品種“Yzi006”(紫肉)和白山藥品種“Ybai002”(白肉)。于2013年4月2日將它們種植于江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院(南京)實(shí)驗(yàn)基地,于4月26日出苗。在出苗后第50天分別取幼葉、成熟葉、幼莖和成熟莖；于出苗后第50、65、80天(塊莖膨大初期)，第95、110、125天(塊莖膨大盛期)，第140、155、170天(塊莖膨大后期)，以及第185天(塊莖膨大末期)分別取地下塊莖,所取樣品用液氮速凍后,保存于-70 ℃?zhèn)溆?；每份樣品均取?次，作為重復(fù)。山藥生育期的劃分參考黃文華[10]和殷劍美等[11]的方法。

1.2 克隆及測(cè)序

RNA提取和cDNA第一條鏈的合成參照Valderrama-Cháirez等[12]的方法(本文略加改進(jìn))。

根據(jù)NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)數(shù)據(jù)庫(kù)中Actin-2、PAL、F3H、DFR、ANS、UFGT基因序列在山藥基因組EST數(shù)據(jù)庫(kù)中的比對(duì)結(jié)果,用Primer 5軟件設(shè)計(jì)PCR引物(表1),進(jìn)行擴(kuò)增。PCR反應(yīng)條件為:94 ℃預(yù)變性10 min；94 ℃ 40 s,56 ℃ 40 s,72 ℃ 90 s,32個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。引物由北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司合成。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用凝膠回收試劑盒回收,與pMD18-T載體在16 ℃下連接過夜,通過DH5α轉(zhuǎn)化克隆,挑選陽(yáng)性克隆菌液送交南京金斯瑞生物科技有限公司測(cè)序。

1.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

在NCBI中,使用Blastn軟件進(jìn)行序列比對(duì),在確定目的片段為山藥中相關(guān)基因的核苷酸序列片段后,用Beacon Designer 7軟件分別設(shè)計(jì)了各基因的熒光定量PCR引物(表1)。對(duì)不同組織中各個(gè)基因的實(shí)時(shí)定量檢測(cè)分析在ABI7500 Real Time PCR儀(由美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司生產(chǎn))上完成。

1.4 花青素含量的測(cè)定

花青素含量的測(cè)定參考Merthens[13]的方法。將0.1 g新鮮組織材料切碎，加入6 mL提取液(濃鹽酸∶80%乙醇=1∶99, v/v)浸提10 h?；ㄇ嗨睾康挠?jì)算公式為:Q=(A530-0.25×A657)/FW,式中Q為花青素相對(duì)含量；FW為樣品鮮重(g)。

花青素相對(duì)積累量的計(jì)算公式為:An=Qn×FMn,式中：An為花青素相對(duì)積累量；n為樣品取樣時(shí)間；Qn為花青素含量；FMn為1株的塊莖鮮重(g)?；ㄇ嗨胤e累速率的計(jì)算公式為:R=(An-An-1)/D,式中D為2次取樣的間隔天數(shù)[14]。

2 結(jié)果與分析

2.1 Yzi006和Ybai002不同組織器官中花青素含量的比較

Yzi006的幼葉、莖和塊莖均呈紫色,成熟葉為綠色；Ybai002的幼葉、成熟葉和莖均為綠色,塊莖為白色(圖1A)。對(duì)以上組織器官中的花青素含量分別進(jìn)行測(cè)定，從圖1B可以看出： Yzi006幼葉和早期塊莖中的花青素含量明顯高于成熟葉和后期塊莖中的,而莖中花青素含量變化不明顯,且葉片、莖和塊莖中花青素的含量均隨著生長(zhǎng)發(fā)育的推進(jìn)而逐漸下降； Ybai002各個(gè)組織器官中花青素含量很低且基本保持不變。

a:紫山藥幼葉; b:紫山藥成熟葉; c:白山藥幼葉; d:白山藥成熟葉; e:紫山藥莖; f:白山藥莖; g:紫山藥塊莖; h:白山藥塊莖。

2.2 Yzi006和Ybai002不同組織器官中花青素合成基因的表達(dá)水平

對(duì)山藥葉、莖及不同生長(zhǎng)期塊莖中花青素合成基因PAL、F3H、DFR、ANS、UFGT的表達(dá)水平進(jìn)行了分析，結(jié)果如圖2所示。除了DFR基因外,其他基因在山藥幼嫩組織中的表達(dá)水平更高。PAL在Yzi006葉、莖和塊莖中的表達(dá)水平高于Ybai002相應(yīng)組織器官中的,并且在莖中的表達(dá)水平遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于在葉中的表達(dá)水平。F3H在葉和莖中的表達(dá)水平相同,但是在Yzi006塊莖中的表達(dá)水平要高于在Ybai002塊莖中的表達(dá)水平。值得注意的是,DFR在成熟葉中的表達(dá)水平要遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于在幼葉和莖中的表達(dá)水平,且該基因在Yzi006塊莖中的表達(dá)水平高于在Ybai002塊莖中的表達(dá)水平。ANS和UFGT在葉、莖和塊莖中的表達(dá)趨勢(shì)相同,均在Yzi006幼葉和塊莖膨大早期高度表達(dá),而在Ybai002對(duì)應(yīng)組織器官和其他組織器官中的表達(dá)水平很低?？傊?PAL、F3H、DFR、ANS、UFGT在Yzi006塊莖中的表達(dá)水平較高。

2.3 Yzi006塊莖中花青素的積累

由圖3可見： Yzi006塊莖從開始形成時(shí),塊莖鮮重就一直持續(xù)增加,塊莖中花青素的積累有兩個(gè)高峰期,中間有一個(gè)緩慢增長(zhǎng)期,呈一個(gè)典型的雙“S”增長(zhǎng)曲線。具體而言：第一個(gè)快速積累期在塊莖膨大盛期,此時(shí)花青素含量達(dá)到最高；第二個(gè)快速積累期在塊莖膨大后期,此時(shí)塊莖鮮重增加速度最高；花青素含量在塊莖膨大初期開始下降,在塊莖膨大盛期有所回升,并且花青素積累量迅速升高；進(jìn)入塊莖膨大后期后,塊莖重量快速增加,花青素含量持續(xù)下降,導(dǎo)致花青素進(jìn)入緩慢積累階段;到達(dá)塊莖膨大末期時(shí),塊莖停止生長(zhǎng),花青素含量略有回升,花青素積累量趨于最高。

2.4 Yzi006塊莖中花青素積累量、積累速率與花青素合成相關(guān)基因表達(dá)水平間的關(guān)系

對(duì)紫山藥塊莖中花青素積累量、積累速率和花青素合成相關(guān)基因的表達(dá)水平進(jìn)行綜合分析(表2),發(fā)現(xiàn)各個(gè)基因的表達(dá)水平與花青素積累速率存在協(xié)同性。PAL、F3H、DFR、ANS、UFGT在第50～110天內(nèi)極顯著性高度表達(dá)的同時(shí),紫山藥塊莖中花青素積累速率快速升高,在第125天積累速度達(dá)到最大值31.37/(株·d),存在極顯著性差異；當(dāng)ANS、UFGT基因表達(dá)水平分別在第125、140、155天顯著性回升后,花青素積累速率再次顯著性升高,在第155天達(dá)到第2個(gè)高峰,積累速率最快為15.87/(株·d)。由此可見,花青素合成基因PAL、DFR、ANS、UFGT的表達(dá)水平均與紫山藥塊莖中花青素積累存在明顯的相關(guān)性。

3 討論

由于花青素通常貯藏于花、葉、莖等器官中,所以,在蛋白質(zhì)和基因水平上研究花青素合成酶及其相關(guān)基因的報(bào)道多出自這些器官,而對(duì)植物地下器官尤其是塊莖中花青素合成酶及其相關(guān)基因的研究還不多。薯芋塊莖類植物花青素生物合成的調(diào)控方式與植物花、果實(shí)等地上器官中的情形很可能不同,有可能存在一種全新的花青素合成與調(diào)控機(jī)制,因此對(duì)山藥花青素合成代謝的相關(guān)研究,不僅對(duì)進(jìn)一步明確花青素合成調(diào)控機(jī)理具有重要意義,對(duì)于嚴(yán)重缺乏科研資料背景的山藥作物本身更是意義非凡。

“*”和“**”分別表示差異達(dá)顯著(P<0.05)和極顯著(P<0.01)水平。

圖3 Yzi006塊莖重量、塊莖中花青素含量和積累量的變化

由于木質(zhì)素和莖木質(zhì)化的原因,PAL在甘蔗幼莖中的表達(dá)量要遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于葉中的表達(dá)量,且PAL在莖中的表達(dá)水平與莖的發(fā)育速度呈正相關(guān),因此Kolahi等推測(cè)PAL對(duì)甘蔗莖的木質(zhì)化具有重要作用[15]。本研究也發(fā)現(xiàn)PAL在山藥莖中的表達(dá)水平要高于葉中的。Sun等[16]發(fā)現(xiàn)F3H在紅色花系和白色花系的瓜葉菊中均有表達(dá),因此指出F3H不是瓜葉菊花青素合成途徑中的關(guān)鍵基因。這與本研究中F3H在紫山藥和白山藥中的表達(dá)情況相同。因此,PAL和F3H的表達(dá)水平對(duì)紫山藥塊莖中花青素含量和積累量雖具有相關(guān)性,但這2個(gè)基因不是調(diào)控紫山藥花青素合成的關(guān)鍵點(diǎn)。

表2 紫山藥塊莖發(fā)育過程中花青素積累速率與相關(guān)基因表達(dá)水平間的關(guān)系

注：同列數(shù)據(jù)后附“*”代表P<0.05,差異顯著;“**”代表P<0.01,差異極顯著。

DFR不僅參與花青素的合成,同時(shí)也產(chǎn)生縮合單寧的誘導(dǎo)性底物[17]。Liu等[18]檢測(cè)到高粱中SbDFR1基因參與了合成花青素,SbDFR3基因合成3-脫氧花青素起到植物脅迫反向的補(bǔ)償作用[19]; Cheng等[20]成功克隆了島銀杏中DFR基因的3個(gè)拷貝,并發(fā)現(xiàn)GbDFR1和GbDFR2的主要作用是參與植物防護(hù)機(jī)制,抵御傷害、脅迫以及外源激素的刺激,而GbDFR3的職責(zé)主要是合成花青素。在本研究中，DFR基因在功能葉中的表達(dá)水平比在幼葉和莖中高,并且在白山藥中的表達(dá)水平高于紫山藥中的,有可能是因?yàn)榘咨剿幦~片中需要DFR合成更多的縮合單寧來抵御UV-B以及蟲害等傷害。

周生茂等[21]從田薯地下塊莖中分離到1個(gè)ANS基因(DaANS1),并發(fā)現(xiàn)其表達(dá)模式與ANS酶活性和花青素含量在塊莖中的變化具有協(xié)同性；而Afifi等[22]和Piero等[23]分別報(bào)道在葡萄藤和甜橙中UFGT與花青素的合成具有重要關(guān)聯(lián)性,而ANS與花青素合成的關(guān)聯(lián)性不大。本研究發(fā)現(xiàn),ANS和UFGT均在紫山藥幼葉及塊莖形成早期高度表達(dá),而在白山藥中低表達(dá)或不表達(dá),推測(cè)ANS和UFGT可能是導(dǎo)致紫山藥和白山藥顏色差異的關(guān)鍵基因。

Yzi006塊莖中花青素的積累速率存在兩個(gè)高峰值,第一個(gè)較高的峰值出現(xiàn)在塊莖膨大盛期,第二個(gè)較低的峰值出現(xiàn)在塊莖膨大后期；PAL和F3H基因的表達(dá)水平只在塊莖膨大初期最高,DFR從塊莖膨大初期開始到盛期結(jié)束一直持續(xù)較高的表達(dá)水平,ANS和UFGT在塊莖膨大初期的表達(dá)水平最高,之后下降,而在塊莖膨大盛期和第二個(gè)花青素積累速率達(dá)到高峰前再次上升,推測(cè)DFR、ANS和UFGT對(duì)塊莖膨大初期和后期花青素的積累具有重要作用,而PAL和F3H只對(duì)塊莖膨大初期花青素的積累具有影響。綜上所述,推測(cè)紫山藥花青素合成的關(guān)鍵基因可能是ANS和UFGT或是兩者之一,其表達(dá)模式還需進(jìn)一步研究。