張慶華　郭婧　宋增?！埿窠堋〗新暋堃?/p>

摘要：為了提升水生動(dòng)物醫(yī)學(xué)專業(yè)實(shí)驗(yàn)課的質(zhì)量，在《水生動(dòng)物病原微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)》中進(jìn)行改革探索，設(shè)計(jì)了“嗜水氣單胞菌人工感染異育銀鯽及病原菌的分離、鑒定綜合性大實(shí)驗(yàn)”的案例，鞏固了學(xué)生對(duì)“科赫法則”的理解和運(yùn)用。該實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目極大地提高了學(xué)生的動(dòng)手能力和實(shí)驗(yàn)興趣，取得了良好的教學(xué)效果。

關(guān)鍵詞：水生動(dòng)物病原微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)；科赫法則；綜合性實(shí)驗(yàn)；實(shí)驗(yàn)改革

中圖分類號(hào)：G642.0 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1674-9324（2018）21-0271-02

一、引言

“水生動(dòng)物醫(yī)學(xué)”（090604TK）是2013年被教育部首次批準(zhǔn)于上海海洋大學(xué)的水產(chǎn)學(xué)大類下設(shè)置的新本科專業(yè)，為國(guó)內(nèi)首個(gè)水生動(dòng)物疾病防控領(lǐng)域的本科專業(yè)?！端鷦?dòng)物病原微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)》是針對(duì)“水生動(dòng)物醫(yī)學(xué)”新專業(yè)開設(shè)的專業(yè)必修課程之一，其理論課是《水生動(dòng)物病原微生物學(xué)》。為了滿足市場(chǎng)對(duì)水生動(dòng)物醫(yī)學(xué)專業(yè)人才極其匱乏的需求，《水生動(dòng)物病原微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)》承載著該專業(yè)重要的專業(yè)技能訓(xùn)練使命[1]。該課程從無(wú)到中有，經(jīng)歷了逐步完善的過(guò)程，為了提升該專業(yè)綜合性大實(shí)驗(yàn)的比例，提高學(xué)生的綜合性大實(shí)驗(yàn)的技能，我們?cè)O(shè)計(jì)了“嗜水氣單胞菌人工感染異育銀鯽及病原菌的分離、鑒定”綜合性大實(shí)驗(yàn)的案例。歷經(jīng)4年的實(shí)施與改革，取得了很好的實(shí)驗(yàn)效果，對(duì)進(jìn)一步深化教學(xué)改革具有重要借鑒意義。

二、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的理念

參考《致病性嗜水氣單胞菌檢驗(yàn)方法GB/T 18652-2002》（2002-02-19發(fā)布2002-05-01實(shí)施，中華人民共和國(guó)國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局發(fā)布）的標(biāo)準(zhǔn)，在《水生動(dòng)物病原微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)》專業(yè)微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)環(huán)節(jié)，針對(duì)病原菌部分的教學(xué)重點(diǎn)，根據(jù)“科赫法則”設(shè)立了“嗜水氣單胞菌人工感染異育銀鯽及病原菌的分離、鑒定綜合性大實(shí)驗(yàn)”，旨在建立病原菌的感染模型，鍛煉學(xué)生分離、鑒定以及保藏病原菌的綜合能力。訓(xùn)練學(xué)生靈活運(yùn)用理論知識(shí)的能力，融合前面單獨(dú)實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目中的操作技巧，綜合運(yùn)用到本實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目中，進(jìn)一步鍛煉學(xué)生的團(tuán)結(jié)協(xié)作能力。

三、實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮鸵?/p>

通過(guò)致病性嗜水氣單胞菌人工感染異育銀鯽，了解細(xì)菌的培養(yǎng)及人工感染方法；觀察嗜水氣單胞菌感染魚體后所造成的疾病癥狀，包括體表以及體內(nèi)的病理變化特征；掌握病原菌的體外及體內(nèi)分離、培養(yǎng)方法，掌握細(xì)菌傳統(tǒng)鑒定及16S rRNA分子鑒定方法，理解科赫法則，訓(xùn)練病原菌保藏的技術(shù)。以4-5人為一組，分6個(gè)學(xué)時(shí)進(jìn)行。

四、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容和方法

1.實(shí)驗(yàn)器材：培養(yǎng)皿、干燥箱、滅菌鍋；塑料水族箱（90L）、加熱棒、充氣泵、解剖刀、解剖盤、剪刀、鑷子、酒精燈、接種環(huán)、酒精棉、1mL無(wú)菌注射器、試管、火柴、一次性手套、橡膠手套、口罩；營(yíng)養(yǎng)瓊脂、無(wú)菌脫纖維羊血、血瓊脂基礎(chǔ)培養(yǎng)基、RS瓊脂、無(wú)菌生理鹽水、MS-222麻醉劑。

2.實(shí)驗(yàn)菌株：實(shí)驗(yàn)室保藏致病性嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophilia，Ah），菌株編號(hào)Ah-js16。

3.實(shí)驗(yàn)原理：本綜合性試驗(yàn)項(xiàng)目設(shè)計(jì)的原理依據(jù)科赫法則（Koch postulates），又稱證病律。

4.實(shí)驗(yàn)操作步驟：（1）實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備：包括實(shí)驗(yàn)魚的馴養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)菌株的活化和擴(kuò)大培養(yǎng)。（2）人工感染：實(shí)驗(yàn)魚人工感染方法包括浸泡、創(chuàng)傷感染、肌肉注射以及腹腔注射，本實(shí)驗(yàn)采用腹腔注射，感染快速、效果較好。感染后，觀察并記錄發(fā)病情況。（3）病原菌的分離、培養(yǎng)：分別觀察記錄人工感染后4 h、8 h、16 h、24 h魚體癥狀，之后進(jìn)行病魚的解剖及病原菌的平板劃線分離。（4）病原菌鑒定：細(xì)菌的鑒定方法主要包括傳統(tǒng)鑒定和現(xiàn)代分類鑒定兩種方法。本實(shí)驗(yàn)采用的傳統(tǒng)鑒定方法包括：生長(zhǎng)特性、菌落特征、革蘭氏染色、運(yùn)動(dòng)性、氧化酶、吲哚試驗(yàn)、糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)、細(xì)菌的致病性檢查共8個(gè)項(xiàng)目。細(xì)菌的現(xiàn)代分類鑒定采用16S rRNA序列測(cè)定，操作簡(jiǎn)單（菌液直接送公司進(jìn)行測(cè)序），節(jié)省時(shí)間，花費(fèi)低廉（30-50元/菌株）。根據(jù)測(cè)序結(jié)果構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，登陸NCBI網(wǎng)站（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/），再次確認(rèn)其分類地位。（5）實(shí)驗(yàn)魚及菌株處理：實(shí)驗(yàn)解剖后的感染魚及分離菌株應(yīng)進(jìn)行無(wú)害化處理，先經(jīng)121℃滅菌15min后，再進(jìn)行后續(xù)處理。（6）病原菌的保藏：將分離鑒定后的病原菌株，進(jìn)行液體擴(kuò)大培養(yǎng)，之后按照甘油：菌懸液=3∶7的比例，進(jìn)行混合，之后分裝1-2ml菌種凍存管，9管/株，分別置于-20℃，-70℃，-196℃（每個(gè)溫度各3管）進(jìn)行保存、備用。

五、實(shí)驗(yàn)考核方法

綜合學(xué)生之間互動(dòng)的積極性、實(shí)驗(yàn)小組的團(tuán)隊(duì)協(xié)作精神、實(shí)驗(yàn)報(bào)告中體現(xiàn)出來(lái)的應(yīng)用所學(xué)知識(shí)分析和解釋實(shí)驗(yàn)結(jié)果的能力給出該組的成績(jī)，分為優(yōu)、良、中、及格、不及格五級(jí)。

六、學(xué)生對(duì)實(shí)驗(yàn)的評(píng)價(jià)與反饋

通過(guò)該綜合性大實(shí)驗(yàn)，學(xué)生牢固強(qiáng)化了微生物學(xué)的基本操作技巧，對(duì)于無(wú)菌操作能夠貫穿實(shí)驗(yàn)的全過(guò)程，對(duì)于“病原微生物”的理解更加透徹，對(duì)于“科赫法則”十分清楚。下面僅舉2例，展示學(xué)生的實(shí)際收獲及實(shí)驗(yàn)效果。

例1：“本次實(shí)驗(yàn)相對(duì)比較成功，組內(nèi)同學(xué)彼此配合默契，分工明確，通過(guò)此次實(shí)驗(yàn)有利于培養(yǎng)對(duì)病原微生物學(xué)的興趣，對(duì)同學(xué)們的獨(dú)立思考能力是一個(gè)非常好的鍛煉機(jī)會(huì)。”

例2：“這學(xué)期的水生動(dòng)物病原微生物實(shí)驗(yàn)已經(jīng)結(jié)束，這是我們第一次接觸到微生物的真實(shí)世界，開始實(shí)驗(yàn)之前我以為這個(gè)實(shí)驗(yàn)不會(huì)很難，但是通過(guò)本實(shí)驗(yàn)的逐步完成發(fā)現(xiàn)這個(gè)課程很有技術(shù)含量。不僅需要理論知識(shí)作為鋪墊，還需要有嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膶?shí)驗(yàn)精神。通過(guò)這次實(shí)驗(yàn)操作，我們學(xué)到了很多，非常有收獲?！?/p>

七、總結(jié)和提高

該綜合性大實(shí)驗(yàn)，確立了以學(xué)生為中心的互動(dòng)實(shí)驗(yàn)教學(xué)模式[2]，明顯提高了實(shí)驗(yàn)教學(xué)的質(zhì)量和學(xué)生的綜合素質(zhì)，提升了教學(xué)團(tuán)隊(duì)的整體實(shí)力。學(xué)生的實(shí)驗(yàn)報(bào)告圖文并茂，很多照片也成為科學(xué)出版社的待出版教材《水生動(dòng)物病原微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)》的素材，因此，對(duì)同行有一定的參考和幫助。今后如何面對(duì)高等教育現(xiàn)代化對(duì)課程內(nèi)涵不斷提升的需求，培養(yǎng)具有國(guó)際競(jìng)爭(zhēng)力的人才，仍需要更多的思考和實(shí)踐。希望此實(shí)驗(yàn)案例能夠拋磚引玉，與同道共勉。

參考文獻(xiàn)：

[1]張慶華，宋增福，郭婧，等.“水生動(dòng)物病原微生物學(xué)”實(shí)驗(yàn)的教學(xué)與實(shí)踐[J].實(shí)驗(yàn)科學(xué)與技術(shù)，2016，14（6）：130-133，245.

[2]梅蕓，楊華山.以學(xué)生為中心的互動(dòng)實(shí)驗(yàn)教學(xué)模式探索[J].實(shí)驗(yàn)科學(xué)與技術(shù)，2014，12（2）：111-113.