許文雅, 閻 峰, 關(guān) 瑾, 石 爽, 王思林

(沈陽化工大學(xué) 應(yīng)用化學(xué)學(xué)院, 遼寧 沈陽 110142)

呋喃西林,化學(xué)名稱5-硝基-2-呋喃甲醛縮氨基脲,化學(xué)結(jié)構(gòu)式如圖1所示,對金黃色葡萄球菌、帶芽孢的枯草桿菌以及大腸桿菌有抗菌作用,為硝基呋喃類外用消毒藥[1].呋喃西林含量測定方法主要采用紫外-可見分光光度法,操作簡便,精密度較好,但因呋喃西林化學(xué)穩(wěn)定性較差,在制備和貯存過程中易降解,而該法不能排除其降解產(chǎn)物的干擾,故準(zhǔn)確度較差[2].高效液相色譜法(HPLC)因操作簡單、分析速度快、選擇性好等優(yōu)點在藥物分析中被廣泛應(yīng)用[3].目前,文獻報道主要為測定不同呋喃西林制劑含量的HPLC法[4-7].本文采用HPLC法對呋喃西林原料藥的含量進行測定,按照人用藥物注冊技術(shù)要求國際協(xié)調(diào)會(ICH)標(biāo)準(zhǔn)[8]對建立的方法進行驗證,并應(yīng)用于呋喃西林原料藥分析.相關(guān)研究為呋喃西林藥物的質(zhì)量控制及臨床用藥提供參考.

圖1 呋喃西林的化學(xué)結(jié)構(gòu)式Fig.1 Chemical structure of nitrofurazone

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

安捷倫1260高效液相色譜儀(美國Agilent公司),KromaSil液相色譜柱(大連中匯達科學(xué)儀器有限公司),pHSJ-5型pH計(上海精密科學(xué)儀器有限公司),BSA224S-CW型電子天平(北京賽多利斯天平有限公司).

呋喃西林對照品(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99.4 %,中國食品藥品檢驗院),呋喃西林原料藥(批號:040901,040902,040903,廠家提供),乙腈(天津博迪化工有限公司)為色譜純,其余試劑為分析純,水為超純水.

1.2 實驗方法

1.2.1 色譜條件

色譜柱為KromaSil C18(150 mm×4.6 mm，ID 5 μm);流動相為0.05 mol/L磷酸二氫銨溶液(pH=4.5)-乙腈(體積比為4∶1);檢測波長為375 nm;柱溫:30 ℃;流速:1.0 mL/min;進樣量:20 μL.

1.2.2 溶液配制

供試品溶液的配制:精密量取1 mL的呋喃西林溶液(0.2 g/L),置于25 mL的棕色容量瓶中,用純凈水稀釋并定容,搖勻,得到質(zhì)量濃度為8 mg/L的供試品溶液.

對照品儲備液的配制:精密稱取10.5 mg呋喃西林對照品,置于燒杯中,用純凈水溶解,并完全轉(zhuǎn)移至50 mL的容量瓶中,再用純凈水稀釋并定容,搖勻,得到質(zhì)量濃度為0.2 g/L的對照品儲備液.

對照品溶液的配制:精密量取1 mL上述對照品儲備液,置于25 mL的棕色容量瓶中,用純凈水稀釋并定容,搖勻,得到質(zhì)量濃度為8 mg/L的對照品溶液.

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的選擇

考察不同比例的水-乙腈,水-甲醇對呋喃西林色譜分析的影響.呋喃西林的極性較弱,乙腈洗脫效果優(yōu)于甲醇,選擇乙腈為有機洗脫劑.進一步考察不同濃度和pH值的乙酸鹽、磷酸鹽等緩沖鹽對分析的影響,pH=4.5的0.05 mol/L磷酸二氫銨溶液與乙腈為流動相時,色譜峰對稱性好,減少了色譜峰的拖尾,故選其作為流動相,圖2為呋喃西林標(biāo)準(zhǔn)品的色譜圖.

圖2 呋喃西林標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC圖譜Fig.2 HPLC chromatogram of nitrofurazone standard

2.2 系統(tǒng)適用性

在“1.2.1”項的色譜條件下,取20 μL空白溶劑純凈水注入色譜儀,再平行配制6份相同濃度的供試品溶液,精密量取6份供試品溶液各20 μL注入液相色譜儀,結(jié)果顯示空白溶劑無干擾,呋喃西林出峰時間適宜,峰面積和保留時間的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)分別為0.065 %和0.075 %,色譜峰對稱性良好,拖尾因子小于2.0,與其他雜質(zhì)分離度在1.5以上,理論塔板數(shù)大于10 000,表明此色譜系統(tǒng)穩(wěn)定,

2.3 線性關(guān)系考察

精密移取呋喃西林對照品儲備液0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mL,分別置于25 mL的容量瓶中,用純凈水稀釋并定容,搖勻,得到質(zhì)量濃度分別為3.2、4.8、6.4、8.0、9.6和11.2 mg/L的呋喃西林標(biāo)準(zhǔn)溶液.按“1.2.1”項的色譜條件,精密量取不同質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液各20 μL注入液相色譜儀,以色譜峰面積(y)為縱坐標(biāo),以各自的質(zhì)量濃度(x,mg/L)為橫坐標(biāo),得到呋喃西林的線性回歸方程為:y=99.74x+8 .225(R2=0.999 2).線性回歸分析表明,呋喃西林在質(zhì)量濃度為3.2～11.2 mg/L的范圍內(nèi)與峰面積具有良好的線性關(guān)系.

2.4 檢出限和定量限

在“1.2.1”項的色譜條件下,先取20 μL空白溶劑純凈水注入色譜儀,再取呋喃西林對照品溶液,用純凈水進行逐級稀釋,以信噪比為3∶1和10∶1時計算呋喃西林的檢測限和定量限.結(jié)果得呋喃西林的檢測限為5 μg/L,定量限為10 μg/L,表明此色譜條件具有較高的檢測靈敏度.平行配制6份定量限溶液,依次進樣,得到其保留時間的RSD為0.088 %,峰面積的RSD為2.0 %,表明該定量限能準(zhǔn)確進行定量.

2.5 重復(fù)性和中間精密度試驗

配制2份相同質(zhì)量濃度的對照品溶液,配制6份相同質(zhì)量濃度的供試品溶液,按照“1.2.1”項下的色譜條件,先分別精密量取20 μL的對照品溶液注入液相色譜儀,每份進2次,再進6份供試品溶液,每份進2次,記錄色譜圖,供試品溶液平均含量的RSD為0.27 %,表明此方法重復(fù)性良好.配制2份相同質(zhì)量濃度的對照品溶液,配制6份相同質(zhì)量濃度的供試品溶液,按照“1.2.1”項下的色譜條件,精密量取對照品溶液各20 μL注入液相色譜儀,每份進2次,再進6份供試品溶液,每份進2次,連續(xù)3 d進樣,記錄色譜圖,供試品溶液平均含量的RSD為0.20 %,表明此方法中間精密度良好.

2.6 回收率實驗

為考察方法的準(zhǔn)確度,進行回收率測定.回收率實驗按分析質(zhì)量濃度 8.0 mg/L 的80 %、100 %、120 %進行.分別精密量取20 μL的供試品溶液和對照品溶液注入液相色譜儀,記錄色譜圖.按外標(biāo)一點法計算回收率.結(jié)果如表1所示,回收率在99.55 %～100.3 %之間,樣品總平均回收率為100.0 %,RSD為0.26 %,表明本測定方法的準(zhǔn)確度良好.

表1 回收率結(jié)果Table 1 Results of recovery

2.7 耐用性實驗

2.7.1 穩(wěn)定性實驗

取“1.2.2”項的對照品溶液和供試品溶液分別在第0、2、4、6、8、10和12 h進樣檢測,記錄峰面積,計算得到對照品溶液和供試品溶液的峰面積RSD分別為0.21 %和0.16 %,表明對照品溶液和供試品溶液均在12 h內(nèi)穩(wěn)定.

2.7.2 色譜條件變動實驗

將“1.2.1”項下的色譜參數(shù)進行變化,波長改變±5 nm、流速改變±10 %、柱溫改變±5 ℃、有機相比例改變±30 %、pH值改變±0.2、改變兩個不同型號的色譜柱.平行配制2份對照品溶液和2份供試品溶液,在不同的條件下將2份對照品溶液和供試品溶液分別進樣2次,計算供試品溶液中呋喃西林的含量,考察變動條件對本品含量測定的影響.經(jīng)計算,不同變動條件下總平均含量的RSD為0.24 %,表明該方法的耐用性良好.

2.8 專屬性實驗

選擇強酸、強堿、氧化、光照、高溫條件對供試品溶液進行加速破壞,考察色譜條件的專屬性,結(jié)果如表2所示.供試品溶液經(jīng)強降解破壞性實驗后主成分均有一定的破壞,降解產(chǎn)物均可與主峰完全分離,表明該色譜條件專屬性好.

表2 專屬性結(jié)果Table 2 Results of specificity

2.9 樣品含量的測定

精密稱取呋喃西林原料藥適量,置于25 mL容量瓶中,用純凈水稀釋至刻度,搖勻,得到質(zhì)量濃度為8 mg/L的供試品溶液.按“1.2.1”項下的色譜條件進樣,總共測定3批,3批樣品含量均在99.50 %(質(zhì)量分?jǐn)?shù))以上,測定結(jié)果見表3.該方法可進行呋喃西林原料藥的質(zhì)量控制.

表3 呋喃西林實際樣品含量測定結(jié)果Table 3 Determination results of nitrofurazone samples(n=3)

3 結(jié) 論

建立了呋喃西林原料藥含量的HPLC測定方法,按照ICH標(biāo)準(zhǔn)對建立的方法進行了驗證,考察了方法的系統(tǒng)適用性、線性范圍、精密度、準(zhǔn)確度、耐用性、專屬性,并將該方法應(yīng)用于實際樣品分析,獲得了令人滿意的結(jié)果.該方法簡便快捷,可為呋喃西林的質(zhì)量控制提供參考.