邢家領(lǐng), 蘇俊琪, 高恩軍

(沈陽化工大學(xué) 應(yīng)用化學(xué)學(xué)院 遼寧省無機(jī)分子基化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 遼寧 沈陽 110142)

腫瘤是影響人類健康的主要惡性疾病,列人類死亡的第一位[1-2].順鉑作為臨床藥物對多種腫瘤的治療具有優(yōu)良的效果,具有廣譜性特點(diǎn),成為治療腫瘤患者的一線藥物[3].該藥物盡管具有優(yōu)越性,但由于其低溶解性、高腎毒性并伴發(fā)惡心嘔吐等不良癥狀,仍需對其結(jié)構(gòu)進(jìn)一步修飾或采取藥物載體改善其不足.目前,就藥物載體而言,主要有二氧化硅、環(huán)糊精和磁性氧化鐵等[4-5].碳酸鎂和氫氧化鎂作為典型的食藥級材料,是基于兩種物質(zhì)合適的粒徑尺寸和豐富的比表面積.本文采用化學(xué)合成新方法,制備了符合于碳酸鎂和氫氧化鎂食藥級國家標(biāo)準(zhǔn)的兩種生物載藥材料,通過熒光倒置顯微成像技術(shù)、流失細(xì)胞手段和MTT酶標(biāo)比色法測定了“載體-順鉑”對細(xì)胞的誘導(dǎo)凋亡能力和細(xì)胞活性劑量IC50值,通過熒光光譜學(xué)手段測定了藥物復(fù)合體與靶向DNA之間的相互作用,得到了有價值的實(shí)驗(yàn)信息.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

實(shí)驗(yàn)所需的順鉑由專業(yè)藥廠提供.菱鎂礦石取自遼寧丹東某礦山.硫代亞硫酸鈉、硫化鈉為AR級試劑.HeLa細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室傳代培養(yǎng)符合測定條件,CT-DNA為生化級試劑.

島津UV2550型紫外分光光度計,XD30A-RFL型熒光倒置顯微鏡,BD Accuri型流式細(xì)胞儀,ST-360型酶標(biāo)儀,Perkin-Elmer LS55型熒光分光光度計,WP-RH-6100型多位平行反應(yīng)合成儀.

1.2 碳酸鎂和氫氧化鎂的制備

按化學(xué)反應(yīng)方程式摩爾配比,用精度±0.000 1的電子天平準(zhǔn)確稱取一定量的菱鎂礦石,碎化成精細(xì)粉末,投入到多位平行反應(yīng)合成儀燒瓶中,加水過程通入CO2至反應(yīng)完全,生成碳酸氫鎂,在反應(yīng)后期加入已知少許準(zhǔn)確劑量的硫代亞硫酸鈉和硫化鈉,溶液中的Fe3+還原成Fe2+,生成黑色FeS沉淀,該沉淀物具有豐富的比表面積，吸附了反應(yīng)體系中的無機(jī)雜質(zhì).過濾后將所得濾液在95 ℃烘箱中烘干,得到優(yōu)質(zhì)碳酸鎂樣品,符合國家食藥級標(biāo)準(zhǔn)GB 25587-2010.根據(jù)衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)(二部)第五冊所提供的檢驗(yàn)方法對樣品進(jìn)行檢測,測試結(jié)果:樣品為白色粉末無味,氧化鎂42.11 %(質(zhì)量分?jǐn)?shù)),氯化物0.02 %(質(zhì)量分?jǐn)?shù)),硫酸鹽0.43 %(質(zhì)量分?jǐn)?shù)),氧化鈣0.31 %(質(zhì)量分?jǐn)?shù)),可溶性鹽類0.85 %(質(zhì)量分?jǐn)?shù)),重金屬(以Pb計)8 μg/g,樣品適合醫(yī)藥實(shí)驗(yàn).將上述所得合格的碳酸鎂樣品在550 ℃下熱解2 h,得到達(dá)到食藥級指標(biāo)要求的氫氧化鎂,符合國家藥品標(biāo)準(zhǔn)(WS-10001-(HD-0539)-2002).測試結(jié)果：樣品為白色粉末，氯化物0.02 %(質(zhì)量分?jǐn)?shù))，硫酸鹽0.43 %(質(zhì)量分?jǐn)?shù))，鈣1.3 %(質(zhì)量分?jǐn)?shù))，可溶性鹽類0.85 %(質(zhì)量分?jǐn)?shù))，重金屬(以Pb計)8 μg/g,樣品適合醫(yī)藥實(shí)驗(yàn).

1.3 碳酸鎂和氫氧化鎂負(fù)載順鉑實(shí)驗(yàn)

分別稱取準(zhǔn)確劑量的碳酸鎂和氫氧化鎂粉末,與準(zhǔn)確劑量的順鉑混合研磨,用水做分散劑,超聲震蕩至溶液分散均勻.用紫外分光光度計檢測碳酸鎂和氫氧化鎂的載藥含量和包封率[6-9],計算得到碳酸鎂的載藥量為30.32 %(質(zhì)量分?jǐn)?shù)),包封率為70.25 %(質(zhì)量分?jǐn)?shù));氫氧化鎂的載藥量為31.56 %(質(zhì)量分?jǐn)?shù)),包封率為71.76 %(質(zhì)量分?jǐn)?shù)),達(dá)到了載藥要求.

1.4 熒光倒置顯微鏡測定細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)

將負(fù)載藥物與HeLa細(xì)胞在細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h后,用磷酸鹽緩沖溶液(PBS)清洗,用FITC和PI進(jìn)行染色,在倒置熒光顯微鏡上成像,觀察細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化[10].

1.5 流式細(xì)胞法測定細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)

應(yīng)用流式細(xì)胞儀測定負(fù)載藥物的實(shí)驗(yàn)過程與1.4的實(shí)驗(yàn)操作相似,凋亡成像圖形由四組象限表達(dá)[11].

1.6 MTT法測定藥物對細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度

負(fù)載藥物在使用前配制成所需濃度溶液,用細(xì)胞培養(yǎng)液稀釋成0.4、1.2、3.6、11、33 mg/L 五個質(zhì)量濃度,將藥物與HeLa細(xì)胞置于96孔培養(yǎng)板上,培養(yǎng)24 h后,每孔加入20 μL MTT,繼續(xù)培養(yǎng)4 h后,每孔加入100 μL二甲基亞砜,震蕩10 min使甲瓚充分溶解,最后使用酶標(biāo)儀在波長為490 nm處檢測吸光值,通過GraphPad Prism 5軟件計算得到藥物對HeLa細(xì)胞的IC50值[12].

1.7 藥物與DNA相互作用的熒光猝滅實(shí)驗(yàn)

將2 mL濃度為5×10-5mol·L-1的DNA溶液與0.4 mL溴化乙錠(EtBr)溶液避光反應(yīng)2 h,加入定量的負(fù)載藥物置于pH值為7.4的Tris-HCl緩沖溶液中,定容到20 mL,繼續(xù)避光靜置2 h.在激發(fā)波長λex=526 nm下,檢測發(fā)射波長λem=615 nm處的熒光猝滅曲線[13].

2 結(jié)果與討論

2.1 藥物的細(xì)胞凋亡效果

細(xì)胞凋亡是細(xì)胞死亡的另一種形式,是多種基因參與并由多種信號傳遞途徑介導(dǎo)的程序化主動死亡過程,許多化療藥物的抗癌效果與誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的能力相關(guān),已成為評價抗癌藥物的重要指標(biāo)[14].圖1為不同倍數(shù)下“載體-藥物”與HeLa細(xì)胞作用12 h后的細(xì)胞凋亡效果圖.

圖1 不同倍數(shù)下的細(xì)胞凋亡形態(tài)Fig.1 Apoptosis morphology with different amplification ratio

從圖1中可以看出:藥物與HeLa細(xì)胞作用后,HeLa細(xì)胞形態(tài)發(fā)生變化,細(xì)胞核收縮并發(fā)生形變.表明以鎂化合物載入的順鉑藥物對HeLa細(xì)胞發(fā)生了抑制作用,產(chǎn)生了凋亡現(xiàn)象

流式細(xì)胞儀根據(jù)凋亡細(xì)胞DNA含量變化和細(xì)胞膜磷脂分布變動,采用熒光染色劑標(biāo)記檢測凋亡情況,結(jié)果如圖2所示.

圖2 藥物與HeLa細(xì)胞作用12 h的流式凋亡圖Fig.2 Flow cytometric analysis of drug and HeLa cells for 12 h

圖中右下象限為早期凋亡,右上象限為晚期凋亡,左上象限為機(jī)械損傷細(xì)胞,左下象限為活細(xì)胞.分析(a),(b)兩組象限細(xì)胞計數(shù),碳酸鎂負(fù)載順鉑對HeLa細(xì)胞的早期凋亡率(90.9 %)優(yōu)于氫氧化鎂(68.6 %),而氫氧化鎂負(fù)載順鉑對HeLa細(xì)胞的晚期凋亡率(29.1 %)比碳酸鎂(8.4 %)的更佳,12 h后,存活的HeLa細(xì)胞數(shù)不足3 %(0.7 %,2.2 %),由此說明兩種鎂化合物作為藥物載體,成功負(fù)載了順鉑藥物,使藥物對HeLa細(xì)胞有較強(qiáng)的殺傷活性,產(chǎn)生了明顯的細(xì)胞誘導(dǎo)凋亡現(xiàn)象.

2.2 藥物的半數(shù)抑制濃度結(jié)果

藥物對腫瘤細(xì)胞的體外活性實(shí)驗(yàn)通過MTT法實(shí)現(xiàn),由半數(shù)抑制濃度IC50值評價.所有實(shí)驗(yàn)都在相同條件下重復(fù)3次并取平均值.單純順鉑、碳酸鎂負(fù)載順鉑和氫氧化鎂負(fù)載順鉑得到的對HeLa細(xì)胞的IC50值分別為4.215±0.205、4.101±0.145和4.113±0.235.數(shù)據(jù)表明,順鉑對HeLa細(xì)胞有明顯的抑制效果,兩種鎂藥物載體載入順鉑藥物后,同樣對細(xì)胞有較強(qiáng)的抑制能力,其抑制活性分別提高了2.7 %,2.4 %.

綜上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,以臨床順鉑對HeLa細(xì)胞的研究為對象,順鉑是已知抗腫瘤藥物中的首選抑制劑.食藥級的碳酸鎂和氫氧化鎂是順鉑藥物的優(yōu)良載體,由于粒徑均勻和豐富的比表面積等特點(diǎn),以分子間弱作用力對順鉑藥物進(jìn)行負(fù)載.在負(fù)載體系的組分進(jìn)入HeLa細(xì)胞組織中,順鉑優(yōu)先水解成順式二胺二水中間產(chǎn)物,與腫瘤細(xì)胞中DNA靶向分子鳥嘌呤N7共價結(jié)合[15-16],阻礙了DNA復(fù)制,從而發(fā)揮了抑制腫瘤細(xì)胞的增長.而鎂負(fù)載體將順鉑藥物輸送到腫瘤組織細(xì)胞后,少量與順鉑交聯(lián)的鎂化合物可能主要以靜電方式與腫瘤細(xì)胞發(fā)生微弱作用,并適當(dāng)增加順鉑對腫瘤細(xì)胞的抑制效果,而鎂化合物主體部分在完成載藥、送藥和釋藥功能后,會與順鉑復(fù)合物自動拆分,游離在細(xì)胞組織液外.

2.3 熒光猝滅機(jī)理

溴化乙錠(EtBr)為扁平分子探針,可與DNA堿基對發(fā)生嵌插作用,從而使DNA-EtBr復(fù)合物熒光發(fā)射峰大為增強(qiáng),被視為熒光生物分子探針[17].圖3為載藥后順鉑藥物對DNA-EtBr復(fù)合物熒光猝滅趨勢圖譜.由圖3可以看出:載藥后的順鉑對DNA-EtBr的熒光有顯著的熒光猝滅能力,表明順鉑藥物與EtBr競爭,嵌入到DNA堿基對中,發(fā)生Pt—N7共價鍵合和嵌入作用兩種協(xié)同作用模式,將EtBr從DNA分子中擠出,造成DNA-EtBr熒光值下降.實(shí)驗(yàn)條件下,在波長612 nm,617 nm處,碳酸鎂負(fù)載順鉑和氫氧化鎂負(fù)載順鉑對DNA-EtBr的猝滅率分別為25.72 %和27.69 %,即負(fù)載藥物與靶向DNA發(fā)生了較強(qiáng)的作用.

c(DNA)=5×10-6mol·L-1c(EtBr)1×10-6mol·L-11c(藥物)=0 mol·L-12c(藥物)=0.5×10-6mol·L-13c(藥物)=1.0×10-6mol·L-14c(藥物)=1.5×10-6mol·L-15c(藥物)=2.0×10-6mol·L-16c(藥物)=2.5×10-6mol·L-1

圖3 藥物與DNA作用的熒光圖
Fig.3 Fluorescence of drug and DNA

3 結(jié) 論

通過化學(xué)合成和表征,碳酸鎂和氫氧化鎂達(dá)到了食藥級標(biāo)準(zhǔn).兩種鎂化合物對臨床順鉑藥物具有載藥功能,并能將藥物分子輸送到腫瘤細(xì)胞組織中,對HeLa細(xì)胞有較強(qiáng)的細(xì)胞凋亡功能和細(xì)胞抑制活性.載藥后的順鉑與單獨(dú)順鉑對 HeLa細(xì)胞具有同樣或略有提高的抑制效果,與IC50結(jié)果相佐證.熒光猝滅結(jié)果證實(shí)了載藥后的順鉑藥物與靶向DNA分子之間發(fā)生了Pt—N(7)共價鍵合和嵌入作用兩種協(xié)同作用模式.