張盼娃，張夏瑋，于好強，盤林秀，付鳳玲,李晚忱

(四川農業(yè)大學 玉米研究所，四川 成都 611130)

蛋白磷酸酶2C(Protein phosphatase type 2C,PP2C)是蛋白磷酸酶超級家族中的一個家族，它通過對多種信號轉導途徑中蛋白質可逆磷酸化的調節(jié)，在植物生長發(fā)育和對環(huán)境脅迫的應答中起重要作用[1-2]。擬南芥、水稻等模式植物的PP2C家族成員已經鑒定，并部分驗證其功能[3-5]。然而，玉米基因組較大，冗余的重復和轉座序列眾多，導致基因家族成員間功能的多樣性更為復雜[6-8]。迄今為止，只鑒定了ZmPP2C家族中少數(shù)成員的功能，比如用ZmPP2C2基因轉化煙草可增強其抗寒性[9]，ZmPP2C16在脫落酸(Abscisic acid,ABA)介導的信號轉導中起重要作用[10]，以及一個未編號的家族成員轉化擬南芥可增強其對非生物逆境的抗性[11]。

本課題組關于ZmPP2C基因在干旱脅迫下的差異表達研究中，克隆了ZmPP2C基因家族的一個成員，并驗證其差異表達應答干旱脅迫，當時命名為ZmPP2Ca，在GenBank的注冊號為KJ855114.1[12]。值得注意的是，在上述研究中利用不同的PCR體系反復擴增該基因開放閱讀框時，均能得到兩個長度不同的片段，序列分析表明，兩個片段長度相差214 bp，但重疊部分的序列完全相同。因此推測，這兩個片段是同一初始轉錄產物的可變剪接體。根據其推導蛋白與擬南芥和水稻PP2C家族成員的同源性和進化樹分析，這一基因在近期的研究中被重新命名為ZmPP2C26[10]。

越來越多的證據表明，50%以上的植物基因均存在可變剪接現(xiàn)象，通過增加轉錄組和蛋白質組的多樣性，應答發(fā)育過程和環(huán)境脅迫[13-23]。例如，小麥DREB2基因[18]、擬南芥SR和SOS4基因[19-20]、水稻OslM和OsMAPK5基因[21-22]的可變剪接都被證明與非生物逆境脅迫應答有關。在耐旱性極強的復蘇草本植物Sporobolusstapfianus中，PP2C基因家族一個成員的可變剪接也被證實對干旱脅迫有應答[23]。

本研究利用反轉錄PCR擴增玉米ZmPP2C26基因的兩個可變剪接體，用以轉化野生型擬南芥，結合蛋白的亞細胞定位，驗證其在干旱脅迫應答中的功能。

1 材料和方法

1.1 ZmPP2C26不同剪接體的克隆

取玉米模式自交系B73幼苗的葉片，用RNAiso plus kit(TaKaRa,大連)提取總RNA。用RNase-free DNase(TaKaRa,大連)去除可能的基因組DNA污染后，用PrimeScriptTMⅡ 1st Strand cDNA Synthesis kit(TaKaRa,大連)反轉錄成cDNA。根據ZmPP2C26基因在GenBank的注冊序列(KJ855114.1)，用Primer-BLAST軟件(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast)設計特異PCR引物(5′-ATGTCTTGCACGGTGGCCA-3′，5′-GAGCTTGAAAATTTCTGCAACT-3′)，用LATaqDNA Polymerase和GC BufferⅠ(TaKaRa,大連)擴增ZmPP2C26基因的開放閱讀框。擴增產物用1%瓊脂糖凝膠電泳分離，用QIAquick Gel Extraction Kit(Qiagen,德國)回收特異條帶，亞克隆至pMD19-T載體(TaKaRa, 大連)，送上海生物工程有限公司測序。利用Spidey軟件(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/spidey/)對測序結果與玉米自交系B73基因組DNA序列(Maize Genetics and Genomics Database，http://www.maizegdb.org/)進行比對，分析ZmPP2C26基因的外顯子/內含子結構，用BLASTp軟件(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)比對較長與較短剪接體推導蛋白的氨基酸序列。

1.2 植物表達載體構建和擬南芥的轉化

用引入限制性酶切位點SmaⅠ和SalⅠ(下劃線堿基)的特異引物(5′-TCCCCCGGGATGTCTTGCACGGTGGCCA-3′,5′-GCGTCGACGAGCTTGAAAATTTCTGCAACT-3′)，從克隆載體pMD19-T上擴增不帶終止密碼(TAA)的ZmPP2C26基因長(LV)、短(SV)兩個可變剪接體的開放閱讀框。擴增產物經限制性內切酶SmaⅠ/SalⅠ雙酶切消化后，插入以增強綠色熒光蛋白基因eGFP為標記的植物表達載體pCAMBIA2300-35S-eGFP，構建成CaMV 35S啟動子和章魚堿合成酶終止子OCS、控制同框融合基因ZmPP2C26-eGFP的植物表達載體pCAMBIA2300-35S-ZmPP2C26(LV)-eGFP和pCAMBIA2300-35S-ZmPP2C26(SV)-eGFP(圖1)。經SmaⅠ/SalⅠ雙酶切鑒定和菌液送樣測序后，凍融法轉化農桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)EHA 105菌株。經抗性培養(yǎng)基篩選后，挑取陽性單克隆搖菌，用花序浸染法[24]轉化野生型擬南芥。

圖1 ZmPP2C26基因兩個可變剪接體的表達結構Fig.1 Expression structures of two alternative spliced variants of ZmPP2C26 gene

1.3 轉基因植株的篩選

T0代種子收獲后，播種于添加50 mg/L卡那霉素(Sigma，美國)的1/2 MS培養(yǎng)基篩選[25]，存活T1代植株自交產生T2代種子。T2代株系繼續(xù)在相同抗性培養(yǎng)基上篩選，選取抗∶感分離比約3∶1的T2代株系繼續(xù)自交，產生T3代種子。在相同抗性培養(yǎng)基上篩選抗性不分離的純合T3代株系。用跨ZmPP2C26基因與eGFP基因的序列片段特異引物(5′-GCCCACCGTCCCCGCCTCTA-3′/5′-CTCGCCCTTGCTCACCATGG-3′)，進行轉基因擬南芥陽性檢測。選取純合轉基因擬南芥制作根尖切片，在熒光顯微鏡(90 I型，Nikon，日本)下檢測綠色熒光信號。

1.4 T3代株系的表型鑒定

從上述鑒定的兩個剪接體轉化的T3代純合株系中，各選20個長勢均勻一致的單株，并以野生型擬南芥為對照，分別移栽至5個盛有營養(yǎng)土的花盆中，在25 ℃、相對濕度60%～70%、光照10 h/黑暗14 h條件下生長2個月，其中3 盆每株取2個葉片用于實時定量PCR檢測(3次生物學重復)后，稱取植株鮮質量，室溫放置6 h，再稱取萎蔫質量，按下式計算相對含水量；另外2盆植株停止?jié)菜?，實施干旱處理，待植株顯現(xiàn)明顯萎蔫癥狀時，拍照紀錄株系間的表型差異。

用IBM-SPSS軟件(http://www-01.ibm.com/software/analytics/spss/)做方差分析和兩個剪接體及空白對照載體轉化T3代株系間的多重比較。

1.5 實時定量PCR檢測

將兩個可變剪接體轉化的T3株系及野生型對照的葉片樣品，經液氮研磨后，用RNAiso plus kit(TaKaRa,大連)提取總RNA，用RNase-free DNase(TaKaRa,大連)去除可能的基因組DNA污染后，用PrimeScriptTMⅡ 1st Strand cDNA Synthesis kit(TaKaRa,大連)反轉錄成cDNA，用于實時定量PCR(Real-time Quantitative PCR,RT-qPCR)檢測。用Primer-BLAST軟件(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast)設計兩對引物，P1(5′-GAGCGGTGAAGAGGGGTTAC-3′)/P2(5′-CCCAATGCCCCTAGACACTG-3′)擴增ZmPP2C26基因cDNA第599至891堿基長293 bp片段，P3(5′-AGTATTGTTGGCCGTCCTCG-3′)/P4(5′-GGGTTAAGAGGCGCTTCAGT-3′)擴增擬南芥肌動蛋白基因AtAct1 cDNA第210到 448堿基長239 bp片段作為內參。用RT-qPCR試劑盒SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ(TliRNaseH Plus)(Takara,大連)在定量PCR系統(tǒng)CFX96TMReal-Time System(Bio-Rad,美國)中進行擴增反應。用兩步法RT-qPCR溫度循環(huán)程序：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，55 ℃ 30 s，循環(huán)39次。然后，將溫度以0.5 ℃/s升高至95 ℃，繪制熔解曲線，用于區(qū)別特異與非特異擴增。用定量系統(tǒng)原配CFX MangerTM軟件(Version 2.0)的2-ΔΔCt法對內參基因與目的基因的表達量進行標準化[26]。用IBM-SPSS軟件(http://www-01.ibm.com/software/analytics/spss/)進行統(tǒng)計分析。

1.6 生物信息學分析與亞細胞定位

用ExPASy軟件(http://web.expasy.org)[27]在線預測兩個可變剪接體的推導氨基酸序列及其物理化學特性。用I-TASSER軟件(http://zhanglab.ccmb.med.umich.edu/I-TASSER)[28], 預測其推導蛋白的三維結構。用TargetP 1.1軟件(http://www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/)[29]，對較長剪接體保留的ZmPP2C26基因第一內含子的推導氨基酸序列進行亞細胞定位預測。

按Sparkes等[30]的方法，分別挑取含有ZmPP2C26(LV)和ZmPP2C26(SV)的農桿菌陽性單克隆搖菌，調節(jié)至OD600=0.5，用微量注射器注入煙草葉片背面，培養(yǎng)2 d后，在90 I 型熒光顯微鏡(Nikon，日本)下檢測增強綠色熒光蛋白基因eGFP瞬時表達的綠色熒光信號。

2 結果與分析

2.1 ZmPP2C26兩個可變剪接體的克隆

以玉米自交系B73的cDNA為模板，用ZmPP2C26基因開放閱讀框特異引物進行PCR擴增，凝膠電泳分離出兩條清晰的特異條帶，條帶大小

與1 000 bp的DNA標記相當(圖2)。序列分析表明，兩條特異條帶分別長1 164和951 bp，其重疊區(qū)域的序列完全相同。與B73基因組DNA序列比對結果表明，在較短剪接體中切除的213 nt第一內含子，在較長剪接體的剪接中被保留(圖3)。第一個內含子的剪接位點為5′-CC..CG-3′，與植物中通常的組成型剪接位點5′-GT..AG-3′不同。保留內含子及其側翼序列的G/C含量較高，相當于其他內含子及其側翼序列的2倍(表1)。兩個剪接體推導氨基酸序列比對結果表明，PP2C蛋白的保守結構域和活性位點均保持不變，保留內含子在近N-端編碼一段71個氨基酸冗余序列，其中不包含PP2C蛋白的保守序列或活性位點(圖4)。

M.DNA分子標記；1.約1 000 bp的兩個特異條帶M.DNA molecular Marker;1.Two specific bands beside 1 000 bp圖2 ZmPP2C26基因開放閱讀框擴增片段Fig.2 Amplified fragments of open reading frame of ZmPP2C26 gene

圖3 ZmPP2C26基因兩個可變剪接體的外顯子/內含子結構Fig.3 Exon and intron structures of two alternative transcripts of ZmPP2C26 gene

內含子Intron長度Length剪接位點及側翼序列Splice sites and flanking sequences內含子G/C含量/%G/C content of intron sequence側翼序列G/C含量/%G/C content of flanking sequences1213 nt5'-GCGGCG//CCCGCG..GCGGCG//GTGGCC-3'82.1695.832126 nt5'-AAGTG//GTAATTT..CTCAG//GCACTGT-3'35.9541.673119 nt5'-ATTTG//GTATGTC..TTCAG//GGTGGAT-3'41.1741.67

注：雙斜線(//)表示內含子5′-端和3′-端的剪接位點。

Note:Double slash (//) indicates intron 5′- and 3′- splice sites.

2.2 轉基因株系的表型

經T1和T2代抗性培養(yǎng)基篩選后，跨ZmPP2C26基因和eGFP基因特異PCR擴增結果顯示，長、短兩個剪接體表達載體轉化分別獲得8和9個純合的T3代株系，而且根尖切片在熒光顯微鏡下均可檢測到綠色熒光信號(圖5)。在兩個表達載體中，ZmPP2C26基因的長、短兩個剪接體均與增強綠色熒光蛋白基因eGFP處于同一開放閱讀框，說明這兩個剪接體也在T3代株系中異源表達。進一步的RT-qPCR檢測表明，兩個剪接體在擬南芥中的相對表達水平比野生型擬南芥高6倍以上，而兩個剪接體各轉化株系之間的差異不顯著(P>0.05)(圖6)。

方差分析及多重比較表明，長、短兩個剪接體轉化T3代株系的相對含水量均顯著低于野生型擬南芥，而兩個剪接體各轉化株系間無顯著差異(圖7)。停止?jié)菜?周以后，兩個轉基因株系開始顯現(xiàn)萎蔫癥狀，5周后萎蔫明顯，而野生型擬南芥保持正常生長(圖8)。

Mu.野生型(空白對照)；LV1～LV8.較長剪接體轉化的T3代株系；SV1～SV9.較短剪接體轉化的T3代株系。*、**分別表示P<0.05、P<0.01顯著性。圖7同Mu.Wild type;LV1-LV8.T3 lines transformed by the longer alternative spliced variant;SV1-SV9.T3 lines transformedby the shorter alternative spliced variant.*,** indicates the statistical significance at P<0.05,P<0.01.The same as Fig.7圖6 兩個剪接體在T3代株系中的相對表達水平Fig.6 Relative expressions of the two alternative spliced variants in the T3 lines

圖7 T3株系及野生型的相對含水量Fig.7 Relative water contents of the T3 lines and the mutant

A.較長剪接體轉化的T3代株系;B.較短剪接體轉化的T3代株系;C.野生型(空白對照)A.T3 lines transformed by the longer alternative spliced variant;B.T3 lines transformed by the shorter alternative spliced variant;C.Wild type (negative control)圖8 T3株系及野生型對干旱脅迫的表型應答Fig.8 Phenotypic responses of the T3 lines and the mutant to drought stress

2.3 ZmPP2C26兩個可變剪接體的理化特性與亞細胞定位

生物信息學預測結果表明，較長和較短剪接體分別編碼長388和317個氨基酸組成的蛋白質，分子量分別為40.79和34.04 ku，等電點分別為5.97和5.27。兩個推導蛋白的三維結構均相似于PPM1K基因編碼的人類蛋白磷酸酶1 K(GenBank注冊號：BC037552)[31]。較長剪接體保留內含子編碼的71個冗余氨基酸保持隨機螺旋狀態(tài)(圖9)，其中58個氨基酸為葉綠體定位信號肽，預測保證概率為0.855。

1K.人類PPM1K基因編碼的蛋白磷酸酶1K；A.較長剪接體推導蛋白的三維結構；B.較短剪接體推導蛋白的三維結構1K.PP2C domain of the protein phosphatase 1K encoded by the PPM1K gene of human;A.The predicted 3-dimensional structure of putative protein of the longer spliced variant;B.The predicted 3-dimensional structure of putative protein of the short spliced variant圖9 ZmPP2C26兩個可變剪接體推導蛋白的三維結構Fig.9 Predicted 3-dimensional structures of putative proteins of two alternative spliced variants of ZmPP2C26

熒光信號檢測表明，注射較長剪接體表達載體的煙草葉片，可在細胞核、細胞膜和細胞器檢測到增強綠色熒光蛋白基因eGFP瞬時表達的綠色熒光信號，而注射較短剪接體表達載體的煙草葉片，只在細胞核和細胞膜檢測到增強綠色熒光蛋白基因eGFP瞬時表達的綠色熒光信號(圖10)。

圖10 ZmPP2C26基因兩個可變剪接體的亞細胞定位Fig.10 Subcellular location of two alternative spliced variants of the ZmPP2C26 gene

3 討 論

可變剪接是真核生物應答發(fā)育過程和環(huán)境脅迫，增加轉錄組和蛋白質組多樣性的重要機制[13-17]。在動植物中，由內含子保留引起的可變剪接可改變剪接體編碼蛋白的亞細胞定位和生理活性[32-35]。本研究中，較長剪接體轉化在煙草葉片中瞬時表達的熒光信號，不僅與較短剪接體瞬時表達的煙草葉片一樣在細胞核和細胞膜上檢測到，還可在細胞器上檢測到。生物信息學預測表明，在較長剪接體保留內含子近N-端編碼的71個氨基酸中，有58個為葉綠體定位信號肽。較長剪接體中保留第一內含子編碼蛋白的功能，有可能使整個酶蛋白的活性由細胞核和細胞膜延伸到葉綠體，這有待構建攜帶葉綠體標記基因的載體進行進一步定位。

可變剪接的機制復雜多樣[15-16]，可變內含子的剪接位點在脊椎動物物種間高度可變[33,36-37]。但在植物中，可變剪接最主要的形式是內含子保留[13,17,38-39]。剪接位點附近的G/C含量影響可變剪接中內含子剪接位點的利用，可能與初始轉錄產物二級結構的穩(wěn)定性有關[40-41]。保留內含子及其側翼序列的G/C含量，一般高于其他剪接形式的內含子[13,42]。在本研究中，ZmPP2C26基因的第一個內含子在較長可變剪接體中被保留，保留內含子及其側翼序列的G/C含量比同一基因的其他兩個內含子及其側翼序列高出 1 倍，且保留內含子的剪接位點(5′-CC..CG-3′)也與同一基因的其他兩個內含子不同，而且有別于植物通常的組成型剪接位點(5′-GT..AG-3′)[43-45]。這些證據都說明，ZmPP2C26基因的第一個內含子可能是一個特殊的保留型可變內含子，這有待進一步深入研究。

蛋白質三維結構預測表明，兩個可變剪接體的推導蛋白均保持PP2C的活性中心。在新近的研究報道中，ZmPP2C26基因的較長可變剪接體被命名為orphan42基因，編碼孤兒轉錄因子家族的一個成員[46]。PP2C家族的部分成員被證實參與ABA介導的信號轉導[47-49]，在逆境脅迫應答中起負調控作用[50-51]。在本研究中，長、短兩個可變剪接體的異源表達，均使擬南芥野生型對干旱脅迫的敏感性增強。這一結果暗示，雖然ZmPP2C26基因不屬于大多數(shù)成員參與ABA信號轉導的第I亞家族[50-51]，但很可能通過可變剪接改變其功能，參與ABA介導的逆境脅迫轉導，起負調控作用[2,12]。由于玉米基因組的復雜性，參與ABA信號轉導的ZmPP2C家族成員，還有待進一步深入鑒定。

4 結 論

玉米蛋白磷酸酶2C基因ZmPP2C26在轉錄后發(fā)生可變剪接，較短剪接體中剪除的長213 nt的第一內含子在較長剪接體中被保留。保留內含子不改變編碼蛋白的蛋白磷酸酶活性，預測編碼一段葉綠體信號肽，有可能使其功能由細胞核和細胞膜延伸到葉綠體。兩個剪接體的異源表達，均可使擬南芥野生型對干旱脅迫的敏感性增強，說明其在ABA介導的逆境信號轉導中起負調控作用。