喬國梁 郭斂容 方 黎

鼻咽癌是我國高發(fā)惡性腫瘤之一, 特別是南方各省份,發(fā)病率居高不下。鼻咽癌常見臨床癥狀為鼻塞、涕中帶血、耳悶堵感、聽力下降、復(fù)視及頭痛等癥狀, 由于鼻咽癌敏感度中等, 所以進(jìn)行放療能取得一定效果［1］。Polo樣激酶1(Polo-like kinase 1, PLK1)可以參與細(xì)胞有絲分裂 , DNA 復(fù)制和修復(fù)等過程, 是具有重要調(diào)節(jié)功能的蛋白激酶［2］。隨著放療持續(xù)進(jìn)行, 腫瘤細(xì)胞放射敏感度會(huì)出現(xiàn)一定程度下降。本文主要探究抑制Polo樣激酶1對(duì)鼻咽癌輻射敏感度的影響,現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料來源

1.1.1 鼻咽癌細(xì)胞植株培養(yǎng) 選擇研究中常用的人鼻咽癌細(xì)胞株, 如HNE-1；按常規(guī)培養(yǎng)方法, 用DMEM培養(yǎng)液加胎牛血清、青霉素、鏈霉素和左旋谷氨酰胺培養(yǎng)［3］。

1.1.2 荷瘤小鼠培養(yǎng)方案 按照實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)建立的方法,用裸鼠造模。在每只小鼠的一側(cè)的腰部注射106個(gè)按上述方法培養(yǎng)的鼻咽癌細(xì)胞。待腫瘤塊長(zhǎng)大至5～6 mm直徑時(shí)開始, 逐日用游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤的大小, 記錄并計(jì)算腫瘤的體積［4］。

1.2 方法

1.2.1 荷瘤小鼠放療方案 當(dāng)腫瘤長(zhǎng)大至0.8～1.0 cm時(shí)開始。將荷瘤小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、觀察1組和觀察2組, 各10只。對(duì)照組荷瘤小鼠不做任何處理；觀察1組荷瘤小鼠采用放射治療, 劑量1 Gy/次, 1次/d；觀察2組荷瘤小鼠采用放射治療 , 劑量 3 Gy/次 , 1 次 /3 d。小鼠在輕度麻醉下接受放療。放射線只照射腫瘤局部。

1.2.2 RT-PCR檢測(cè)法 收集培養(yǎng)的鼻咽癌細(xì)胞和從荷瘤小鼠切下來的鼻咽癌組織。鼻咽癌組織首先按酶消化法制成單細(xì)胞懸液；然后用購買的試劑盒將其中的非癌細(xì)胞(包括T 細(xì)胞 , B 細(xì)胞 , 單核細(xì)胞 , 樹突細(xì)胞 , 自然殺傷細(xì)胞 , 纖維細(xì)胞)按盒內(nèi)說明書操作分離出去；用剩下的癌細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)［5］。用TRIzol試劑提取細(xì)胞內(nèi)的RNA。Polo樣激酶1水平用計(jì)算機(jī)軟件設(shè)計(jì)。用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA, 再用實(shí)時(shí)PCR儀擴(kuò)增。結(jié)果用2-△△Ct法計(jì)算, 表達(dá)為對(duì)照組的倍數(shù)［6］。

1.3 觀察指標(biāo) 對(duì)比三組荷瘤小鼠Polo樣激酶1和腫瘤生長(zhǎng)情況, 分析Polo樣激酶1和腫瘤生長(zhǎng)相關(guān)性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(s)表示, 采用t檢驗(yàn)。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三組荷瘤小鼠Polo樣激酶1和腫瘤生長(zhǎng)情況對(duì)比 觀察2組Polo樣激酶1(0.9±0.2)μg/ml和腫瘤生長(zhǎng)(0.4±0.1)cm低于對(duì)照組的 (2.5±0.4)μg/ml、(1.0±0.2)cm和觀察 1組的(1.4±0.5)μg/ml、(0.7±0.2)cm, 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.05)。見表1。

表1 三組荷瘤小鼠Polo樣激酶1和腫瘤生長(zhǎng)情況對(duì)比(s)

表1 三組荷瘤小鼠Polo樣激酶1和腫瘤生長(zhǎng)情況對(duì)比(s)

注：與觀察2組對(duì)比, aP＜0.05

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2.2 Polo樣激酶1和腫瘤生長(zhǎng)相關(guān)性分析 Polo樣激酶1和腫瘤生長(zhǎng)呈正相關(guān) (r=0.836, P＜0.05)。見表 2。

表2 Polo樣激酶1和腫瘤生長(zhǎng)相關(guān)性分析

3 討論

隨著對(duì)惡性腫瘤研究越來越深入, 很多實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明Polo樣激酶1表達(dá)和功能異常與腫瘤細(xì)胞輻射敏感度有直接關(guān)系［7］。Polo樣激酶1存在于真核細(xì)胞中的絲氨酸/蘇氨酸激酶中, 而人類的Polo樣激酶1基因位于16p12, 其中mRNA約 2.3 kb, 蛋白質(zhì)分子量約 68 kDa［8］。Polo 樣激酶 1 結(jié)構(gòu)與其他激酶略微不同, 其高度保守, 依靠N末端中間段賴氨酸與三磷酸腺苷(ATP)結(jié)合, 是保證其活性的一個(gè)重要位點(diǎn)。此外, 在其N末端還包含一個(gè)T loop結(jié)構(gòu)。在腫瘤細(xì)胞中,Polo樣激酶1進(jìn)行高表達(dá), 而且在其他實(shí)驗(yàn)可以發(fā)現(xiàn), Polo樣激酶1直接作用于細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化［9］。但在肝癌、胰腺癌的研究中發(fā)現(xiàn), 在惡性腫瘤早期可以發(fā)現(xiàn)Polo樣激酶1的高表達(dá)。所以發(fā)現(xiàn)Polo樣激酶1的過表達(dá)能夠促進(jìn)細(xì)胞進(jìn)行增殖, 另一方面會(huì)幫助受到損傷的DNA逃離監(jiān)測(cè)點(diǎn), 使染色體不穩(wěn)定性增加, 導(dǎo)致腫瘤出現(xiàn)。從上述結(jié)果中發(fā)現(xiàn), Polo樣激酶1表達(dá)與腫瘤細(xì)胞關(guān)系密切, 如果進(jìn)行Polo樣激酶1的抑制或者增殖, 也許可以做到控制惡性腫瘤發(fā)展的目的。

本文研究表明：觀察2組Polo樣激酶1(0.9±0.2)μg/ml和腫瘤生長(zhǎng)(0.4±0.1)cm低于對(duì)照組的(2.5±0.4)μg/ml、(1.0±0.2)cm 和觀察 1 組的 (1.4±0.5)μg/ml、(0.7±0.2)cm, 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。Polo樣激酶1和腫瘤生長(zhǎng)呈正相關(guān)(r=0.836, P＜0.05)。通過上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn) , 腫瘤生長(zhǎng)和 Polo樣激酶1有一定聯(lián)系, 但具體結(jié)果需要進(jìn)行人類實(shí)驗(yàn)并擴(kuò)大實(shí)驗(yàn)數(shù)量。

綜上所述 , 采用劑量 3 Gy/次 , 1 次 /3 d 的放射治療能顯著降低小鼠Polo樣激酶1水平, 并限制腫瘤生長(zhǎng), 并且可以發(fā)現(xiàn)腫瘤生長(zhǎng)與Polo樣激酶1呈正相關(guān)。