李偉東，程杰山，高營(yíng)營(yíng)*，范培格*

（1. 中國(guó)科學(xué)院植物研究所，北京 100093；2. 魯東大學(xué)農(nóng)學(xué)院，山東煙臺(tái) 264000)

葡萄是我國(guó)五大果樹(shù)之一，據(jù)國(guó)家統(tǒng)計(jì)局?jǐn)?shù)據(jù)，2015年我國(guó)葡萄栽培面積79.9萬(wàn) hm2，產(chǎn)量1366.9萬(wàn) t，栽培面積和產(chǎn)量分居世界第二位和第一位，葡萄產(chǎn)業(yè)在我國(guó)農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)發(fā)展中占據(jù)重要地位。但我國(guó)葡萄實(shí)際栽培中還存在旱寒、鹽堿等不利因素[1]，所以抗逆、加工及鮮食新品種的選育是我國(guó)葡萄育種的重要方向。目前有性雜交育種仍是國(guó)內(nèi)外葡萄新品種選育的最主要方法[2]，獲得較多的雜種苗是新品種選育的首要條件，而提高雜交種子的萌發(fā)率對(duì)于有性雜交至關(guān)重要。在多種植物中的研究發(fā)現(xiàn)，變溫處理可以打破種子休眠并提高種子萌發(fā)率[3-7]。

果樹(shù)多倍體育種已成為果樹(shù)新品種選育的重要技術(shù)手段并具有廣闊的前景[8]。為獲得高抗逆、大粒優(yōu)質(zhì)新種質(zhì)，本實(shí)驗(yàn)室前期利用高抗逆品種‘北紅’‘北玫’染色體加倍獲得其同源四倍體植株，為充分利用高抗逆資源，特開(kāi)展其二倍體與同源四倍體種子萌發(fā)試驗(yàn)，為今后葡萄多倍體育種提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

于2018年3～4月在中國(guó)科學(xué)院植物研究所進(jìn)行，所用種子于2017年10上旬在中國(guó)科學(xué)院植物研究所北區(qū)葡萄品種圃?xún)?nèi)采收。選用‘北紅’‘北玫’及‘四倍體北紅’‘四倍體北玫’種子各200粒。

1.2 方法

1.2.1 種子采集

采集各品種充分成熟的葡萄果實(shí)，冰箱4 ℃保存，在播種前人工剝皮去除果肉取出種子，挑選飽滿(mǎn)種子洗凈，做好標(biāo)簽。

1.2.2 種子處理與催芽

將種子先用洗衣粉清洗干凈，無(wú)菌水沖洗，然后75%乙醇浸泡10 min，無(wú)菌水沖洗，再用5%次氯酸鈉溶液浸泡15 min，用無(wú)菌水沖洗干凈。

將各品種種子平均分成兩組（甲組和乙組），每組100粒。每組種子平均分到3個(gè)置有三層濕濾紙的培養(yǎng)皿中（A，B，C），用封口膜封住，貼好標(biāo)簽，作為3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

將甲組種子放入25 ℃、24 h恒溫培養(yǎng)箱中用錫紙遮蓋進(jìn)行暗催芽，乙組種子同樣用錫紙遮蓋進(jìn)行暗催芽，放入恒溫庫(kù)中進(jìn)行30 ℃，12 h/20 ℃，12 h的變溫處理。每天定時(shí)觀察記錄發(fā)芽種子數(shù)，并適時(shí)補(bǔ)充水分和換氣。以種子開(kāi)裂露白或長(zhǎng)根為萌芽標(biāo)準(zhǔn)[9]，待種子發(fā)芽數(shù)不再增加時(shí)終止調(diào)查統(tǒng)計(jì)。

1.3 統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)

利用Excel軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，使用SPSS 21.0中的Dancun's法進(jìn)行差異顯著性分析（P＜0.05）。

發(fā)芽率計(jì)算公式如下：

發(fā)芽率/%＝（萌發(fā)種子總數(shù)/供試種子總數(shù)）×100

日發(fā)芽率/%＝（每日發(fā)芽種子數(shù)/供試種子總數(shù)）×100

2 結(jié)果分析

2.1 不同萌發(fā)條件下‘北紅’‘北玫’及其四倍體實(shí)生種子發(fā)芽率

表1 ‘北紅’及‘四倍體北紅’發(fā)芽率情況Table 1 The germination rate of 'Beihong' and 'Tetraploid Beihong'

表2 ‘北玫’及‘四倍體北玫’發(fā)芽率情況Table 2 The germination rate of 'Beimei' and 'Tetraploid Beimei'

由表1與表2可看出，兩種萌發(fā)環(huán)境處理下的二倍體‘北紅’‘北玫’種子的萌芽率均明顯高于相應(yīng)同源四倍體種子，‘北紅’兩種處理?xiàng)l件下種子萌發(fā)率均在90%以上，而其同源四倍體種子的萌發(fā)率在兩種處理?xiàng)l件下均很低，分別為23%和37%?！泵怠c其同源四倍體種子的萌發(fā)情況與‘北紅’類(lèi)似，只不過(guò)‘北玫’種子的萌發(fā)率低于‘北紅’，‘四倍體北玫’種子的萌發(fā)率更低，最高僅為7%。

除‘北紅’外，‘北玫’及‘四倍體北紅’‘四倍體北玫’在變溫處理下種子的萌發(fā)率數(shù)值與恒溫處理下相比，雖未達(dá)到顯著差異水平，但數(shù)值略有增加。

2.2 不同萌發(fā)條件下日發(fā)芽率

圖1 ‘北紅’及‘四倍體北紅’日發(fā)芽率Figure 1 The daily germination rate of 'Beihong' and'Tetraploid Beihong'

圖2 ‘北玫’及‘四倍體北玫’日發(fā)芽率Figure 2 The daily germination rate of 'Beimei' and 'Tetraploid Beimei'

各參試品種的種子日萌發(fā)率達(dá)到峰值所需的催芽時(shí)間用催芽后天數(shù)[10]表征。由圖1和圖2可知，各參試品種在兩種處理下日萌發(fā)率達(dá)到峰值所用時(shí)間分別為：甲組‘北紅’7 d，‘四倍體北紅’13 d；乙組‘北紅’12 d，‘四倍體北紅’23 d；甲組‘北玫’9 d，‘四倍體北玫’17 d；乙組‘北玫’12 d，‘四倍體北玫’21 d。相同環(huán)境條件下，二倍體種子達(dá)到日萌發(fā)率峰值的速度均快于其同源四倍體，‘北紅’比相應(yīng)同源四倍體至少提前6 d，‘北玫’至少提前8 d。而變溫處理使二倍體和四倍體的日萌發(fā)率峰值均推遲，變溫使‘北紅’種子日萌發(fā)峰值推遲了5 d，‘北玫’種子推遲了3 d，‘四倍體北紅’推遲了10 d，‘四倍體北玫’推遲了5 d。

本試驗(yàn)中各參試品種的種子從開(kāi)始發(fā)芽到結(jié)束發(fā)芽所用時(shí)間（間隔天數(shù)）：甲組‘北紅’14 d，‘四倍體北紅’25 d；乙組‘北紅’16 d，‘四倍體北紅’21 d；甲組‘北玫’15 d，‘四倍體北玫’18 d；乙組‘北玫’14 d，‘四倍體北玫’12 d?？傮w來(lái)看，不同條件下二倍體品種發(fā)芽更為集中，間隔天數(shù)為14～16 d，‘四倍體北玫’比‘四倍體北紅’萌發(fā)時(shí)間較短。除‘北紅’外，其余品種在變溫條件下的間隔天數(shù)短于恒溫條件下的天數(shù)。

圖3 ‘北紅’及‘四倍體北紅’累計(jì)發(fā)芽率Figure 3 The accumulated germination rate of 'Beihong' and'Tetraploid Beihong'

圖4 ‘北玫’及‘四倍體北玫’累計(jì)發(fā)芽率Figure 4 The accumulated germination rate of 'Beimei' and'Tetraploid Beimei'

2.3 葡萄種子累計(jì)發(fā)芽率

由圖3與圖4可知，無(wú)論是恒溫處理還是變溫處理，‘北紅’和‘北玫’二倍體種子發(fā)芽快，且更為集中，34 d的試驗(yàn)中，二倍體‘北紅’（甲組）在催芽開(kāi)始后18 d即達(dá)到最大值94.95%，其四倍體種子（乙組）試驗(yàn)期間陸續(xù)萌芽，到34 d僅達(dá)到37.56%。相同倍性種子在不同條件下表現(xiàn)出相似的萌發(fā)趨勢(shì)，變溫處理下各參試品種在早期的萌芽率均低于恒溫處理的，但在后期除‘北紅’外，‘北玫’‘四倍體北玫’和‘四倍體北紅’的萌芽率均有所上升，超過(guò)了恒溫處理。

3 討論與結(jié)論

多倍體材料因?yàn)槿旧w的加倍效應(yīng)，在表型上與二倍體差異較大，如花粉粒大并且形狀不規(guī)則，胚珠異常，發(fā)芽率低，種子較大、較少且部分發(fā)育不良，果實(shí)成熟期提前等[11]。通過(guò)本試驗(yàn)也得出結(jié)論，不同染色體倍性葡萄種子的萌發(fā)率存在較大差異，二倍體種子的萌發(fā)率明顯高于同源四倍體種子。這與李麗霞等[11]對(duì)葡萄多倍體研究和張巍巍等[12]對(duì)四倍體黑芥種子萌發(fā)率遠(yuǎn)低于二倍體種子研究一致。種子的萌發(fā)受諸多因素影響，如種子的本身特性、外界環(huán)境條件、成熟度、內(nèi)源激素、層積處理?xiàng)l件等[13]。有研究報(bào)道，二倍體葡萄種子較小，種皮相對(duì)較薄，水分容易進(jìn)入，相對(duì)容易萌發(fā)，四倍體種子相對(duì)較大，種皮厚且堅(jiān)硬，不易萌發(fā)[11]。另外相較于二倍體，生產(chǎn)中四倍體種子胚敗育的情況比較常見(jiàn)[14]。此外，種子內(nèi)源激素影響種子萌發(fā)[15-17]，前人研究表明，四倍體植株內(nèi)源激素含量不同于其二倍體[18-19]，我們推測(cè)本研究中可能是四倍體種子內(nèi)源激素含量的不同導(dǎo)致了種子發(fā)芽率較低。對(duì)于導(dǎo)致二倍體與同源四倍體種子萌發(fā)率差異的原因有待進(jìn)一步深入研究，以便尋找提高四倍體萌芽率的技術(shù)措施。據(jù)報(bào)道，變溫調(diào)節(jié)可以促進(jìn)多種植物種子的萌芽[3-7]，在本試驗(yàn)中，雖然變溫處理下‘北玫’‘四倍體北玫’和‘四倍體北紅’的萌芽率高于恒溫處理，但不存在顯著性差異。變溫處理雖然推遲了種子開(kāi)始萌發(fā)的時(shí)間和達(dá)到日萌發(fā)峰值所需的天數(shù)，但縮短了從萌發(fā)開(kāi)始到結(jié)束的天數(shù)，發(fā)芽更為集中。所以我們建議如果以發(fā)芽速度為目的催芽，可以考慮使用恒溫條件，如果以最終發(fā)芽率或發(fā)芽集中為目的催芽，可以考慮使用變溫條件。