仝亞軍，高玉錄，翟衡，杜遠(yuǎn)鵬，孫慶華*

（山東農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝科學(xué)與工程學(xué)院，山東泰安 271018）

褪黑素（Melatonin，MT）又名N-乙酰-5-甲氧基色胺，為吲哚類物質(zhì)[1]，在動(dòng)物中參與調(diào)節(jié)晝夜節(jié)律，在夜間觀察到最高濃度水平，并在白天降低到幾乎檢測不到的水平，因此被稱為黑暗激素。五羥色胺（5-HT）作為MT的合成前體可以被羥色胺-N-乙?；D(zhuǎn)移酶催化為N-乙酰-五羥色胺[2]。MT的代謝產(chǎn)物包括2-羥基褪黑素（2-OH）、4-羥基褪黑素、6-羥基褪黑素等，其中最主要的為2-OH（99%），其次為4-羥基褪黑素（0.05%）[3]。

脊椎動(dòng)物中MT主要由松果體產(chǎn)生，再分泌到血液中。由于松果體的生理活性受光周期環(huán)境的影響[4]，所以褪黑激素的合成和分泌也受到光周期影響而表現(xiàn)出晝夜節(jié)律，在光周期的黑暗期合成并分泌[5]，在蘇醒時(shí)達(dá)到最高水平，而光照會(huì)抑制脊椎動(dòng)物中褪黑激素的產(chǎn)生[6]，褪黑激素的晝夜節(jié)律也會(huì)隨著衰老和某些醫(yī)學(xué)疾?。òㄐ呐K疾病和神經(jīng)退行性疾病）而受到損害[7]，因此在動(dòng)物中MT與睡眠有明顯的關(guān)聯(lián)。

研究表明，植物中MT的含量同樣存在晝夜變化規(guī)律。一般在黑暗條件下植物MT含量上升，如在短日照植物紅黍中，光照期間幾乎檢測不到MT，而在暗期含量上升，且于光期開始前的4～6 h達(dá)到最大值，這與動(dòng)物體中MT合成的晝夜節(jié)律非常相似。后來發(fā)現(xiàn)黃芩和水葫蘆中的MT也存在著同樣晝夜變化[8-9]，然而也有一些研究報(bào)道番茄、牽?；?、蘆薈和貫葉連翹植株中的MT含量并不存在晝夜差異，而櫻桃果實(shí)中的MT含量在晝夜24 h內(nèi)出現(xiàn)兩個(gè)高峰。由上述結(jié)果可以看出，不同植物中的MT合成晝夜節(jié)律可能存在較大差異，而葡萄中MT合成的晝夜節(jié)律目前還未見到報(bào)道。因此本研究以‘美樂’的果皮和葉片及‘摩爾多瓦’的果皮為試材，探討葡萄上MT及其前體物質(zhì)的晝夜變化規(guī)律及套袋對(duì)其晝夜節(jié)律的影響。

1 材料與方法

1.1 試材與處理

試驗(yàn)于2017年7～9月山東農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院葡萄試驗(yàn)基地進(jìn)行。以田間6年生籬架栽培的‘美樂’（Vitis vinifera cv Merlot）和‘摩爾多瓦’（Moldova，Guzalkara×SV.12-375）為試材。南北行向，2.2 m×1.2 m，單臂單干垂直葉幕，栽培管理一致。其中對(duì)‘摩爾多瓦’部分果穗在6月15日進(jìn)行了套紙袋處理，‘美樂’未套袋。7月22日對(duì)‘美樂’果實(shí)及‘摩爾多瓦’的套袋果及不套袋果進(jìn)行采樣，晝夜采樣時(shí)間分別為16時(shí)、20時(shí)、24時(shí)、4時(shí)、6時(shí)、8時(shí)、12時(shí)。每個(gè)品種每個(gè)處理選長勢一致的3株，重復(fù)3次，共9株。每株選取西側(cè)統(tǒng)一部位的果穗迅速帶回實(shí)驗(yàn)室，在冰上將果粒剪下快速將果皮與果肉分離，用液氮將果皮冷藏。經(jīng)前期測定果肉中MT含量極少，所以本試驗(yàn)材料僅取果皮。另外，還分別于7月22日和9月3日與果實(shí)采摘同步時(shí)間采摘‘美樂’葉片，每處理每植株上部選取一片成熟葉片，葉片摘下后立刻液氮速凍。

1.2 測定指標(biāo)與方法

取液氮速凍樣品置于冷凍干燥機(jī)凍干（≥48 h）后，稱取葡萄果皮/葉片樣品0.5～1.0 g（凍粉2.0～3.0 g），在液氮冷凍狀態(tài)下用冷凍磨樣機(jī)研磨成干粉，置于10 mL試管中，加5 mL純分析級(jí)甲醇振蕩混勻，使其充分溶解。渦旋機(jī)渦旋震蕩，然后用超聲波清洗機(jī)低溫超聲提取15 min（300 w）。靜置12 h后，在4 ℃下用12 000 r/s離心15 min，收集上清液并用0.22 μm有機(jī)濾膜進(jìn)行過濾，濾液置于新試管中。再次加入5 mL的分析級(jí)甲醇進(jìn)行二次離心10 min，收集上清液并用0.22 μm有機(jī)濾膜進(jìn)行過濾。低溫旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)（不超過30 ℃，避光）。將蒸干后的物質(zhì)用3 mL 5%甲醇水溶液分3次重新溶解，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾到新5 mL試管中。SPE固相萃取后定容到1 mL，經(jīng)高效液相色譜-熒光（TSQ-Quantum-Access-MAX三重四極桿）檢測。5-HT、MT和2-OH的檢測參數(shù)為：激發(fā)波長λex＝288 nm；發(fā)射波長λem＝333 nm；參數(shù)柱溫：25 ℃；跑樣時(shí)間：8 min；初始流動(dòng)相比例甲醇∶水（0.05%乙酸）＝20∶80；梯度洗脫：0 min/80 H2O→0 min/80 H2O→0.8 min/80 H2O→2 min/40 H2O→5 min/40 H2O→5.1 min/80 H2O→8 min/80 H2O；進(jìn)樣量：5 μL。

2 結(jié)果與分析

2.1 ‘美樂’果皮中5-HT、MT和2-OH的晝夜節(jié)律

圖1 ‘美樂’葡萄果皮三種物質(zhì)的晝夜節(jié)律（7月22日）Figure 1 Circadian rhythms of three substances of 'Merlot'grape peel (July 22)

如圖1所示，作為MT合成前體的5-HT自下午16時(shí)至24時(shí)濃度達(dá)到較高水平，為14.47～11.23 ng/g，其后急劇下降，從凌晨4時(shí)至中午12時(shí)變化于0.27～2.54 ng/g；相應(yīng)的MT在16時(shí)至4時(shí)濃度維持在較高的0.60～0.72 ng/g，其后緩慢下降，8時(shí)至12時(shí)維持在0.25 ng/g，濃度水平高于其前體。其代謝產(chǎn)物2-OH的峰值為14.47 ng/g同樣出現(xiàn)在16時(shí)，除了晚8時(shí)和上午8時(shí)分別有兩次下降，20時(shí)達(dá)到最小值0.96 ng/g，其他時(shí)間均保持較高的濃度水平。測定表明，‘美樂’葡萄果皮內(nèi)的MT濃度隨時(shí)間的變化具有明顯的晝夜節(jié)律。

2.2 ‘美樂’葉片中5-HT、MT和2-OH的晝夜節(jié)律

圖2 ‘美樂’不同時(shí)期葉片中MT、5-HT和2-OH濃度Figure 2 Concentrations of 5-HT, MT and 2-OH in leaves of'Merlot' during different periods

為了查看功能葉片和衰老葉片MT的差異，選擇7月22日和9月3日的‘美樂’葉片測定5-HT、MT和2-OH的濃度變化，結(jié)果如圖2所示?！罉贰~片中5-HT的濃度7月22日略高與9月3日，濃度均在0.2 ng/g到0.4 ng/g。MT濃度7月平均濃度為0.88 ng/g，明顯高于9月0.028 ng/g，7月葉片中MT濃度在8時(shí)最高，最高濃度達(dá)到1.93 ng/g；9月葉片中MT濃度比較低，最高濃度為12時(shí)0.1 ng/g。2-OH濃度7月的濃度略高于9月，前者4時(shí)濃度最高為17.2 ng/g。結(jié)果表明，葡萄果皮中MT含量夜間處于較高水平，白天濃度降低。

2.3 套袋對(duì)‘摩爾多瓦’果皮中5-HT、MT、2-OH晝夜節(jié)律的影響

圖3 套袋對(duì)‘摩爾多瓦’果實(shí)5-HT、MT及2-OH濃度的影響Figure 3 Effect of bagging on the concentrations of MT, 5-HT and 2-OH in 'Moldova' fruits

如圖3所示，套袋和未套袋的‘摩爾多瓦’葡萄果皮中5-HT濃度均較低，保持在0.5 ng/g以下，夜間5-HT含量逐漸升高達(dá)到峰值后逐漸降低，并且套袋處理后5-HT出現(xiàn)峰值時(shí)間由24時(shí)推遲到6時(shí)，峰值由0.22 ng/g到0.26 ng/g。MT夜間16時(shí)至24時(shí)維持在較低水平1 ng/g內(nèi)，套袋處理后MT平均含量由0.81 ng/g升高到1.60 ng/g。套袋處理后MT含量明顯升高，4時(shí)達(dá)到峰值4.19 ng/g，8時(shí)到12時(shí)套袋和未套袋果皮中MT濃度均上升，并且未套袋上升幅度明顯高于套袋處理。如圖3C所示，未套袋處理的果皮中2-OH含量呈下降趨勢，6時(shí)出現(xiàn)峰值；套袋處理后2-OH夜間峰值出現(xiàn)在24時(shí)（9.18 ng/g），提前了6 h。結(jié)果表明，經(jīng)套袋處理后中午12時(shí)5-HT濃度提高，MT濃度明顯低于未套袋。

3 討論與結(jié)論

MT作為明暗周期調(diào)節(jié)劑的作用在哺乳動(dòng)物中早已得到了證實(shí)。近年來，在植物中發(fā)現(xiàn)MT也存在著類似于動(dòng)物中的晝夜節(jié)律，在光照期間水平低，而在黑暗中顯著增加達(dá)到最大水平。但也有人發(fā)現(xiàn)在某些植物中MT的合成存在不同于動(dòng)物的節(jié)律，如番茄、牽牛花、蘆薈中的MT含量并不存在晝夜差異[9]，而櫻桃果實(shí)、芍藥花瓣中的MT含量晝夜日變化含量在2時(shí)和14時(shí)有兩個(gè)峰值點(diǎn)，一個(gè)可能與黑暗有關(guān)，另一個(gè)可能與氧化應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)，即高溫和光強(qiáng)[10]。由此可見，MT的合成不僅與光照有關(guān)，與溫度等其他環(huán)境因素也關(guān)系密切，而且不同植物MT合成的晝夜節(jié)律也可能存在差異。本研究發(fā)現(xiàn)，葡萄葉片和果皮中MT合成隨著溫度和光照強(qiáng)度的變化呈現(xiàn)相應(yīng)的變化?！罉贰ぶ?-HT、MT和2-OH這三種物質(zhì)都是晚上高，白天低；而‘摩爾多瓦’果皮中5-HT含量在24時(shí)達(dá)到最高峰，14時(shí)又會(huì)出現(xiàn)一個(gè)小高峰；而MT含量晚上一直較低，到中午12時(shí)才有一個(gè)高峰；2-OH也在中午及下午維持較高濃度，估計(jì)與其抗高溫光照脅迫有關(guān)?？梢姴煌咸哑贩NMT的晝夜節(jié)律也存在差異。通過測定‘美樂’葡萄葉片中5-HT、MT和2-OH含量也與其果實(shí)有類似規(guī)律，但高峰值有所延后。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)處于功能盛期的‘美樂’葉片比秋季衰老葉片中MT平均濃度明顯要高，說明植物衰老影響MT濃度，這與在桑葉MT含量頂端＞幼葉＞老葉一致[11]?；谝陨辖Y(jié)果，我們推測葡萄上MT代謝存在晝夜節(jié)律，并且黑暗環(huán)境有利于MT的累積，同時(shí)光強(qiáng)如果過高也會(huì)促進(jìn)MT的合成。

MT被證明是一種有效的自由基清除劑和廣譜抗氧化劑[12]。有研究發(fā)現(xiàn)，紫外輻射會(huì)使植物體內(nèi)產(chǎn)生過量自由基造成傷害，而MT在藻類和高等植物中具有抵御紫外線傷害的能力，將甘草的根置于紫外線下3 d，其內(nèi)源MT含量是白光對(duì)照的4～5倍，表明植物可提高M(jìn)T濃度來抵抗紫外線造成的氧化傷害[13]。但也有不同的研究結(jié)果，如李超[14]也發(fā)現(xiàn)樹冠外圍蘋果果皮MT含量高于內(nèi)膛果果皮，東南向蘋果果皮MT含量明顯高于西北向蘋果果皮，未套袋果的果肉和果皮中MT含量顯著高于套袋果，但在摘袋后果皮中的MT含量迅速增加。Riga等[15]發(fā)現(xiàn)，遮陰條件下大部分番茄果實(shí)中MT含量明顯提高，而大部分辣椒果實(shí)中MT含量卻呈現(xiàn)下降的趨勢。本研究發(fā)現(xiàn)，晚上套袋果皮MT含量高于未套袋，但白天未套袋葡萄果皮中MT含量升高較快，在中午12時(shí)未套袋處理MT濃度明顯高于套袋處理，這可能與當(dāng)天中午12時(shí)外界溫度和光強(qiáng)過高有關(guān)，高溫高光強(qiáng)會(huì)促進(jìn)植物內(nèi)源MT合成，從而保護(hù)果實(shí)免受高溫及光氧化脅迫的侵害。