吳代東，陳立*，李洪艷，吳艷艷，周詠梅，夏周祥，謝太理

（1. 廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院葡萄與葡萄酒研究所，南寧 530007；2. 廣西大學(xué)植物科學(xué)國家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心，南寧530004；3. 廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所，南寧 530007；4. 廣西大學(xué)生命科學(xué)院，南寧 530004）

近～4年來，關(guān)于植物遺傳關(guān)系的ISSR分析的研究不斷增加，有關(guān)葡萄種質(zhì)資源豐富的遺傳多樣性，已經(jīng)可以利用ISSR分子標(biāo)記有效地揭示刺葡萄種質(zhì)資源的遺傳多樣性和親緣關(guān)系[1-2]。此外，目前已建立和優(yōu)化穩(wěn)定的葡萄ISSR-PCR反應(yīng)體系[3-5]，為進(jìn)一步開展野生葡萄遺傳多樣性研究和品種選優(yōu)提供理論依據(jù)。不同品種的葡萄在表型上不易區(qū)分，但是在遺傳性質(zhì)上的差異則非常明顯，它們的基因不同，而遺傳物質(zhì)的差異可以通過提取DNA進(jìn)行電泳加以區(qū)分。葡萄在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上，不同品種抗逆性有顯著差別，特別是野生種質(zhì)在抗病性、功能性成分和逆境脅迫方面與栽培品種有顯著不同。其品種繁多、來源復(fù)雜，不便于區(qū)分，本研究對(duì)36份葡萄材料進(jìn)行DNA提取，探究了葡萄的遺傳多樣性，并且構(gòu)建不同種之間的遺傳關(guān)系圖譜。通過分析葡萄遺傳關(guān)系來更方便地區(qū)分不同品種，對(duì)于葡萄產(chǎn)業(yè)的發(fā)展特別是種質(zhì)資源創(chuàng)新利用，雜交后代的親緣關(guān)系分析和鑒定來說，具有一定的經(jīng)濟(jì)價(jià)值效益。

1 材料與方法

1.1 材料

用于ISSR分析的材料共36份，分別為：‘水源2號(hào)’‘水源14號(hào)’‘水源5號(hào)’等見表1。研究材料取自廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院葡萄研究團(tuán)隊(duì)的資源圃，試驗(yàn)在廣西大學(xué)植物科學(xué)國家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

1.2 試驗(yàn)方法

利用生工生物工程（上海）股份有限公司生產(chǎn)的Ezup柱式植物基因DNA抽提試劑盒，從選擇的所有葡萄材料幼葉中提取基因組DNA，于10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測，通過Eppendorf公司生產(chǎn)的Bio-Photometer核酸檢測儀檢測DNA溶液濃度與純度，并將濃度稀釋至20 ng/μL。PCR擴(kuò)增采用10 μL反應(yīng)體系，其中含6 μL 2×Taq PCR Master Mix, 1 μL ISSR引物，1 μL（20 ng）DNA模板，2 μL ddH2O。用于ISSR-PCR反應(yīng)的6 μL 2×Taq PCR Master Mix、標(biāo)準(zhǔn)分子量（Marker）、引物根據(jù)哥倫比亞大學(xué)公布序列設(shè)計(jì)[6-8]，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

PCR反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性3 min，95 ℃變性30 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸1.5 min，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min。PCR反應(yīng)在美國MJ公司的PTC-200型PCR循環(huán)儀上進(jìn)行。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)含有4 μg/mL GelRed核酸染料的10 g/L瓊脂糖凝膠電泳分離，于Gene Genius公司的Bio Imaging System凝膠成像系統(tǒng)上記錄數(shù)據(jù)。

根據(jù)各引物標(biāo)記的遷移率及其有無統(tǒng)計(jì)所有的矩陣數(shù)據(jù)，有帶記作1，無帶記為0，強(qiáng)帶和弱帶均賦值。利用popgene 32軟件對(duì)6對(duì)引物擴(kuò)增的等位基因數(shù)（Na）、有效等位基因數(shù)（Ne）、觀測雜合度（Ho）、期望雜合度（He）、Shannon多樣性指數(shù)（I）及多態(tài)性位點(diǎn)百分比等進(jìn)行計(jì)算；利用NTSYSpc Version 2.10e軟件計(jì)算成對(duì)種質(zhì)間Jaccord（J）遺傳相似系數(shù)，并根據(jù)遺傳相似系數(shù)，分析通過非加權(quán)配對(duì)算術(shù)平均法（UPGMA）進(jìn)行聚類分析，建立親緣關(guān)系圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 多態(tài)性分析

由葡萄的總DNA提取后進(jìn)行電泳得到其電泳圖譜，各葡萄材料與其編號(hào)關(guān)系（表1），M表示Takara公司100bp DNA ladder Marker，電泳條帶清晰。從100條引物中篩選出兩條多態(tài)性非常豐富的用于ISSR分析的ISSR引物，分別為33F（ISSR810）、37F（ISSR820），序列編號(hào)（表2）。36份葡萄材料用33F號(hào)引物擴(kuò)增，一共擴(kuò)增出208條DNA條帶，擴(kuò)增的條帶大小介于200～3000 bp，以400～1500 bp的帶條居多，平均每份材料擴(kuò)增條帶約為8條，多態(tài)性百分率高達(dá)83%，多態(tài)性豐富。其中只有‘水源5號(hào)’‘刺水14’‘水源16號(hào)’‘桂葡3號(hào)’4種葡萄材料的擴(kuò)增片段較少，其余的都非常豐富，可見該引物確實(shí)適合于葡萄遺傳多樣性的ISSR分析（圖1）。

表1 33F 擴(kuò)增葡萄材料及其編號(hào)Table 1 33F amplification of grape materials and their numbers

表2 引物編號(hào)及序列Table 2 Primer numbers and sequence

另外，還進(jìn)行了同時(shí)以37F為引物對(duì)材料進(jìn)行ISSR擴(kuò)增，一共擴(kuò)增出151條電泳條帶，這些條帶同樣介于200～3000 bp，平均條帶約為11條，多態(tài)性百分率約為79%（圖2）。

將二元矩陣數(shù)據(jù)導(dǎo)入popgene得到36份葡萄平均有效等位基因數(shù)（Ne）為1.3894，平均Nei's基因多樣性指數(shù)為0.2342，平均Shannon's信息指數(shù)為0.3529。各位點(diǎn)遺傳多樣性程度存在差異，Nei's基因多樣性指數(shù)最大值為0.4985，最小值為0.1049。Shannon's信息指數(shù)最大值為0.6916，最小值為0.2146。多態(tài)性位點(diǎn)數(shù)為24，所有引物的多態(tài)性條帶比例均為66.7%，表明所選引物遺傳多態(tài)性高，進(jìn)而表明了不同葡萄品種之間的遺傳差異。

2.2 聚類分析

由2對(duì)ISSR引物的擴(kuò)增結(jié)果，利用NTSYSpc Version2.10e軟件，根據(jù)各品種之間的相似系數(shù)，通過非加權(quán)配對(duì)算術(shù)平均法（UPGMA）進(jìn)行聚類分析[6-7]，建立親緣關(guān)系（圖3），我們發(fā)現(xiàn)在這36份品種中的遺傳相似系數(shù)在0.36～0.92，在相似度0.36處可以分為兩大類。

第一類包含9個(gè)品種分別為：‘雷司令’‘刺水14’‘黑珍珠4號(hào)’‘桂葡3號(hào)’‘水源13號(hào)’‘水源14號(hào)’‘摩爾多瓦’‘水源5號(hào)’‘水源11號(hào)’；

第二類包含27個(gè)品種，在相似度0.624處又可分為3組：第1組包括‘水源12號(hào)’‘水源4號(hào)’‘金1’‘金2’‘水源3號(hào)’‘桂葡6號(hào)’‘水源8號(hào)’‘水源1號(hào)’‘野釀2號(hào)’‘水源9號(hào)’‘水源7號(hào)’‘水源6號(hào)’‘水源2號(hào)’‘金3’‘水源16號(hào)’‘圓葉葡萄-弗雷爾’；第2組包括‘赤霞珠’‘馬瑟蘭’‘凌豐’‘媚麗’‘水晶’‘愛格麗’‘品麗珠’‘美樂’‘霞多麗’‘西拉’；第3組包括‘黑珍珠4-1號(hào)’。

3 討論與結(jié)論

ISSR標(biāo)記是葡萄種質(zhì)資源鑒定的有效方法，本文以36個(gè)品種為研究對(duì)象，利用2對(duì)ISSR引物對(duì)上述品種進(jìn)行擴(kuò)增并進(jìn)行多態(tài)性分析，33F（ISSR810）、37F（ISSR820）兩條引物的多態(tài)性較好，其中經(jīng)ISSR820 PCR擴(kuò)增得到DNA片段條帶最多，比率高達(dá)83%。

圖1 33F序列下1-36號(hào)葡萄材料擴(kuò)增電泳圖譜Figure 1 1-36 expansion electrophoresis of grape materials in the sequence of 33F

圖2 37F序列下1-36號(hào)葡萄材料擴(kuò)增電泳圖譜Figure 2 1-36 expansion electrophoresis of grape materials in the sequence of 37F

圖3 根據(jù) ISSR 結(jié)果構(gòu)建的 36 份葡萄材料親緣關(guān)系樹狀圖Figure 3 Dendrogram of 36 grape cultivars based on ISSR markers

從用途來看，除‘水晶’‘凌豐’及‘圓葉葡萄-弗雷爾’可做鮮食和釀酒兩用外，大部分材料都是釀酒葡萄，這可能與性狀連鎖有關(guān)[7]?！谡渲?-1號(hào)’是‘黑珍珠4號(hào)’雜交品種，因而遺傳相似度相差較大。本研究選擇材料‘野釀2號(hào)’‘圓葉葡萄-弗雷爾’‘刺水14’‘水晶’都是白腐病高抗品種[8]，而‘凌豐’‘雷司令’‘摩爾多瓦’對(duì)白腐病抗性表現(xiàn)一般。即本文研究的ISSR位點(diǎn)可能與某些決定葡萄葉片及果實(shí)抗病性的基因連鎖，釀酒葡萄與野生毛葡萄由于葉片氣孔大小、果皮厚度含量等性狀的不同，可以被區(qū)分開來[9-10]，如鄒瑜等2014年利用SSR分析70份毛葡萄遺傳多樣性[11]。方輝等2017年利用毛葡萄葉片高通量轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)進(jìn)行簡單重復(fù)序列搜索并注釋[12]。本試驗(yàn)中可能也是利用調(diào)控某些抗病性狀的基因與ISSR位點(diǎn)連鎖，從而將高抗品種與感病品種區(qū)分開，這有待于進(jìn)一步的研究。

通過聚類分析基本上可以從毛葡萄抗性方面實(shí)現(xiàn)對(duì)各種質(zhì)的區(qū)分，并可以有效的分析各種質(zhì)之間的親緣關(guān)系。本研究從分子水平上為葡萄種質(zhì)資源的鑒別、遺傳多樣性和親緣關(guān)系分析提供了參考價(jià)值。