朱珊珊 王蘊(yùn)龍 龐傳超

白介素-22(Interleukin，IL-22)是最近幾年新發(fā)現(xiàn)的一種CD4+Th細(xì)胞因子，由Th17和Th22為主的免疫細(xì)胞分泌產(chǎn)生，主要生物學(xué)功能為微生物防御、保護(hù)和修復(fù)組織損傷及急性期反應(yīng)，IL-22雖由這些細(xì)胞產(chǎn)生，卻不作用于它們，在皮膚主要特征性的作用于角質(zhì)形成細(xì)胞，其獨(dú)特的免疫介導(dǎo)形式使其在很多炎癥性、自身免疫性、腫瘤性皮膚病中發(fā)揮重要作用。扁平苔蘚是一種臨床上比較常見(jiàn)的累及皮膚黏膜的瘙癢性慢性炎癥性疾病，病因尚未完全明確，可能是由遺傳、感染、藥物、自身免疫、慢性病灶、精神神經(jīng)、內(nèi)分泌與代謝障礙等相互作用導(dǎo)致的[1]，多數(shù)支持多因素影響的T細(xì)胞介導(dǎo)的針對(duì)基底細(xì)胞的免疫反應(yīng)。目前關(guān)于IL-22在扁平苔蘚中的作用研究較少，本文研究IL-22在扁平苔蘚皮損中的表達(dá)，并以正常皮膚作為對(duì)照，以探討其在疾病中的可能意義，為扁平苔蘚的診斷和治療開(kāi)辟新的思路。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象 實(shí)驗(yàn)組30例：為2016年1～11月在吉林大學(xué)第二醫(yī)院皮膚科經(jīng)臨床和病理檢查確診為扁平苔蘚患者的病變皮膚，其中男18例，女12例，年齡為19～63歲，平均年齡(42.3±8.4)歲。所有實(shí)驗(yàn)組病變的特點(diǎn)是具有相似程度的炎癥反應(yīng)，且無(wú)本病以外的糖尿病、高血壓、感染性和過(guò)敏性疾病或其他自身免疫性疾病，如銀屑病、類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、紅斑狼瘡等，且近3個(gè)月未系統(tǒng)或局部應(yīng)用免疫抑制劑、糖皮質(zhì)激素、抗生素等藥物。對(duì)照組10例為2016年1～11月在吉林大學(xué)第二醫(yī)院皮膚外科手術(shù)切除的正常皮膚，其中男5例，女5例，年齡為22～66歲，平均年齡(45.6±7.3)歲。所有對(duì)照組均無(wú)免疫系統(tǒng)疾病，無(wú)皮膚感染，兩組對(duì)象年齡、性別相匹配。

1.2 主要試劑 兔抗人IL-22多克隆抗體、兔抗體免疫組化試劑盒、DAB顯色液均來(lái)自北京欣博盛生物科技有限公司。檸檬酸鈉抗原修復(fù)液來(lái)自碧云天生物科技有限公司。

1.3 免疫組化檢測(cè) 將切除的組織標(biāo)本放入4%甲醛溶液中固定，石蠟包埋備用，將包埋的組織切片4 μM厚度，用于HE和免疫組化染色觀察。免疫組化染色(SABC法)按照欣博盛提供的兔抗體免疫組化試劑盒的說(shuō)明進(jìn)行，遵循每批染色以已知陽(yáng)性切片作為陽(yáng)性對(duì)照，以PBS代替一抗作為空白對(duì)照。

1.4 結(jié)果判定 以細(xì)胞質(zhì)中棕黃色顆粒狀染色為陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)，由2位具有獨(dú)立判斷能力的醫(yī)師采用雙盲法對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行判定。在光鏡下計(jì)數(shù)，40×10倍視野下，于每個(gè)組織片內(nèi)隨機(jī)選取5個(gè)視野，用5 mm×5 mm網(wǎng)格目鏡微尺分別計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)及觀察的細(xì)胞總數(shù)，取其平均值，計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)占細(xì)胞總數(shù)的百分率，根據(jù)染色強(qiáng)度以及著色范圍進(jìn)行半定量評(píng)分，結(jié)果分析方法根據(jù)Shimizu[2]法改良而成。染色強(qiáng)度用0～3級(jí)評(píng)分:0分為無(wú)染色，1分為輕度染色，2分為中度染色，3分為強(qiáng)染色；著色范圍采用陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)占細(xì)胞總數(shù)的百分率計(jì)分，用0～3級(jí)評(píng)分：<20%為0分，20%～50%為1分，51%～75%為2分，>75%為3分。以上兩項(xiàng)相加為著色程度積分，表示IL-22在皮損中的表達(dá)強(qiáng)弱，結(jié)果:0、1分為陰性(-)；2分為弱陽(yáng)性(+)；3～4分為陽(yáng)性(++)；5～6分為強(qiáng)陽(yáng)性(+++)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件處理數(shù)據(jù)，采用兩等級(jí)資料比較的Mann-Whitney U秩和檢驗(yàn)進(jìn)行相關(guān)分析，結(jié)果以P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，P<0.01為有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 HE染色結(jié)果 見(jiàn)圖1。

2.2 免疫組化染色結(jié)果 見(jiàn)圖2、3，表1。在30例實(shí)驗(yàn)組中，IL-22主要表達(dá)于扁平苔蘚表皮全層的角質(zhì)形成細(xì)胞和真皮淺層浸潤(rùn)的淋巴細(xì)胞胞質(zhì)中，呈棕黃色顆粒。其中16例為強(qiáng)陽(yáng)性，8例為陽(yáng)性，4例為弱陽(yáng)性，2例為陰性。在10例對(duì)照組中，IL-22也表達(dá)于正常皮膚組織，主要定位于基底層附近的角質(zhì)形成細(xì)胞中，呈淡黃色顆粒。其中1例為強(qiáng)陽(yáng)性，2例為陽(yáng)性，4例為弱陽(yáng)性，3例為陰性。由表1可看出，IL-22在扁平苔蘚皮損中的表達(dá)水平明顯高于在正常皮膚組織中的表達(dá)水平，二者差異經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

圖1 a:表皮角化過(guò)度，顆粒層楔形增厚，棘層不規(guī)則增厚;b:基底細(xì)胞液化變性，真皮淺層致密淋巴細(xì)胞帶狀浸潤(rùn)(a HE，×100；b HE，×200)

圖2 IL-22在扁平苔蘚中的表達(dá)(2a,2c SABC，×100；2b,2d SABC，×400)

圖3 IL-22在正常皮膚中的表達(dá)(3a SABC×100；3b SABC×400)

表1 IL-22在扁平苔蘚和正常皮膚組織中的表達(dá)

注：采用Mann-Whitney U test，P<0.01為有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)差異

3 討論

扁平苔蘚是一種臨床上比較常見(jiàn)的特發(fā)性炎癥性疾病，占皮膚科所有就診患者的0.5%以上[3]，皮損部位不一，可同時(shí)或先后累及一個(gè)或多個(gè)區(qū)域，皮膚和口腔黏膜是最常受累的部位。目前認(rèn)為免疫機(jī)制和角質(zhì)形成細(xì)胞障礙活化介導(dǎo)了扁平苔蘚的發(fā)生，但確切的發(fā)病機(jī)制尚不清楚，IL-22是一種新型細(xì)胞因子，它在外周組織損傷期間介導(dǎo)著免疫細(xì)胞向上皮細(xì)胞間信號(hào)的傳遞，引起上皮細(xì)胞產(chǎn)生抗菌蛋白和炎癥介質(zhì)。IL-22具有兩種結(jié)合受體--膜性受體(IL-22R)和可溶性受體(IL-22RA2)，膜性受體是由IL-22R1與IL-10R2構(gòu)成的異源二聚體受體復(fù)合物，因細(xì)胞因子對(duì)IL-22R1具有很高的親和力，該受體的表達(dá)也決定了組織細(xì)胞對(duì)IL-22的反應(yīng)性。IL-22R1的分布具有一定的組織特異性，主要表達(dá)于皮膚、腎臟、胰腺、肺臟等的實(shí)質(zhì)細(xì)胞，特別是在角質(zhì)形成細(xì)胞和胰腺，而在NK和單核等免疫細(xì)胞中不表達(dá)[4]。IL-22RA2是一種天然的蛋白性抑制劑，能競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合IL-22并阻斷其生物學(xué)活性[5]，進(jìn)而干預(yù)細(xì)胞因子下游的信號(hào)傳導(dǎo)。IL-22作用于角質(zhì)形成細(xì)胞，誘導(dǎo)其產(chǎn)生抗炎因子或保護(hù)蛋白，如IL-11、卵泡抑素、β-防御素、鈣結(jié)合蛋白A7、A8、A9等，重塑傷口愈合，發(fā)揮固有防御機(jī)制，防止皮膚感染。另外，IL-22可以下調(diào)終末期角質(zhì)形成細(xì)胞分化基因，抑制其分化產(chǎn)物的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞增殖，提高細(xì)胞向遠(yuǎn)處遷移的能力[6]。除此之外，IL-22還能誘導(dǎo)多種炎癥介質(zhì)的表達(dá)，即IL-6和趨化因子(CCL7、CXCL1、CXCL2、CXCL3、CXCL6和CXCL8)[7]，誘導(dǎo)皮膚顯著增生和炎癥反應(yīng)。目前人類(lèi)中IL-22主要由活化的Th22、Th1、Th17細(xì)胞產(chǎn)生[8]，這些細(xì)胞已被證實(shí)在感染性、免疫性疾病的發(fā)生發(fā)展中均發(fā)揮著廣泛的生物活性，提示IL-22升高存在于T細(xì)胞介導(dǎo)的慢性炎癥性疾病如銀屑病、扁平苔蘚中。本文試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在扁平苔蘚皮損部位，IL-22表達(dá)水平較正常人皮膚明顯增高(P<0.01)，提示IL-22參與了扁平苔蘚皮損的形成。

既往的研究表明，扁平苔蘚的特征在于針對(duì)上皮細(xì)胞的T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答，引起表皮細(xì)胞損傷和真皮淺層T淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，產(chǎn)生其特征性的的病理改變和臨床表現(xiàn)。與扁平苔蘚發(fā)病機(jī)制相關(guān)的細(xì)胞主要有CD4+T、CD8+T、樹(shù)突狀細(xì)胞、角質(zhì)形成細(xì)胞，其中效應(yīng)性CD4+T細(xì)胞即輔助性T細(xì)胞及其分泌的細(xì)胞因子參與了扁平苔蘚發(fā)病的各個(gè)方面。IL-22在扁平苔蘚皮損中表達(dá)明顯增多，同樣提示Th17、Th22細(xì)胞免疫參與其致病過(guò)程，這與以往的報(bào)道一致。當(dāng)皮膚收到各種因素刺激時(shí)，CD4+T細(xì)胞激活，CD8+T細(xì)胞活化，將被處理過(guò)的內(nèi)源性或外源性抗原信息呈遞給T細(xì)胞，釋放TNF-α、IL-22等因子。我們大膽的猜測(cè)，IL-22與受體結(jié)合后，誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)多種信號(hào)激活，進(jìn)一步活化下游信號(hào)傳導(dǎo)通路，包括JAK/STAT通路(Jak1、Tyk2、STAT3)和MAPK通路(p38MAPK、JNK、EPKl/2)，啟動(dòng)下游靶基因的表達(dá)，促進(jìn)角質(zhì)形成細(xì)胞增殖、抑制其凋亡和分化，誘導(dǎo)其產(chǎn)生調(diào)節(jié)防御機(jī)制的細(xì)胞因子、抗微生物肽，加強(qiáng)皮膚防御功能。過(guò)度表達(dá)的IL-22可能需要達(dá)到一個(gè)閾值才能引起炎癥反應(yīng)，使激活的STAT3持續(xù)磷酸化，表達(dá)一系列基因產(chǎn)物，如Caspases、bcl-2、生存素、p53、p63，分泌血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子等，Caspases、bcl-2、p53均為細(xì)胞凋亡標(biāo)志物，激活后引起細(xì)胞凋亡，即出現(xiàn)凋亡小體，導(dǎo)致同時(shí)基底細(xì)胞液化變性，淋巴細(xì)胞凋亡缺失或減弱，可能也是炎癥細(xì)胞持續(xù)浸潤(rùn)的一個(gè)原因[9]。除此之外，通過(guò)MAPK途徑激活的p38參與激活促炎分子、趨化因子如TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8等表達(dá)，亦可與TNF-α協(xié)同作用促進(jìn)CSF、IL-8的釋放，誘導(dǎo)炎性細(xì)胞向炎癥部位游走，放大炎癥效應(yīng)，形成真皮淺層T細(xì)胞帶狀浸潤(rùn)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡與基底細(xì)胞液化變性。浸潤(rùn)細(xì)胞繼續(xù)分泌TNF-α、IL-TIF等細(xì)胞因子，致使病情反復(fù)，病程延長(zhǎng)。那么當(dāng)IL-22在皮損區(qū)異常表達(dá)時(shí)也就可能造成扁平苔蘚特征性皮損和病理改變。本研究發(fā)現(xiàn)，在大多數(shù)正常表皮中也有IL-22的表達(dá)，且多位于表皮基底層，考慮可能與IL-22的正向作用相關(guān)，適量表達(dá)的IL-22可以下調(diào)終末期角質(zhì)形成細(xì)胞分化基因，促進(jìn)正常表皮中細(xì)胞增殖、分化，而當(dāng)其過(guò)量表達(dá)時(shí)則造成皮膚顯著增生和炎癥反應(yīng)等現(xiàn)象。IL-22在不同疾病、不同組織中扮演雙刃劍的角色，考慮可能與該細(xì)胞因子的數(shù)量、持續(xù)時(shí)間、所處環(huán)境及浸潤(rùn)的炎性細(xì)胞種類(lèi)等因素有關(guān)。

近年來(lái)，越來(lái)越多的學(xué)者開(kāi)始研究IL-22在扁平苔蘚發(fā)病機(jī)制中的作用，但目前這些研究還不成熟，僅是初步的。Domingues等[10]對(duì)外周血單核細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)時(shí)發(fā)現(xiàn)，CD8+T細(xì)胞通過(guò)激活TLR7/8或SEB引起IL-22+T細(xì)胞(TC22、Th22細(xì)胞)數(shù)量頻繁增加，并能在LP患者中檢測(cè)到，這些增加可能導(dǎo)致IL-22分泌T細(xì)胞向皮膚或黏膜炎癥部位遷移。本次研究主要選取的對(duì)象是皮膚型扁平苔蘚皮損，目前國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)白介素在扁平苔蘚中的研究多集中于口腔型，Shen等[11]通過(guò)RT-qPCR和Western blot分析檢測(cè)IL-22和靶向微小RNA的表達(dá)時(shí)進(jìn)一步證實(shí)IL-22在口腔扁平苔蘚中高表達(dá)。而Chen等[12]、Weber等[13]研究時(shí)發(fā)現(xiàn)IL-22在口腔扁平苔蘚的表達(dá)高于皮膚型，有明顯的特異性。

扁平苔蘚皮損中T細(xì)胞的異?；罨捌渌a(chǎn)生的多種細(xì)胞因子的異常表達(dá)引發(fā)了疾病的發(fā)生，但機(jī)體通過(guò)釋放更多的因子來(lái)調(diào)節(jié)自身的免疫平衡。在本研究中，我們探討了IL-22在扁平苔蘚中的表達(dá)情況，結(jié)果提示IL-22在疾病發(fā)病中可能具有一定作用。本研究并未證實(shí)IL-22的表達(dá)與疾病嚴(yán)重程度是否呈相關(guān)性，需要血清學(xué)檢查及跟蹤患者預(yù)后等進(jìn)一步觀察研究。此外，扁平苔蘚的發(fā)病過(guò)程受多因素影響，我們的實(shí)驗(yàn)在取材和研究方法等諸多方面存在一定局限性，希望經(jīng)過(guò)我們的研究為深入揭示扁平苔蘚發(fā)病機(jī)制提供理論依據(jù)，為疾病的治療及預(yù)后提供新的靶點(diǎn)。