杜一峰 鄭 浩 劉 進(jìn) 李 藝 雷 萍 侯殿東

特應(yīng)性皮炎(atopic dermatitis，AD)是一種常見(jiàn)的慢性復(fù)發(fā)性炎癥性皮膚病。近30年來(lái)AD的發(fā)病率在全球呈明顯上升趨勢(shì)，在發(fā)達(dá)國(guó)家可累及10%～20%的兒童及1%～3%的成人，污染嚴(yán)重的國(guó)家尤為明顯[1]。近年來(lái)隨著我國(guó)城市化，工業(yè)化進(jìn)程的加速，環(huán)境污染日益加重，AD在我國(guó)的發(fā)病率亦呈現(xiàn)快速上升趨勢(shì)[2]。局部外用糖皮質(zhì)激素，并配合應(yīng)用潤(rùn)膚保濕劑是目前AD的一線療法，但長(zhǎng)期應(yīng)用糖皮質(zhì)激素副作用大，患者不易耐受[3,4]。AD作為嚴(yán)重影響人類健康，尤其是兒童身心健康發(fā)展的疾病，日益受到世界各國(guó)的廣泛關(guān)注。因此，尋找有效的治療方法具有重要的公共衛(wèi)生意義。灰樹(shù)花(Grifola frondosa)屬擔(dān)子菌綱多孔菌科，是一種藥食兩用珍稀食用菌，其含有眾多活性物質(zhì)，灰樹(shù)花多糖(Grifola frondosa Polysaccharide, GFP)是灰樹(shù)花最主要的一類活性成分[5]。已有研究表明，GFP可明顯抑制AD小鼠皮損部位的炎癥反應(yīng)，并且對(duì)Th1/Th2平衡也具有調(diào)節(jié)作用[6]，但其進(jìn)一步機(jī)制并不明確。本實(shí)驗(yàn)采用TNF-α與IFN-γ誘導(dǎo)活化的HaCaT細(xì)胞為AD體外模型，通過(guò)研究GFP對(duì)TNF-α/IFN-γ誘導(dǎo)的HaCaT細(xì)胞炎癥因子產(chǎn)生的影響及對(duì)NF-κB信號(hào)通路的影響，深入揭示GFP對(duì)AD炎癥抑制的作用機(jī)制，為GFP治療AD提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 GFP(純度>70%)購(gòu)自南京廣潤(rùn)生物制品有限公司，DMEM高糖培養(yǎng)基購(gòu)自GIBCO公司，胎牛血清購(gòu)自HyClone公司，TNF-α和IFN-γ均購(gòu)自Sigma公司，RNA提取、逆轉(zhuǎn)錄、qPCR擴(kuò)增試劑盒及引物均購(gòu)自Promega公司，TARC、MDC ELISA檢測(cè)試劑盒購(gòu)自武漢華美生物工程有限公司，anti-NF-κB、anti-磷酸化(p)-NF-κB 蘇州睿瀛生物技術(shù)有限公司，HRP標(biāo)記羊抗兔IgG Proteintech，ECL發(fā)光試劑盒Pierce公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)人角質(zhì)形成細(xì)胞系(HaCaT細(xì)胞) 購(gòu)自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司。該細(xì)胞系用含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基在37℃，5% CO2條件下恒溫貼壁培養(yǎng)。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)共分5組 A組為正常對(duì)照組，B組為TNF-α/IFN-γ活化組，C、D、E組分別為GFP低、中、高劑量干預(yù)組。將HaCaT細(xì)胞接種于六孔板中，106/孔， 37℃、5% CO2條件下過(guò)夜培養(yǎng)，細(xì)胞貼壁后，棄培養(yǎng)基，PBS清洗2次，加入不含血清DMEM培養(yǎng)基2 mL，TNF-α/IFN-γ活化組和GFP干預(yù)組細(xì)胞加入IFN-γ和TNF-α，終濃度均為10 ng/mL ，對(duì)照組加入等量PBS。GFP干預(yù)組細(xì)胞加入不同濃度的GFP工作液(GFP溶于PBS)，使其終濃度分別為0.2 mg/mL、0.4 mg/mL和0.8 mg/mL。對(duì)照組和模型組加入等量PBS，37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)24 h后收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液和細(xì)胞。

1.2.3 qPCR法檢測(cè)TARC、MDC、IL-6 和TNF-α mRNA表達(dá)Trizol法提取總RNA后參照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，然后進(jìn)行qPCR。引物序列見(jiàn)表1。qPCR方法如下：以1 μL cDNA為模板，GAPDH為內(nèi)參，采用ABI 7500 Real time PCR系統(tǒng)進(jìn)行擴(kuò)增。PCR反應(yīng)條件：變性95℃、30 s；變性95℃、5 s，退火延伸60℃、30 s，40個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣品做3個(gè)復(fù)孔，反應(yīng)結(jié)束后確認(rèn)擴(kuò)增曲線及熔解曲線，取Ct值的平均值，再用公式2-ΔΔCt計(jì)算各基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.4 ELISA檢測(cè)TARC和MDC分離細(xì)胞培養(yǎng)上清液，80℃保存待測(cè)。按試劑盒說(shuō)明書(shū)操作檢測(cè)其含量。

1.2.5 NF-κB和p-NF-κB蛋白表達(dá)的檢測(cè)細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞，超聲處理10 s，12000×g離心5 min，取上清液BCA法檢測(cè)蛋白濃度。取25 μg蛋白經(jīng)10%SDS PAGE電泳分離蛋白，將目的蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素濾膜上，在5%脫脂奶粉的封閉液中室溫下封閉2 h，分別加入NF-κB和p-NF-κB一抗4℃過(guò)夜，洗膜后，加入二抗，37℃，l h。ECL發(fā)光，信號(hào)在圖像分析系統(tǒng)中進(jìn)行吸光度掃描。以β-actin作為內(nèi)參，獲得蛋白相對(duì)量。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 以上檢測(cè)每一濃度的藥物設(shè)3個(gè)平行復(fù)孔，重復(fù)實(shí)驗(yàn)三次。所得實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，各組間均數(shù)比較采用一維方差分析(one-way ANOVA)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

表1 qPCR引物序列

2 結(jié)果

2.1 GFP對(duì)TNF-α/IFN-γ誘導(dǎo)的HaCaT細(xì)胞TARC、MDC、IL-6 和TNF-α mRNA表達(dá)的影響從圖1可見(jiàn)，與正常對(duì)照組細(xì)胞相比，TNF-α和IFN-γ可顯著上調(diào)HaCaT細(xì)胞TARC、MDC、IL-6 和TNF-α mRNA的表達(dá)；與TNF-α/IFN-γ誘導(dǎo)的HaCaT細(xì)胞相比，GFP可顯著下調(diào)TARC、MDC、IL-6和TNF-α mRNA的表達(dá)。

2.2 GFP對(duì)TNF-α/IFN-γ誘導(dǎo)的HaCaT細(xì)胞TARC、MDC表達(dá)的影響從圖2可見(jiàn)，與正常對(duì)照組細(xì)胞相比，TNF-α和IFN-γ可顯著促進(jìn)HaCaT細(xì)胞TARC和MDC的表達(dá)；與TNF-α/IFN-γ誘導(dǎo)的HaCaT細(xì)胞相比，GFP可顯著抑制TARC和MDC的表達(dá)。

2.3 GFP對(duì)TNF-α/IFN-γ誘導(dǎo)的HaCaT細(xì)胞NF-κB和p-NF-κB表達(dá)的影響從圖3可見(jiàn)，與正常對(duì)照組細(xì)胞相比，TNF-α和IFN-γ及GFP對(duì)NF-κB表達(dá)無(wú)明顯影響。與正常對(duì)照組細(xì)胞相比，TNF-α和IFN-γ可顯著上調(diào)HaCaT細(xì)胞p-NF-κB的表達(dá)；與TNF-α/IFN-γ誘導(dǎo)的HaCaT細(xì)胞相比，GFP可顯著下調(diào)p-NF-κB的表達(dá)。

a：IL-6;b：MDC；c：TARC；d：TNF-α。**：與對(duì)照組相比，P<0.01；##與TNF-α/IFN-γ誘導(dǎo)細(xì)胞相比，P<0.01；#與TNF-α/IFN-γ誘導(dǎo)細(xì)胞相比，P<0.05

a：MDC;b：TARC。**：與對(duì)照組相比，P<0.01；##與TNF-α/IFN-γ誘導(dǎo)細(xì)胞相比，P<0.01

**：與對(duì)照組相比，P<0.01；##與TNF-α/IFN-γ誘導(dǎo)細(xì)胞相比，P<0.01

3 討論

本研究采用INF-γ和TNF-α刺激HaCaT細(xì)胞以制備細(xì)胞炎癥模型，在此基礎(chǔ)上加入GFP干預(yù)，研究GFP的抗炎作用及機(jī)制。結(jié)果表明，GFP對(duì)TNF-α/IFN-γ誘導(dǎo)的HaCaT細(xì)胞胸腺活化調(diào)節(jié)趨化因子(thymus and activation regulated chemokine, TARC/CCL17)和巨噬細(xì)胞源趨化因子(macrophage derived chemokine，MDC/CCL22)、IL-6和TNF-α mRNA及TARC、MDC蛋白的表達(dá)均有明顯抑制作用(P<0.05)。

在AD發(fā)病過(guò)程中，Th2細(xì)胞過(guò)度活化，分泌大量Th2型細(xì)胞因子[7]。過(guò)度表達(dá)的Th2型細(xì)胞因子使AD患者表皮絲聚合蛋白(filaggrin,FLG)表達(dá)下降[8]。FLG的減少和缺失，可能是引起AD等干燥性皮膚病的主要原因[9]。因此，拮抗Th2型細(xì)胞因子、調(diào)節(jié)Th1/Th2平衡是修復(fù)皮膚屏障功能的策略之一。TARC和MDC為Th2細(xì)胞的趨化因子，二者均可與Th2細(xì)胞表面CCR4結(jié)合，將Th2細(xì)胞募集至炎癥部位[10]。AD患者血清TARC和MDC水平顯著升高，這兩個(gè)指標(biāo)與疾病嚴(yán)重程度密切相關(guān)[11]。IL-6屬于Th2型細(xì)胞因子，作為前炎癥細(xì)胞因子，IL-6在炎癥反應(yīng)過(guò)程中起著重要的作用[12]。AD患者血清IL-6水平較正常人明顯升高[13]。AD患者體內(nèi)Th2細(xì)胞不但能夠產(chǎn)生經(jīng)典的Th2細(xì)胞因子IL-4、IL-5和IL-13，還可產(chǎn)生TNF-α，形成“炎癥性Th2”反應(yīng)[14]。

研究表明AD皮損部位TARC、MDC等Th2型細(xì)胞因子的產(chǎn)生與NF-κB信號(hào)途徑有關(guān)[15]。核因子κB(nuclear factor -kappa B, NF-κB)可以被多種刺激劑，如TNF-α等激活。激活的NF-κB與IκB解離后轉(zhuǎn)位入核與靶基因啟動(dòng)子/增強(qiáng)子上的κB位點(diǎn)結(jié)合，從而調(diào)節(jié)許多靶基因的表達(dá)[16]。結(jié)果表明與TNF-α/IFN-γ誘導(dǎo)的HaCaT細(xì)胞相比，GFP可顯著下調(diào)p-NF-κB的表達(dá)。這表明GFP的抗炎作用可能與其抑制NF-κB P65信號(hào)通路的活化有關(guān)。

本研究結(jié)果表明GFP具有明顯的抗炎作用，其機(jī)制可能與調(diào)節(jié)NF-κB P65信號(hào)通路有關(guān)。通過(guò)研究GFP對(duì)在炎癥性皮膚病中的作用機(jī)制，可以為GFP在臨床中應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。