張富勇，蘇 建，劉 陽(yáng)，安明哲

（四川宜賓五糧液股份有限公司，四川宜賓644000）

濃香型白酒生產(chǎn)過(guò)程中，入窖發(fā)酵糟醅的含水量為52%～55%，隨著發(fā)酵的進(jìn)行，糟醅中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)在微生物和酶的作用下分解轉(zhuǎn)化，生成的水與糟醅中原有的水分沉積、匯聚于窖池底部，發(fā)酵結(jié)束后起糟操作時(shí)，通過(guò)打坑、開(kāi)槽將水分滲出，采用泵或者人工舀出，此類(lèi)液體一般呈黃褐色，生產(chǎn)上稱(chēng)為黃水。黃水中通常含有1%～2%的殘余淀粉，0.3%～0.7%的殘?zhí)牵?%～5%的乙醇，以及有機(jī)酸、白酒香味成分及前體物質(zhì)等，具有較高的利用價(jià)值[1]。

目前對(duì)黃水的研究大多局限在呈香呈味物質(zhì)的提取利用，尚未有對(duì)黃水抗氧化活性及相關(guān)物質(zhì)的報(bào)道。眾所周知，國(guó)內(nèi)外對(duì)葡萄酒、黃酒和啤酒的抗氧化活性及功能性物質(zhì)的研究常有報(bào)道。目前國(guó)內(nèi)對(duì)白酒的抗氧化活性及健康因子的研究日益趨熱，但因白酒屬于蒸餾酒，蒸餾導(dǎo)致白酒抗氧化活性較低、白酒中抗氧化物質(zhì)含量較少[2]。本研究通過(guò)利用DPPH自由基清除法及總抗氧化測(cè)定對(duì)黃水的抗氧化活性進(jìn)行測(cè)定，對(duì)初步分離得到的黃水粗多糖及黃水清液進(jìn)行抗氧化活性測(cè)定，探索黃水抗氧化活性的分布。為今后進(jìn)一步資源化利用黃水中的抗氧化活性物質(zhì)提供思路。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

黃水、濃香型白酒，五糧液酒廠(chǎng)；黃酒，紹興產(chǎn)黃酒；沒(méi)食子酸、維生素C，國(guó)藥集團(tuán)；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、Folin-酚試劑，美國(guó)sigma公司。

離心機(jī)5810R、分光光度計(jì)，美國(guó)Eppendorf公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化廠(chǎng)；冷凍干燥儀，德國(guó)德蒙christ冷凍干燥機(jī)。

1.2 方法

1.2.1 黃水DPPH自由基清除能力的測(cè)定

參照沈赤等[3]的方法，配制0.1 mmol/L的DPPH自由基溶液、1 g/L的維生素C、沒(méi)食子酸溶液，避光4℃保存，現(xiàn)配現(xiàn)用?？瞻妆壬苤屑尤? mL超純水，100 μL待測(cè)樣品，混勻。最后向上述體系中準(zhǔn)確加入2 mL DPPH自由基溶液，充分混勻。于室溫避光靜置30 min后，在517 nm處測(cè)定吸光值變化。用1 g/L沒(méi)食子酸和維生素C作為陽(yáng)性對(duì)照，白酒和黃酒作為參照。按下式計(jì)算清除率：清除率（%）=（1-A1/A0）×100 ；其中：A1為待測(cè)樣存在時(shí)的吸光度；A0為對(duì)照樣的吸光度。

1.2.2 黃水總抗氧化能力的測(cè)定

參照王曉宇等[4]使用的亞油酸體系，準(zhǔn)確量取2.5 mL K3PO4緩沖液（0.04 mol/L，pH7.0）和2.5 mL亞油酸乳狀液于5 mL比色管中，混勻。向上述體系中加入200 μL待測(cè)樣，充分混勻。將混合反應(yīng)液放入37℃培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)，每12 h取樣100 μL，共取5次。用硫氰酸鹽法檢測(cè)反應(yīng)體系的氧化程度。檢測(cè)方法：取樣品溶液100 μL加入到4.7 mL乙醇（75%vol）中，然后加入100 μL硫氰酸銨（30%）和100 μL FeCl2（濃度為20 mmol/L，溶于3.5%HCl中）混勻，在500 nm處測(cè)定吸光值變化。用2.5 mL的K3PO4緩沖液與2.5 mL的亞油酸乳狀液混合作空白對(duì)照，用1 g/L Vc、沒(méi)食子酸作為陽(yáng)性對(duì)照，用白酒和黃酒作為參照。

按下式計(jì)算氧化抑制百分率：氧化抑制率（%）=（1-A1/A0）×100；其中：A1為待測(cè)酒樣存在時(shí)的吸光度；A0為對(duì)照樣的吸光度。

1.2.3 黃水粗多糖的制備及抗氧化活性測(cè)定

黃水粗多糖的制備參照紹興黃酒多糖提取的方法[5]并進(jìn)行改進(jìn)，取400 mL新鮮黃水進(jìn)行減壓濃縮、濃縮至100 mL（即濃縮比為4.0），乙醇濃度為80%vol、醇沉?xí)r間為24 h、醇沉溫度為4℃，離心收集多糖，將收集得到的粗多糖進(jìn)行凍干，計(jì)算黃水粗多糖得率；將得到的黃水粗多糖用去離子水還原至400 mL，并測(cè)定其DPPH自由基清除能力及總抗氧化能力。

1.2.4 黃水除多糖后清液（醇沉液）的抗氧化活性及總酚測(cè)定

對(duì)醇沉離心后所得的上清液進(jìn)行減壓濃縮、揮發(fā)去除用于醇沉的乙醇，將上清液體積控制在100 mL左右，并用去離子水還原至黃水原體積（400 mL）即為黃水清液，測(cè)定其DPPH自由基清除能力及總抗氧化能力，同時(shí)測(cè)定黃水清液中總酚的含量，總酚測(cè)定采用Folin-Ciocalteu法測(cè)定[6]。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃水DPPH自由基清除能力

DPPH自由基是一種以氮為中心的有機(jī)自由基，其性質(zhì)穩(wěn)定、呈深紫色，在517 nm處的吸收較強(qiáng)。當(dāng)抗氧化物質(zhì)提供的電子與DPPH電子配對(duì)時(shí)，溶液顏色變淺，517 nm處的吸收消失，反映了自由基被清除的情況，其褪色程度與其所接受的電子數(shù)成定量關(guān)系。因此，可以較迅速地評(píng)價(jià)物質(zhì)的抗氧化能力。測(cè)定結(jié)果如圖1所示：在相同條件下，100 μL Vc、沒(méi)食子酸、白酒、黃酒和黃水對(duì)DPPH的清除率分別是65.4%、78.0%、9.2%、43.7%、55.7%。結(jié)果表明，黃水的DPPH自由基清除能力較強(qiáng)甚至強(qiáng)于黃酒，但白酒的DPPH自由基清除能力較弱。這與文獻(xiàn)報(bào)道的DPPH自由基清除率為“啤酒＞葡萄酒＞黃酒＞白酒”基本一致[7]。

2.2 總抗氧化能力

總抗氧化能力是通過(guò)樣品對(duì)亞油酸的自氧化作用的抑制來(lái)測(cè)定的。在亞油酸的自氧化過(guò)程中，會(huì)產(chǎn)生過(guò)氧化物。這些過(guò)氧化物會(huì)將Fe2+氧化為Fe3+，F(xiàn)e3+與SCN-形成絡(luò)合物，于500 nm處有最大吸光值。因此，吸光值越高，表明亞油酸自氧化的程度越高。加入待測(cè)樣品后，通過(guò)硫氰酸鹽法測(cè)定的亞油酸自氧化程度的吸光值。測(cè)定結(jié)果如圖2所示：100 μL Vc、沒(méi)食子酸、白酒、黃酒和黃水，反應(yīng)時(shí)間為60 h時(shí)，氧化抑制率分別為76.7%、90.1%、10.3%、45.6%、63.8%。結(jié)果表明，亞油酸體系測(cè)定的上述樣品氧化抑制率普遍高于DPPH自由基清除率，且氧化抑制率強(qiáng)弱程度與DPPH自由基清除率相一致。同時(shí)表現(xiàn)出黃水的抗氧化能力較強(qiáng)，甚至強(qiáng)于黃酒，明顯高于白酒，也與現(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)的黃酒氧化抑制率[8]為60%～99%相一致。

圖1 黃水及參照物的DPPH自由基清除率

圖2 黃水及參照物的總抗氧化力

2.3 黃水粗多糖的制備及抗氧化活性測(cè)定

參照紹興黃酒多糖提取的方法并進(jìn)行改進(jìn)：濃縮比為4.0，乙醇濃度為80%vol、醇沉?xí)r間為24 h、醇沉溫度為4℃，離心收集多糖，400 mL新鮮黃水經(jīng)醇沉提取、冷凍干燥后得到1.64 g黃水粗多糖，得率為0.41%。將凍干的黃水粗多糖用去離子水再溶至400 mL后測(cè)得的抗氧化能力如圖3所示：黃水粗多糖的DPPH自由基清除率為18.1%、氧化抑制率為31.3%，這說(shuō)明經(jīng)過(guò)醇沉得到的黃水粗多糖在功能上類(lèi)似于植物多糖，但抗氧化能力仍略低于文獻(xiàn)報(bào)道的紹興黃酒多糖200 mg/L的53%氧化抑制率。可以在后續(xù)的試驗(yàn)中對(duì)黃水粗多糖進(jìn)行濃縮、精制，進(jìn)一步研究提升黃水多糖的抗氧化功效。

圖3 黃水粗多糖抗氧化能力

2.4 黃水除多糖后清液（醇沉液）的抗氧化活性及總酚測(cè)定

對(duì)醇沉離心后所得的上清液進(jìn)行減壓濃縮、揮發(fā)除去加入的乙醇，將上清液體積控制在100 mL左右，并還原至黃水體積（400 mL）制備成黃水清液，測(cè)定其DPPH自由基清除能力及總抗氧化能力，結(jié)果見(jiàn)圖4。黃水清液的DPPH自由基清除率達(dá)到31%、氧化抑制率為38.9%，較高于黃水粗多糖，具有較為明顯的抗氧化能力。同時(shí)采用Folin-Ciocalteu法測(cè)定清液中總酚的含量為480 mg/L，接近于相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道的黃酒總酚含量400～900 mg/L，進(jìn)一步印證了黃水清液的抗氧化能力。

圖4 黃水清液抗氧化能力

2.5 黃水抗氧化能力的分布

通過(guò)減壓濃縮、醇沉多糖等操作將新鮮黃水分離成黃水粗多糖和黃水清液兩個(gè)組分，分別對(duì)兩個(gè)組分進(jìn)行再溶、還原至原黃水體積以便更為直觀(guān)的與原黃水對(duì)比，兩組分與黃水的DPPH自由基清除效果及總抗氧化能力如圖5所示。黃水的抗氧化活性在黃水粗多糖及黃水清液中均有分布和體現(xiàn)，但主要分布于黃水清液中。造成黃水抗氧化活性分布特性原因主要與白酒的生產(chǎn)方式有關(guān)，白酒生產(chǎn)一般采用以單糧或多糧為原料，利用酒曲中的多種微生物共同作用，經(jīng)陳年泥窖長(zhǎng)期發(fā)酵而成。原料中未被利用的多糖、維生素類(lèi)、酚類(lèi)等化合物以及長(zhǎng)期缺氧發(fā)酵代謝過(guò)程中產(chǎn)生的微生物多糖、還原性物質(zhì)等，這些物質(zhì)依附于糟醅進(jìn)入水相環(huán)境，由于不易揮發(fā)從而被保留在黃水中。實(shí)驗(yàn)中測(cè)定的黃水粗多糖及總酚可以說(shuō)明黃水的抗氧化能力，但是其他存在于黃水中的抗氧化物質(zhì)，如氨基酸、小分子肽類(lèi)、烯萜類(lèi)也有可能具有抗氧化作用，具體成分尚待進(jìn)一步研究，為拓寬白酒抗氧化活性物質(zhì)、提升白酒健康功效提供支撐。

圖5 黃水抗氧化能力分布

3 結(jié)論

通過(guò)DPPH自由基清除能力、總抗氧化能力兩種指標(biāo)間接測(cè)定黃水及分離的黃水兩大組分。研究結(jié)果表明，黃水中含有的組分具有明顯強(qiáng)于白酒的DPPH自由基清除能力和總抗氧化能力，蒸餾是導(dǎo)致白酒抗氧化能力偏低的主要原因，表明具有抗氧化活性的物質(zhì)難以揮發(fā)；黃水的抗氧化活性物質(zhì)主要分布在黃水清液中，但黃水多糖仍有一定的抗氧化能力。初步推測(cè)，酚類(lèi)化合物是引起黃水抗氧化活性的主要物質(zhì)，然而由于黃水經(jīng)過(guò)長(zhǎng)時(shí)間缺氧發(fā)酵其成分極為復(fù)雜、存在多種類(lèi)型的還原性物質(zhì)，具體是哪一種抗氧化活性成分、哪些是可以高效利用，尚待今后進(jìn)一步的深入研究。