莫 嵐, 黃亞輝, 趙文芳, 曾 貞(華南農(nóng)業(yè)大學園藝學院，廣東 廣州 510642)

我國是世界上最早開展茶樹種質(zhì)資源調(diào)查和篩選優(yōu)異資源的國家[1].茶樹種質(zhì)資源指的是攜帶并可傳遞種質(zhì)的一切茶樹植物，廣義上包括野生茶樹、選育品種、地方品種、引進品種(品系)、遺傳材料和野生近緣植物等[2].野生茶樹因獨特的生存環(huán)境和非人工栽培而在進化上保持了原始特性，作為重要的基因庫受到研究者的廣泛關(guān)注.我國作為茶樹原產(chǎn)地，擁有豐富的野生大茶樹種質(zhì)資源，主要分布在橫斷山脈分布區(qū)、滇川黔分布區(qū)、滇桂黔分布區(qū)和南嶺山脈分布區(qū)[3].

廣西地處我國南部，全區(qū)年平均氣溫16～23 ℃，年積溫6 000～8 000 ℃，年降雨量1 000～2 000 mm，極適宜于茶樹生長，被列為茶樹的適宜氣候區(qū)[4].廣西種茶歷史悠久，距今有3 000多年的歷史，其中與云南、貴州毗鄰的地區(qū)為茶樹的次生起源中心之一[5].由于廣西橫跨西南和華南兩個茶區(qū)，特有的地理生態(tài)環(huán)境，形成了十分豐富的茶樹種質(zhì)資源，同時也蘊藏著一些極其特異的資源[6-7].目前已有一些研究人員[8-10]對廣西金秀野生單株茶樹資源的分布和形態(tài)等進行了初步分析，但少見對野生群體種質(zhì)資源的研究.

生化成分標記作為分析遺傳多樣性的4種方法之一[11-12].對于茶樹而言，茶多酚、氨基酸、生物堿和黃酮類化合物等生化成分與茶葉品質(zhì)密切相關(guān).因而，為了系統(tǒng)地鑒定評價和充分利用金秀野生茶樹資源，對金秀境內(nèi)8個群體資源的主要品質(zhì)成分進行了研究.目前我國對于西南地區(qū)云貴川一帶的野生茶樹資源的研究較多，而針對廣西野生茶樹群體種質(zhì)資源的研究鮮見報道.本試驗綜合調(diào)查金秀的生態(tài)環(huán)境和8個野生茶樹資源，分析其主要生化成分的遺傳多樣性和適制性，多層次地研究和鑒定金秀種質(zhì)資源，篩選出優(yōu)異資源，旨在推動金秀野生茶樹資源的開發(fā)與利用.

1 材料與方法

1.1 材料

茶葉鮮葉分別采自金秀鎮(zhèn)共和村、六巷鄉(xiāng)上古陳屯、羅香鄉(xiāng)白牛屯、大樟鄉(xiāng)花爐村、金秀鎮(zhèn)楊柳屯、金秀鎮(zhèn)羅孟村、忠良鄉(xiāng)古蘭屯和忠良鄉(xiāng)雙和村等8個野生茶樹群體新梢.每個茶樹群體由15個單株組成.采摘于六巷鄉(xiāng)上古陳屯的茶葉鮮葉位于東經(jīng)110°08′28″，北緯23°53′31″，海拔1 170～1 207 m，生長于原始森林爛石中；其形態(tài)特征：小喬木樹型，大葉種，芽葉黃綠色，茸毛稀少，成熟葉綠色.采摘于羅香鄉(xiāng)羅運村白牛屯的茶葉鮮葉位于東經(jīng)110°13′83″，北緯23°57′20″，海拔684 m，生長于開荒后的八角林和山林深溝邊緣中；其形態(tài)特征：喬木樹型，中葉種，芽葉嫩綠色，無茸毛，成熟葉深綠色.采摘于金秀鎮(zhèn)共和村坤林屯的茶葉鮮葉位于海拔1 170～1 207 m的茶園中；其形態(tài)特征：灌木樹型，小葉種，芽葉嫩綠色，無茸毛，成熟葉深綠色.采摘于大樟鄉(xiāng)花爐村太陽屯的茶樹鮮葉位于東經(jīng)109°55′27″，北緯23°44′52″，海拔607 m，生長于原始次生林中；其形態(tài)特征：灌木樹型，中葉種，芽葉嫩綠色，無茸毛，成熟葉綠色.采摘于金秀鎮(zhèn)六段村楊柳屯的茶樹鮮葉位于東經(jīng)110°13′，北緯24°13′56″，海拔1 080 m，生長于原始次生林中；其形態(tài)特征：灌木樹型，中葉種，芽葉嫩綠色，無茸毛，成熟葉深綠色[9].采摘于金秀鎮(zhèn)羅孟村的茶樹鮮葉位于東經(jīng)110°13′，北緯24°13′30″；其形態(tài)特征：灌木樹型，小葉種，芽葉嫩綠色，茸毛稀少，成熟葉綠色.采摘于忠良鄉(xiāng)古蘭屯和雙和村的茶葉鮮葉位于東經(jīng)110°14′，北緯24°13′38″；其形態(tài)特征：小喬木樹型，大葉種，芽葉黃綠色，成熟葉綠色.

表1 金秀8個野生茶樹群體的采樣地點Table 1 Location of 8 wild tea populations from Jinxiu

兒茶素單體標準品(GA、GC、EGC、C、EGCG、EC、GCG、ECG、CG)及咖啡堿、茶葉堿、可可堿均購于美國Sigma公司，甲醇和乙腈(色譜級)購于國藥集團化學試劑有限公司，水為超純水，其他試劑均為市售級分析純.

1.2 方法

1.2.2 指標測定 含水量采用恒重法測定；水浸出物含量采用全量法測定；茶多酚含量采用酒石酸亞鐵法測定；游離氨基酸含量采用茚三酮比色法測定；黃酮類化合物含量采用三氯化鋁比色法測定；兒茶素單體和生物堿組分含量采用高效液相色譜法測定[14-16].

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

各生化成分含量的平均值、最小值、最大值、標準差和變異系數(shù)采用Excel 2013軟件進行統(tǒng)計.主成分分析經(jīng)SPSS 19.0統(tǒng)計軟件，采用Factor過程的主成分分析法.聚類分析采用離差平方和法，距離為歐氏距離，利用SAS 9.0統(tǒng)計軟件進行分析.各生化成分含量均為3次測定的平均值.

2 結(jié)果與分析

2.1 8個野生茶樹群體主要生化成分的基本特征

對8個野生茶樹群體的主要生化成分含量進行基本統(tǒng)計分析.由表2可知，8個群體生化成分含量的平均變異系數(shù)為28.52%，變幅為4.21%～53.42%，表現(xiàn)出豐富的遺傳多樣性.其中，變異系數(shù)最大的是GCG含量(53.42%)，其次為ECG含量(50.86%)和EGCG含量(49.24%)，而水浸出物含量的變異系數(shù)最小，為4.21%.表明酯型兒茶素在金秀野生茶樹種質(zhì)資源中的多樣性較廣泛，所包含的信息量較大.

表2 8個茶樹群體主要生化成分含量的基本統(tǒng)計參數(shù)Table 2 The basic statistical parameters of the main biochemical components of 8 tea populations

在影響茶葉品質(zhì)的4個常規(guī)生化成分(水浸出物、茶多酚、游離氨基酸、咖啡堿)中，水浸出物含量為44.34%～50.26%，平均值為47.36%，變異系數(shù)最小，為4.21%，含量最高的是東溫群體(49.54%)，最低的是古蘭群體(44.52%)，有83.34%資源的水浸出物含量超過45%.茶多酚含量為26.18%～41.16%，平均值為33.91%，變異系數(shù)為15.06%，含量最高的是雙和群體(40.93%)，最低的是六巷群體(27.03%)，有37.5%資源的茶多酚含量超過34%.通常，茶多酚含量高于38%的資源被視為超常規(guī)水平的品種或株系[13,17-18].其中，雙和群體(40.93%)和羅孟群體(40.92%)的茶多酚含量高于38%，是篩選高茶多酚品種的優(yōu)良材料.游離氨基酸含量為2.76%～5.32%，平均值為3.47%，變異系數(shù)為21.49%，含量最高的是六巷群體(5.23%)，最低的是白牛群體(2.81%).其中，六巷群體的游離氨基酸含量大于5%，屬于高氨基酸資源.咖啡堿含量為4.46%～7.34%，平均值為5.38%，變異系數(shù)為15.48%，含量最高的是六巷群體(7.29%)，最低的是白牛群體(4.48%).可見，決定茶葉品質(zhì)的4個常規(guī)生化成分中，游離氨基酸改良的潛力最大，水浸出物改良的潛力相對較小.另一方面，從每個主要成分的不同群體的含量來看，金秀野生茶樹資源主要生化成分在不同群體間的差異有統(tǒng)計學意義，表現(xiàn)出豐富的遺傳多樣性.如雙和群體的茶多酚含量是六巷群體的1.5倍，六巷群體的游離氨基酸含量是雙和群體的1.6倍等.

兒茶素作為茶多酚的主要組成部分，已發(fā)現(xiàn)并鑒定20余種兒茶素組分，分為非酯型兒茶素(簡單兒茶素)和酯型兒茶素(復雜兒茶素)，在茶葉兒茶素組分構(gòu)成中主要以酯型兒茶素為主.它們共占總茶多酚類混合物的60%～80%，是茶葉抗氧化、殺菌消炎和防癌等保健功能的物質(zhì)基礎(chǔ)[18]，與茶葉品質(zhì)和茶樹進化息息相關(guān).金秀8個野生茶樹資源的非酯型兒茶素含量為7.58%～12.43%，平均值為9.08%，最高的是白牛群體(12.37%)，最低的是羅孟群體(7.58%)；酯型兒茶素含量為4.11%～16.18%，平均值為10.65%，最高的是東溫群體(15.29%)，最低的是羅孟群體(4.11%)；兒茶素含量為11.69%～25.76%，平均為19.74%，最高的是白牛群體(25.58%)，最低的是羅孟群體(11.69%).8個群體中，兒茶素組分中含量最高的是 EGCG，含量最低的是C；兒茶素組分含量大小的總體趨勢為：EGCG>EGC>GCG>ECG>GC>EC>CG>C.從8個群體的各兒茶素組分來看，EGCG含量以六巷群體最高(8.93%)；GCG含量以東溫群體最高(4.50%)；ECG含量以楊柳群體最高(3.66%)；CG含量以雙和群體最高(1.11%)；C含量以雙和群體最高(1.39%)；EC含量以楊柳群體最高(1.14%)；GC含量以東溫群體最高(1.67%)；EGC含量以白牛群體最高(8.80%).EGCG 為最重要的酯型兒茶素，8個群體EGCG的含量為1.56%～9.11%，平均值為5.10%，變異系數(shù)為49.24%.8個群體EGCG含量大小為：六巷群體>東溫群體>楊柳群體>白牛群體>共和群體>古蘭群體>羅孟群體>雙和群體，其中，六巷群體的EGCG含量最高，達8.93%.目前，茶葉是EGCG的唯一來源[19]，研究表明，EGCG具有抗病毒、預防心血管疾病、抗癌、防輻射、延緩衰老、抗腫瘤、抗病毒、降血壓、降血脂、降血糖和抗突變等功效[20-22].高EGCG茶在國內(nèi)外市場有著廣闊的前景，六巷群體可作為茶樹品種改良的資源，也可作為直接提取EGCG的特異資源.

酚氨比為茶多酚與氨基酸的比值，可以作為茶樹品種適制性的參考.名優(yōu)綠茶一般要求氨基酸含量高，多酚類含量中等，以形成香高味鮮的品質(zhì)特征.若用酚氨比較大的茶樹品種鮮葉加工綠茶，往往滋味苦澀.一般認為，酚氨比小于8適宜制綠茶；酚氨比為8～15，為紅、綠茶兼制；酚氨比大于15則適制紅茶[23-24].從表2可以看出，酚氨比為4.92～12.90，平均值為10.18，變異系數(shù)為24.32%.可見，酚氨比的變異幅度比較大.六巷群體的酚氨比(5.17)低于8，適制優(yōu)質(zhì)綠茶；其他群體為紅、綠茶兼制型.

2.2 8個野生茶樹群體種質(zhì)資源的主成分

主成分分析能在多個成分時簡化對主體性狀的研究，有利于更好地研究群體[25].對8個野生茶樹群體的主要生化成分進行主成分分析，表3列舉了前4個主成分.表3表明，前4個主成分的累計貢獻率達到94.81%，表明這4個主成分包含了群體生化成分的大部分信息，可以借此對群體生化成分進行綜合評價.第1主成分的貢獻率達到43.94%，貢獻率最大的是兒茶素和酯型兒茶素含量，其次是EC和GCG含量，反映的主要是酯型兒茶素的信息；第2主成分的貢獻率達到76.39%，貢獻率最大的是酚氨比,其次是C和GC含量，反映的是含氮化合物的信息；第3主成分的貢獻率達到87.77%，貢獻率最大的是CG含量，其次是水浸出物和C含量，反映的主要是非酯型兒茶素的信息；第4主成分的貢獻率達到94.81%，貢獻率最大的是EGC含量.

表3 8個野生茶樹群體生化成分的主成分Table 3 Principal components of biochemical components of 8 wild tea tree populations

2.3 8個野生茶樹群體的聚類分析

研究表明，以茶多酚、兒茶素組分、咖啡堿/總氮和茶氨酸等作指標，可對茶樹種質(zhì)資源作出種群分類判斷，其正確率一般可達90%～96%[26].對8個群體以遺傳距離0～25進行聚類分析，可將其分成3個大的類群(圖1)：第Ⅰ類群為楊柳和東溫群體，第Ⅱ類群為白牛、六巷、共和、羅孟和雙和群體，第Ⅲ類群為古蘭群體.生化成分的聚類結(jié)果與形態(tài)學、分子生物學聚類結(jié)果[10]高度吻合.

圖1 8個野生茶樹群體聚類分析圖Fig.1 Cluster analysis of wild tea colonies in Jinxiu

從表4可以看出，3大類群游離氨基酸、茶多酚、咖啡堿的含量及酚氨比差異不顯著，其他生化成分的差異有統(tǒng)計學意義.水浸出物、兒茶素、黃酮類化合物和酯型兒茶素均以第Ⅰ類群的含量最高，且顯著高于第Ⅱ和Ⅲ類群；非酯型兒茶素以第Ⅲ類群的含量最低，且顯著低于第Ⅰ和Ⅱ類群，后兩者的差異不顯著.綜上所述，第Ⅰ類群生化成分含量豐富，黃酮類化合物、水浸出物和兒茶素含量最高，酚氨比居中，多數(shù)適制紅茶，少數(shù)適制綠茶.第Ⅱ類群的游離氨基酸含量最高，適制綠茶，游離氨基酸含量最高的六巷群體也聚到該類群中.第Ⅲ類群的茶多酚含量和酚氨比最高，多數(shù)適制紅茶.

3 討論

本試驗從生化成分的角度出發(fā)，對廣西金秀8個野生茶樹群體進行了生化特征研究.廣西由于獨特的地理生態(tài)環(huán)境，擁有豐富的茶樹種質(zhì)資源.對8個群體的系統(tǒng)鑒定評價，有利于充分發(fā)掘廣西地區(qū)茶樹資源的利用潛力.8個群體的平均變異系數(shù)為28.52%，與貴州(25.45%)[27]、四川(26.80%)[28]、武夷名叢(22.02%)[29]和云南(16.53%)[30]相比，變異類型比較豐富，其黃酮類化合物和酯型兒茶素含量的變異系數(shù)較高，表明金秀野生茶樹在黃酮類化合物和酯型兒茶素上有很大的選擇潛力.

表4 不同類群的主要生化成分1)Table 4 The main biochemical components of different groups

1)同行數(shù)據(jù)后附不同字母者表示差異顯著(P<0.05)，附相同字母者表示差異不顯著(P>0.05).

通過系統(tǒng)的生化鑒定分析，初步發(fā)現(xiàn)羅孟和雙和2個群體的茶多酚含量在40%以上；六巷群體游離氨基酸含量在4%以上，擁有高EGCG資源；高咖啡堿資源有6個群體，分別為六巷、羅孟、雙和、古蘭、楊柳和東溫群體.可見，金秀野生茶樹內(nèi)含物質(zhì)豐富，特異性茶樹種質(zhì)資源豐富.酚氨比作為茶樹資源適制性的一個指標.根據(jù)楊亞軍[31-33]、陸錦時等[34]的研究結(jié)果，本試驗中六巷群體的游離氨基酸含量較高，茶多酚含量最低，兒茶素含量適中，且含有一定的水浸出物和咖啡堿，適制綠茶；羅孟、雙和、古蘭、楊柳、東溫、白牛和共和等7個群體的游離氨基酸含量相對較低，兒茶素、茶多酚、水浸出物和咖啡堿的含量相對較高，是紅、綠茶兼制型，品質(zhì)皆優(yōu).此結(jié)果與聚類分析的結(jié)果基本吻合，有利于今后對不同地區(qū)茶樹群體的開發(fā)利用.

對8個野生茶樹群體的生化成分進行主成分分析，前4個主成分累計貢獻率達到94.81%，保留了16個生化成分的信息，其生化因子對茶葉品質(zhì)貢獻率的大小為：酯型兒茶素>游離氨基酸>水浸出物>生物堿.第1主成分中貢獻率最大的是兒茶素含量(0.994)，表明在16個生化成分中兒茶素含量對8個群體茶樹品質(zhì)的影響較大.不同基礎(chǔ)成分在前4個主成分中具有明顯不同的載荷值，有的成分具有方向相反的影響，每個主成分都能比較客觀地反映與品質(zhì)之間的關(guān)系，可用來對材料的綜合評價.

本試驗中，8個野生茶樹群體的生化成分存在差異，一方面是不同茶樹品種的代謝差異造成內(nèi)含物組分的不同，另一方面是廣西橫跨西南和華南兩大茶區(qū)，毗鄰茶樹的起源中心，且金秀瑤族自治縣位于大瑤山主體山脈上，氣溫適宜，云霧多，漫射光豐富，濕度大，土壤肥沃，腐殖質(zhì)豐富，土層深厚，有利于形成豐富的茶樹種質(zhì)資源，在生化成分方面表現(xiàn)出豐富的多樣性.

4 結(jié)論

本試驗結(jié)合金秀的氣候環(huán)境對金秀8個野生茶樹群體的主要生化成分進行了分析，探究其生化特征.結(jié)果表明，金秀野生茶樹群體資源的生化成分多樣性豐富，變異系數(shù)大，具有明顯的群體獨特性；從中篩選出的高茶多酚、高氨基酸和高EGCG等特異資源可作為下一步育種的材料，具有很高的利用價值；不同群體的生化特征為今后茶葉的加工和深加工領(lǐng)域提供依據(jù).