向候君, 蔡普默, 張賀賀, 王 波, 季清娥, 陳家驊(1.福建農林大學益蟲研究所；2.聯(lián)合國(中國)實蠅防控研究中心，福建 福州 350002)

斑翅果蠅[Drosophilasuzukii(Matsumura, 1931)]又稱櫻桃果蠅、鈴木氏果蠅，英文名稱是spotted wing drosophila (SWD)，屬于雙翅目(Diptera)環(huán)裂亞目(Cyclorrhapha)果蠅科(Drosophilidae)果蠅屬(Drosophila)水果果蠅亞屬(Sophophora)黑腹果蠅種組[1-5].斑翅果蠅廣泛分布于世界寒帶、溫帶、亞熱帶和熱帶地區(qū)[6].其寄主植物廣泛，已知寄主涉及18個科60多種水果.該果蠅雌蟲的產卵器為堅硬的鋸齒狀，可將卵直接產于成熟或即將成熟的櫻桃、桃、歐洲李、葡萄、草莓、樹莓、藍莓、柿子、番茄等軟皮果實內，幼蟲在果實內取食，給果園造成嚴重損失[3].目前對該蟲的治理以化學防治為主，但由于斑翅果蠅的卵、幼蟲和蛹長時間隱蔽在果實內部，僅成蟲暴露在空氣中，使得化學防治效果欠佳，且易產生“3R”等一系列環(huán)境問題.因此，對斑翅果蠅進行生物防治是未來綜合治理的主要發(fā)展方向[5,7].

嗅覺受體最初從黑腹果蠅(D.melanogaster)中鑒定出來，被命為Or83b[8].此后從不同昆蟲中鑒定出的Or83b的同源受體，分別被委以不同的名稱，如地中海實蠅Ceratitiscapitata(Wiedemann)的嗅覺受體為CcOr83b[9].特異的傳統(tǒng)嗅覺受體(olfactory receptor, OR)與高度保守的非典型嗅覺受體(olfactory receptor coreceptor, Orco)共同形成異源二聚體配體門控陽離子通道，對昆蟲嗅覺具有至關重要的作用[10].Orco的主要功能是將傳統(tǒng)氣味受體運送至嗅覺神經元樹突膜的表面，同時維持嗅覺受體復合體的構象穩(wěn)定.該受體基因的突變可以導致昆蟲嗅覺功能的嚴重缺失[11].氣味受體將環(huán)境中小分子化學信息物質所攜帶的信息轉化為電信號，導致嗅覺神經元產生動作電位，使昆蟲感知到外界氣味進而做出相應的行為反應[12].Orco序列上的高度保守性以及在嗅覺識別中的獨特地位，暗示Orco可能成為破壞嗅覺信號的一個潛在靶標，對嗅覺的有效干擾或破壞，將嚴重影響昆蟲對氣味和性信息素的反應，進而影響到昆蟲的取食、交配和產卵等重要生命行為活動[10].

Sukanya et al[13]對斑翅果蠅化學生態(tài)適應性與果蠅嗅覺基因家族進化的相互關系做了初步研究，但未見有關斑翅果蠅嗅覺受體基因的研究.本研究對斑翅果蠅Orco基因的生物信息學進行分析，為進一步研究和驗證斑翅果蠅Orco基因在嗅覺上的功能提供基礎資料.

1 材料與方法

1.1 序列來源

斑翅果蠅Orco基因序列來源于NCBI的Genbank數(shù)據(jù)庫(登錄號:NM_001328601).

1.2 研究方法

采用ExPASy數(shù)據(jù)庫提供的ProtParam(http:∥web.expasy.org/cgi-bin/protparam/protparam)工具在線預測斑翅果蠅Orco蛋白的理化性質；亞細胞定位分析采用TargetP 1.1(http:∥www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/)軟件；跨膜區(qū)預測采用TMHMM(http:∥www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/)和SMART(http:∥smart.embl-heidelberg.de/)程序;信號肽分析運用SignalP 4.1(http:∥www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)在線工具；磷酸化位點分析利用NetPhos 3.1軟件(http:∥www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)；采用Smart(http:∥smart.embl-heidelberg.de/)在線軟件分析預測蛋白保守結構域;蛋白親疏水性利用ExPASy的Protscale(http:∥web.expasy.org/protscale/)分析；采用Protfun 2.2軟件(http:∥www.cbs.dtu.dk/services/ProtFun/)在線分析預測蛋白功能；二級結構采用SOPMA軟件(https:∥npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)分析;三級結構使用Phyre2(http:∥www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/phyre2_output/190d03ee9c33015a/summary.html#multi)蛋白質折疊識別預測分析；氨基酸序列同源性分析采用BLASTt、MAGE 5.2軟件.

2 結果與分析

2.1 斑翅果蠅Orco蛋白理化性質

運用ProtParam工具對Dsuz/Orco蛋白的理化性質進行預測表明，Orco基因編碼486個氨基酸，分子質量為54 271.14 u，等電點為8.69.在組成Orco蛋白的20種氨基酸中，亮氨酸的含量最多，占10.3%，不穩(wěn)定系數(shù)為32.00，屬不穩(wěn)定蛋白；Orco蛋白帶負電荷氨基酸殘基數(shù)為31個，帶正電荷氨基酸殘基數(shù)為37個；脂肪系數(shù)為90.91，總平均親水指數(shù)為0.252，整條多肽鏈表現(xiàn)為疏水性，推測斑翅果蠅Orco蛋白為脂溶性蛋白.

2.2 斑翅果蠅Orco蛋白亞細胞定位

運用TargetP 1.1軟件對蛋白亞細胞定位結果見表1.最終預測的分數(shù)(Loc)，并不是真正的概率，表示分數(shù)最高的位置最有可能.從結果可知，目的蛋白Orco的分泌途徑為其他型(除mTP、SP、其他位置外)，即并不是定位在細胞核，而是定位在其他細胞器.

表1 斑翅果蠅Orco蛋白亞細胞定位結果Table 1 The subcellular localization of Orco protein in Drosophila suzukii

2.3 斑翅果蠅Orco蛋白跨膜區(qū)預測

利用TMHMM-2.0和SMART分析均顯示Orco蛋白共有7個跨膜結構，分別在第44～66位、第79～96位、第135～157位、第193～215位、第347～369位、第389～411位、第460～482位氨基酸的位置處各有一個跨膜結構(圖1).其中,第1～43位、第97～134 位、第216～346位、第412～459位氨基酸在膜內，第67～78位、第158～192位、第370～388位、第483～486位氨基酸在膜外.

圖1 斑翅果蠅Orco蛋白跨膜結構Fig.1 The transmembranc structure of Orco protein in Drosophila suzukii

2.4 斑翅果蠅Orco蛋白信號肽預測

SignalP 4.1程序自動利用神經網絡模型進行信號肽預測，并得到3種計算結果(C、Y、S值).SignalP預測結果顯示，D值為0.149，小于閾值0.5，所以Orco蛋白不存在信號肽(圖2).

圖2 斑翅果蠅Orco蛋白信號肽預測Fig.2 Signal peptide prediction of Orco protein in Drosophila suzukii

2.5 斑翅果蠅Orco蛋白磷酸化位點

利用NetPhos 3.1軟件分析斑翅果蠅Orco蛋白潛在磷酸化位點，結果表明,31個絲氨酸、17個蘇氨酸和5個酪氨酸可能成為Orco蛋白激酶磷酸化的位點(圖3).

2.6 斑翅果蠅Orco蛋白保守結構域

據(jù)Smart在線分析結果得知，斑翅果蠅Orco第70～476位氨基酸殘基有一個Pfam 7tm_6的結構域，并且該結構域的起始位點在第70個氨基酸，終止位點位于第476個氨基酸，其E值大小為2.5e-137.

2.7 斑翅果蠅Orco蛋白親疏水性

利用ExPASy的Protscale分析蛋白疏水性(圖4)發(fā)現(xiàn)，該基因編碼蛋白疏水性最大值為2.589(第479位)，最小值為-2.433(第277位).由此可知,該基因編碼的蛋白屬于疏水蛋白.

2.8 斑翅果蠅Orco蛋白功能預測及分析

從Protfun 2.2軟件分析結果(表2)可知，該蛋白具有脂肪酸代謝(fattyacid metabolism)、轉運和結合(transport and binding)及能量代謝(energy metabolism)的可能性分別為1.265、2.033和0.938.這說明斑翅果蠅Orco基因在脂肪酸代謝及轉運和結合中發(fā)揮重要作用，同時可能對能量代謝等起著關鍵作用.

圖3 斑翅果蠅Orco蛋白潛在磷酸化位點Fig.3 The potential phosphorylation site of Orco protein in Drosophila suzukii

圖4 斑翅果蠅Orco氨基酸親疏水性Fig.4 The hydrophilicity and hydrophobicity profile of Orco amino acids in Drosophila suzukii

表2 斑翅果蠅Orco蛋白功能預測Table 2 The function prediction of Orco protein in Drosophila suzukii

2.9 斑翅果蠅Orco蛋白二級結構

通過SOPMA軟件分析(圖5)可知斑翅果蠅Orco蛋白二級結構:α螺旋(alpha helix)244個，占50.21%；直鏈延伸(extended strand)98個，占20.16%；β轉角(Beta turn)42個，占8.64%；無規(guī)則卷曲(random coil)102個，占20.99%.由此可知，斑翅果蠅Orco蛋白二級結構以α螺旋為主.

2.10 斑翅果蠅Orco蛋白三級結構

運用Phyre2軟件分析預測斑翅果蠅Orco蛋白三級結構(圖6)可知，該蛋白三級結構主要由α螺旋和無規(guī)則卷曲纏繞折疊形成.

A.二級結構序列(h:α螺旋；e：直鏈延伸；t：β轉角；Cc：無規(guī)則卷曲)；B.二級結構預測(藍色為α螺旋,紅色為直鏈延伸,綠色為β轉角,紫色為無規(guī)則卷曲)；C.峰值變化圖.圖5 斑翅果蠅Orco蛋白二級結構Fig.5 The secondary structure of Orco protein in Drosophila suzukii

圖6 斑翅果蠅Orco蛋白三級結構Fig.6 The tertiary structure of Orco protein in Drosophila suzukii

2.11 斑翅果蠅Orco蛋白氨基酸序列與其他昆蟲Orco序列的進化分析

將斑翅果蠅Orco基因的氨基酸序列與橘小實蠅(Bactroceradorsalis)、地中海實蠅、稻縱卷葉螟(Cnaphalocrocismedinalis)、桃蛀螟(Conogethespunctiferalis)、致倦庫蚊(Culexquinquefasciatus)、黑腹果蠅、煙草天蛾(Manducasexta)、家蠅(Muscadomestica)、麥蛾(Sitotrogacerealella)等9種昆蟲的Orco氨基酸序列進行多序列比對和分析，使用MEGA 5.2軟件中的鄰接法(neighbor-joining, NJ)構建分子進化樹(圖7).其中，斑翅果蠅和黑腹果蠅聚為一支，自舉置信值為100，說明兩者的遺傳關系極其相近，同時說明兩者Orco氨基酸序列具有較高的相似性.在雙翅目中，斑翅果蠅與實蠅科關系較近，與家蠅關系較遠.

圖7 斑翅果蠅Orco蛋白序列與其他昆蟲Orco序列的進化樹Fig.7 Phylogenetic tree of Orco protein in Drosophila suzukii with other insects

3 小結與討論

本研究表明，斑翅果蠅Orco基因的mRNA全長1 461 bp，該基因編碼486個氨基酸，分子質量為54 271.14 u，等電點為8.69.亞細胞定位預測斑翅果蠅Orco蛋白亞細胞可能主要分布在內質網.信號肽剪切位點的預測主要是通過S值的大小來判斷該蛋白是否屬于分泌蛋白，如果S均值大于0.5，則該蛋白屬于分泌蛋白，反之則不屬于分泌蛋白[14-15].該基因在氨基酸序列中不存在剪切位點，且S值約0.1，小于0.5，說明該蛋白不屬于分泌蛋白.

蛋白保守結構域分析發(fā)現(xiàn)，斑翅果蠅Orco基因第70～476位氨基酸殘基有一個Pfam 7tm_6的結構域.通過親疏水性分析可知，斑翅果蠅Orco基因編碼的蛋白屬于疏水蛋白.進一步對該基因功能進行預測發(fā)現(xiàn)，該基因編碼的蛋白在轉運和結合及脂肪酸代謝中發(fā)揮重要作用，同時在能量代謝中起關鍵作用.這符合前人研究中提到的Orco本身不與氣味配體結合，它與傳統(tǒng)嗅覺受體形成異二聚體Or-Orco，促進傳統(tǒng)嗅覺受體在神經元樹突膜上的定位并維持其穩(wěn)定性，增強嗅覺受體的功能[8,16].蛋白質二級結構分析發(fā)現(xiàn)，該蛋白主要以α螺旋為主，無規(guī)則卷曲和直鏈延伸也占有一定比例.氨基酸的二級結構是高級結構的基礎，會對高級結構的形成產生影響[15].三級結構主要是由α螺旋和無則規(guī)卷曲纏繞折疊形成.

斑翅果蠅嗅覺受體包含7個跨膜區(qū)，跨膜方式為受體蛋白的N末端位于膜內，C末端在膜外，這種拓撲結構與其他昆蟲，如綠盲蝽(Apolyguslucorum)、雙委夜蛾(Athetisdissimilis)、麗蠅(Calliphoridae)、淡色庫蚊(Culexpipienspallens)等的Orco蛋白[10-11,17-18]相同.Orco與傳統(tǒng)嗅覺受體通過保守的C末端區(qū)域相互作用形成一種新型的配體門控離子通道Or-Orco復合體.進一步比對這些昆蟲Orco的氨基酸序列顯示，保守區(qū)并不是隨機分布，而是主要分布在蛋白序列的長鏈上，特別是在近C端的序列幾乎完全一致，屬于極端保守區(qū)域，Orco與傳統(tǒng)嗅覺受體即通過此區(qū)域相互聯(lián)系[8,19].正是由于這種序列的高度一致性，即使在被研究昆蟲的基因組序列未知的情況下，也可以根據(jù)同源受體的保守區(qū)設計簡并引物克隆出被研究昆蟲的Orco受體基因[11].同時，Orco在結構上的高度保守性預示著這類氣味受體可能在不同的昆蟲中有著基本相同的嗅覺功能.