袁 源，林麗靜，黃曉兵*，彭芍丹，李積華

（中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，廣東 湛江 524001）

高良姜，別名高涼姜、良姜、蠻姜和佛手根等，為姜科山姜屬多年生草本植物高良姜（Alpinia officinarum Hance）的根莖[1]。主產(chǎn)于廣東湛江徐聞縣，廣泛分布于我國廣東、廣西、海南、云南、臺灣等地區(qū)[2]。

揮發(fā)油是高良姜的主要活性成分之一，具有鎮(zhèn)痛止嘔雙重藥理作用[3]。由于其良好的抑菌性及抗氧化作用[4-5]，其應(yīng)用范圍廣泛，除藥用外，還常作為香料添加至食品以及香水等日化用品中[6-8]。高良姜揮發(fā)油中的1,8-桉葉素在2005年版《中國藥典》里被作為高良姜含量檢測的指標(biāo)性物質(zhì)[1]。作為辛溫類藥材，揮發(fā)油是判斷其質(zhì)量優(yōu)劣的指標(biāo)之一。已有研究表明不同產(chǎn)地和品種的高良姜揮發(fā)油的組成成分及其含量差異顯著[9-12]。

氣相色譜-質(zhì)譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）技術(shù)在分析未知復(fù)雜樣品，常出現(xiàn)譜庫中幾個化合物與同一色譜峰進(jìn)行匹配，無法得到準(zhǔn)確結(jié)果。引入保留指數(shù)（retention index，RI）作為質(zhì)譜定性分析的補(bǔ)充和驗證十分有效[13-14]。在同一柱上，物質(zhì)的RI與柱溫呈線性關(guān)系[15]。采用RI與MS共同定性，可使準(zhǔn)確度大大提高[16-18]。國內(nèi)關(guān)于高良姜揮發(fā)油的成分分析多采用MS直接定性，較少利用RI進(jìn)行驗證。

指紋圖譜波譜、色譜等現(xiàn)代分析是一種考察復(fù)雜成分均一性和穩(wěn)定性的質(zhì)量控制模式[19-22]。道地藥材較其他地區(qū)所產(chǎn)的同種藥材品質(zhì)佳、療效好，具有較高知名度[23]。鑒于各種藥材中化學(xué)成分復(fù)雜，指紋圖譜技術(shù)作為可量化的綜合鑒定手段，在特定產(chǎn)地的藥材品種鑒別、品質(zhì)考察和控制、品級劃分及評價中起到重要作用[24]。

為了更深入研究廣東湛江徐聞高良姜這種道地藥材，本研究利用GC-MS聯(lián)用技術(shù)結(jié)合RI驗證，對廣東湛江徐聞高良姜1～5 a生長年份的揮發(fā)油主要成分進(jìn)行定性，采用峰面積歸一化法進(jìn)行相對定量分析對比研究。同時建立高良姜揮發(fā)油指紋圖譜，有望為當(dāng)?shù)馗吡冀馁|(zhì)量控制及合理開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

5 批高良姜，1～5 a生長年份鮮姜各1 批，每批100 kg，從徐聞原產(chǎn)地收集采購，經(jīng)清洗干燥粉碎得姜粉備用；市售干姜3 批，每批20 kg，從市面藥店采購，直接粉碎得姜粉備用。原植物標(biāo)本經(jīng)中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所廣東省級現(xiàn)代農(nóng)業(yè)（熱帶農(nóng)產(chǎn)品加工與檢測）產(chǎn)業(yè)技術(shù)研發(fā)中心鑒定為姜科植物高良姜。

正構(gòu)烷烴C7～C30標(biāo)準(zhǔn)品、α-蒎烯標(biāo)準(zhǔn)品、1,8-桉葉素標(biāo)準(zhǔn)品、松油烯-4-醇標(biāo)準(zhǔn)品、α-松油醇標(biāo)準(zhǔn)品、α-法尼烯標(biāo)準(zhǔn)品，正己烷（色譜純） 德國Sigma公司；無水硫酸鈉（分析純） 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；實驗用水為二次蒸餾水。

1.2 儀器與設(shè)備

QP2010-Plus GC-MS聯(lián)用儀、AOC5000三合一自動進(jìn)樣器、GC-MS Real Time Analysis色譜工作站 日本島津公司。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)品制備

參考文獻(xiàn)[1]，分別取1,8-桉葉素標(biāo)準(zhǔn)品25、50 μL以正己烷稀釋20 倍至1.5 mL樣品瓶中制備標(biāo)準(zhǔn)品溶液，用于GC-MS聯(lián)用定性和定量分析。

通過外標(biāo)2 點法進(jìn)行定量分析，計算每100 g干藥材中1,8-桉葉素質(zhì)量分?jǐn)?shù)，公式如下：

取α-蒎烯標(biāo)準(zhǔn)品、松油烯-4-醇標(biāo)準(zhǔn)品、α-松油醇標(biāo)準(zhǔn)品、α-法尼烯標(biāo)準(zhǔn)品各50 μL，以正己烷稀釋20 倍至1.5 mL樣品瓶中制備標(biāo)準(zhǔn)品溶液，用于GC-MS聯(lián)用定性分析。

1.3.2 供試品制備

取上述姜粉各50 g，參考文獻(xiàn)[1]進(jìn)行制備，平行提取3 次，計算其誤差值。揮發(fā)油相對含量計算公式如下：

上述所得揮發(fā)油經(jīng)無水硫酸鈉干燥后取50 μL，以正己烷稀釋20 倍置1.5 mL樣品瓶中制備供試品溶液，用于GC-MS聯(lián)用儀檢測分析。

1.3.3 GC-MS條件

Rtx?-5ms毛細(xì)管色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；升溫程序：60 ℃保持6 min，以10 ℃/min升至160 ℃，保持5 min，再以20 ℃/min升至240 ℃，保持10 min；進(jìn)樣溫度250 ℃；載氣（He）流速1 mL/min；壓力57.4 kPa；分流比30∶1；進(jìn)樣量1 μL。

電子電離源；離子源溫度230 ℃；接口溫度250 ℃；溶劑延遲2.5 min；數(shù)據(jù)采集方式全掃描；質(zhì)量掃描范圍m/z 40～450；檢測器增益電壓1.18 kV。

檢索數(shù)據(jù)庫為NIST Chemical Structures庫（美國國家標(biāo)準(zhǔn)研究所數(shù)據(jù)庫，2014版），Wiley Library庫（威廉圖譜庫，第九版）。

1.4 數(shù)據(jù)處理

1.4.1 RI的計算

取C7～C30正構(gòu)烷烴標(biāo)準(zhǔn)品，以正己烷為溶劑配制體積分?jǐn)?shù)為0.1%的溶液，采取1.3.1節(jié)和1.3.2節(jié)相同的分析條件進(jìn)行分離，測定各物質(zhì)的保留時間。各成分的RI按下式計算：

式中：tx為被分析組分流出峰的保留時間/min；tn為碳原子數(shù)為n的正構(gòu)烷烴流出峰的保留時間/min；tn+1為碳原子數(shù)為n+1的正構(gòu)烷烴流出峰的保留時間/min；且tn＜tx＜tn+1。

1.4.2 標(biāo)準(zhǔn)偏差與相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）的計算[25]

對不同生長年份高良姜1,8-桉葉素含量標(biāo)準(zhǔn)偏差值進(jìn)行計算，用來表示各年份的1,8-桉葉素含量間差異的大小。對不同生長年份高良姜主要成分峰檢測分析的保留時間RSD值進(jìn)行計算，可驗證各組分峰分析結(jié)果的準(zhǔn)確度、穩(wěn)定性和重復(fù)性。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同生長年份高良姜揮發(fā)油含量

表1 不同生長年份高良姜揮發(fā)油含量（n=3）Table1 Volatile oil contents of galangal with different ages (n= 3)

由表1可知，平行提取3 次后，以4 a生的高良姜揮發(fā)油含量稍高，顏色最深。

2.2 不同年份高良姜揮發(fā)油中1,8-桉葉素含量

1,8-桉葉素具有殺蟲、抗菌、疏風(fēng)解熱、祛濕解毒的藥理活性，輔助藥物滲透作用較強(qiáng)[26-28]。經(jīng)GC-MS分析鑒定、RI驗證以及標(biāo)準(zhǔn)品定量（標(biāo)準(zhǔn)曲線y=4.29×106x-378.32），測得不同年份高良姜揮發(fā)油中指標(biāo)成分1,8-桉葉素含量見表2。

表2 不同生長年份高良姜中1,8-桉葉素含量（n=3）Table2 1,8-Cineole contents of galangal with different ages (n= 3)

由表2可知，1,8-桉葉素在各年份的原藥材中含量均高于《中國藥典》[1]規(guī)定的0.15%，第4年的1,8-桉葉素含量略高于其他年份。1,8-桉葉素在各年份藥材中含量的標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.415%（＜0.5%），表示1,8-桉葉素在各年份藥材中的含量差異小。表明不同生長年份高良姜藥材中的1,8-桉葉素含量基本穩(wěn)定。

2.3 不同年份高良姜揮發(fā)油主要特征性揮發(fā)化合物的比較分析

表3 不同年份高良姜揮發(fā)油中主要特征性揮發(fā)化合物的比較分析Table3 Comparative analysis of the main characteristic compounds in volatile oil samples from galangal with different ages

將各年份揮發(fā)油經(jīng)1.3.3節(jié)所測得的組分峰用NIST Chemical Structures庫和Wiley Library庫進(jìn)行檢索，結(jié)合文獻(xiàn)[10,16]中的RI，以質(zhì)譜匹配度和RI匹配度最高的化學(xué)結(jié)構(gòu)為最佳鑒定結(jié)果，可信度更高。同時采用峰面積歸一化法確定各組分相對含量。經(jīng)鑒定后，結(jié)合以往文獻(xiàn)分析結(jié)果及藥理活性選擇其中25 種主要揮發(fā)性化合物[9-12,16,19]進(jìn)行比較分析，所得結(jié)果按洗脫順序列于表3。不同生長年份的高良姜揮發(fā)油主要揮發(fā)性成分組成相似，僅是比例有差別。結(jié)果表明，1,8-桉葉素為高良姜揮發(fā)油中的主要成分，與文獻(xiàn)[9-12]報道相同。高良姜揮發(fā)油主要由萜烯類、醇類、酯類、酮類、醛類以及氧化物類化合物組成；各組分比例存在較大差異，通過總峰面積對各類組分不同年份的含量差異進(jìn)行對比分析，見圖1。由圖1可知，高良姜揮發(fā)油中的6 類物質(zhì)相對含量最高的是萜烯類化合物，其次是醇類化合物，第3是酮類化合物。隨著生長年份的延長，這6 類物質(zhì)中萜烯類和氧化物類物質(zhì)呈現(xiàn)相對含量前4 a持續(xù)上升，到第5年下降的趨勢；醇類物質(zhì)呈現(xiàn)相對含量前3 a持續(xù)上升，第4、5年逐漸下降的趨勢；酮類、酯類、醛類物質(zhì)相對含量呈現(xiàn)隨生長年份的延長而增加的趨勢；酯類相對含量較低反映高良姜揮發(fā)油不屬于酯類油。綜合結(jié)果表明4 a生的高良姜揮發(fā)油各組分總量最高，與表1中4 a生的姜油顏色最深的結(jié)果相符。

圖1 不同年份高良姜揮發(fā)油各類組分的含量差異對比Fig.1 Comparison of the contents of compound classes in volatile oils from galangal with different ages

2.4 高良姜揮發(fā)油指紋圖譜的建立

表4 高良姜揮發(fā)油主要特征峰保留時間Table4 Main characteristic peaks with relative retention time of volatile oils from galangal with different ages

通過對5 批不同生長年份高良姜揮發(fā)油樣品進(jìn)行檢測，對在上述研究主要的25 個特征峰保留時間進(jìn)行比較，5 批不同年份揮發(fā)油保留時間的RSD均小于0.1%，表示準(zhǔn)確度高，反映GC-MS色譜儀具有較好的穩(wěn)定性和精密度，分析結(jié)果可靠，結(jié)果見表4。

將5 批不同生長年份的揮發(fā)油樣品GC-MS數(shù)據(jù)，經(jīng)處理后得高良姜GC-MS指紋圖譜，見圖2。通過GC-MS指紋圖譜的辨認(rèn)，上述研究中所鑒定的25 個主要特征性成分峰在5 批樣品中均可明確檢出，構(gòu)成徐聞產(chǎn)區(qū)高良姜揮發(fā)油指紋圖譜的穩(wěn)定特征峰，并用此指紋圖譜對3 個市售揮發(fā)油樣品進(jìn)行辨認(rèn)，盡管樣品之間各峰的表觀豐度有差異，但整體峰形非常相似，可確認(rèn)3 個市售產(chǎn)品為正品高良姜。

圖2 高良姜揮發(fā)油GC-MS指紋圖譜Fig.2 GC-MS fi ngerprints of volatile oils from galangal with different ages

3 結(jié) 論

揮發(fā)油有輔助藥物透皮吸收的作用，是衡量辛溫類中藥質(zhì)量和療效的指標(biāo)之一[29-30]。高良姜藥材中揮發(fā)油含量較高，辛香氣味長久以來是判斷其藥材質(zhì)量優(yōu)劣的一個重要指標(biāo)[31]。

本研究通過對徐聞產(chǎn)區(qū)高良姜1～5 a生長年份的揮發(fā)油含量、指標(biāo)成分1,8-桉葉素含量及主要成分進(jìn)行對比分析，發(fā)現(xiàn)4 a揮發(fā)油含量略高于其他生長年份；各年份藥材中的1,8-桉葉素含量保持穩(wěn)定；不同年份揮發(fā)油成分組成類似，但各組分比例存在較大差異。通過本研究發(fā)現(xiàn)高良姜的指標(biāo)性成分l,8-桉葉素的含量，隨生長年份的延長基本保持穩(wěn)定。然而藥效是各方面的，全面評價不能僅以一個組分的含量決定[10,16]。單味中藥所含主要活性成分比例變化對藥效的影響經(jīng)常被中藥質(zhì)量評價研究所忽視。高良姜揮發(fā)油包含萜烯類、醇類、酯類、酮類、醛類以及氧化物類6 類化合物，其中萜烯類化合物占主要地位。萜烯類和氧化物類物質(zhì)相對含量呈現(xiàn)前4 a持續(xù)上升，第5年下降的趨勢；醇類物質(zhì)相對含量呈現(xiàn)前3 a持續(xù)上升，后2 a逐漸下降的趨勢；酮類、酯類、醛類物質(zhì)相對含量呈現(xiàn)隨生長年份延長而增加的趨勢；這是以1,8-桉葉素為指標(biāo)成分所不能反映的。因此對藥材的質(zhì)量評價不僅要考慮某個活性成分的含量，同時應(yīng)增加能反映活性成分各類比例的質(zhì)量評價方法。

本研究通過對不同年份的揮發(fā)油主要特征性揮發(fā)成分的比較分析，建立高良姜揮發(fā)油GC-MS聯(lián)用指紋圖譜，為高良姜的質(zhì)量控制提供理論基礎(chǔ)。GC-MS聯(lián)用指紋圖譜能較全面、綜合、準(zhǔn)確地反映揮發(fā)油的組分質(zhì)量情況[19-22]。通過5 批徐聞地區(qū)不同年份高良姜揮發(fā)油中主要特征峰的定性分析，形成徐聞地區(qū)高良姜揮發(fā)油的指紋圖譜，應(yīng)用于市售3 批揮發(fā)油樣品進(jìn)行辨認(rèn)，雖然各峰的表觀豐度有差異，但整體峰形非常相似，可確認(rèn)其為正品高良姜。因此，通過尋找構(gòu)成揮發(fā)油指紋的特征峰，有利于對揮發(fā)油整體性和模糊性評價，可為控制辛溫類藥材內(nèi)在品質(zhì)提供一定的依據(jù)。