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        麩皮多糖微生物發(fā)酵工藝優(yōu)化及其抗炎活性

        2018-07-24 08:45:12史俊祥段元霄張倩茹孟子琪安曉萍齊景偉
        食品科學(xué) 2018年14期
        關(guān)鍵詞:麩皮菌種多糖

        王 園,史俊祥,段元霄,張倩茹,孟子琪,李 暄,安曉萍*,齊景偉*

        (內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院,內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018)

        小麥麩皮是小麥加工面粉的副產(chǎn)物,是小麥提取胚芽和胚乳后的剩余部分,主要由小麥的皮層和糊粉層組成[1]。除含有一定數(shù)量的淀粉、蛋白質(zhì)、脂肪外,麩皮主要含有46%左右的非淀粉多糖[2-3],包括果膠多糖、纖維素多糖以及由阿拉伯木聚糖、混合鏈β-葡聚糖、葡甘露聚糖、半乳聚糖、木聚糖等組成的非纖維素多糖[4]。大量研究表明,麩皮非淀粉多糖中的非纖維多糖具有諸多生物活性,包括抑菌[5]、抗氧化[6-8]、免疫調(diào)節(jié)[9-11]和益生作用等[12-14],故又將此類多糖稱為麩皮活性多糖,簡稱麩皮多糖。

        隨著研究應(yīng)用的不斷深入,麥麩多糖已經(jīng)在食品工業(yè)、發(fā)酵工業(yè)等領(lǐng)域嶄露頭角。麥麩多糖的傳統(tǒng)提取方法主要有物理法[15-16]、化學(xué)法[17-19]和酶法[20-21]等。近幾年,微生物發(fā)酵法得到廣泛應(yīng)用[22-23],與其他方法相比,該方法具有成本低、條件溫和、不受設(shè)備限制且多糖轉(zhuǎn)化率較高的優(yōu)點(diǎn)。

        目前,微生物發(fā)酵法制備麩皮多糖采用的菌種多為食用菌和霉菌[24-25],以非霉系菌種作為發(fā)酵菌種的報(bào)道較少,祁紅兵等[26]研究了以納豆芽孢桿菌作為發(fā)酵菌株固態(tài)發(fā)酵麩皮的抗氧化活性。崔晨曉等[27]研究了酵母菌發(fā)酵小麥麩皮中可溶性阿拉伯木聚糖和總酚含量。本實(shí)驗(yàn)以釀酒酵母以及枯草芽孢桿菌為發(fā)酵菌種固態(tài)發(fā)酵小麥麩皮制備麩皮多糖,通過響應(yīng)面法確定最佳發(fā)酵工藝參數(shù),并通過敵草快攻毒建立大鼠模型研究制備的麩皮多糖的抗炎活性,以期為在生產(chǎn)中將麩皮多糖應(yīng)用于改善動(dòng)物健康狀況、促進(jìn)其生長提供理論支撐。

        1 材料與方法

        1.1 材料與試劑

        釀酒酵母CGMCC 2.119以及枯草芽孢桿菌CGMCC 1.892為動(dòng)物科學(xué)學(xué)院水產(chǎn)實(shí)驗(yàn)室保存;麩皮、豆粕粉和玉米粉均購于市場;乙醇、苯酚、濃硫酸、尿素、葡萄糖均為國產(chǎn)分析純;營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、麥芽汁液體培養(yǎng)基廣東環(huán)凱微生物科技有限公司;無菌級(jí)Wistar大鼠內(nèi)蒙古大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。

        1.2 儀器與設(shè)備

        手提式壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫(yī)療器械廠;SW-CJ超凈工作臺(tái) 上海新苗醫(yī)療器械公司;GX2型智力光照培養(yǎng)箱 寧波東南儀器有限公司;SH2-82旋轉(zhuǎn)氣浴恒溫振蕩器 金壇市岸頭中旺實(shí)驗(yàn)儀器廠;TG16-WS臺(tái)式高速離心機(jī) 湖南湘儀儀器開發(fā)有限公司;電熱恒溫水浴鍋 上海醫(yī)療器械有限公司;微孔板分光光度計(jì)美國伯騰儀器有限公司。

        1.3 方法

        1.3.1 底物配制

        枯草芽孢桿菌種子液的制備:將保藏的枯草芽孢桿菌接種于滅菌(121 ℃,0.1 MPa)的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中,培養(yǎng)24 h(37 ℃,120 r/min),使菌體濃度達(dá)到108CFU/mL。釀酒酵母種子液的制備:將保藏的釀酒酵母接種于滅菌(121 ℃,0.1 MPa)的麥芽汁培養(yǎng)基中,培養(yǎng)24 h(37 ℃,120 r/min),使菌體濃度達(dá)到108CFU/mL。復(fù)合菌種液含有釀酒酵母和枯草芽孢桿菌,比例為6.73∶3.26,總接種量10%?;A(chǔ)發(fā)酵底物為麩皮 80.46%、豆粕粉9.32%和玉米粉10.22%,料水比為1∶1。

        1.3.2 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

        分別研究確定發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間、總接種量和料水比對麩皮多糖產(chǎn)量的影響。根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果,發(fā)酵溫度設(shè)定為25、30、35、40 ℃和45 ℃;發(fā)酵時(shí)間設(shè)定為24、36、48、60 h和72 h;總接種量為5%、7.5%、10%、12.5%和15%;料水比為1∶0.5、1∶1、1∶1.5、1∶2和1∶2.5(g/mL)。

        1.3.3 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

        在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上,確定發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間、總接種量和料水比的取值范圍,采用Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)4因素3水平的響應(yīng)面分析試驗(yàn),以發(fā)酵底物中麩皮多糖產(chǎn)量為響應(yīng)值,利用Minitab 17軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,得出微生物發(fā)酵法制備麩皮多糖的最佳發(fā)酵工藝。響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)見表1。

        表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平Table1 Coded levels of independent variables used in Box-Behnken design

        1.3.4 麩皮多糖的提取制備

        發(fā)酵麩皮濕樣于45 ℃烘箱中烘干24 h后粉碎,10 g干燥發(fā)酵麩皮加入200 mL水中,80 ℃水浴30 min,離心取上清液,上清液加入4 倍體積的95%乙醇溶液,靜置過夜,離心收集沉淀,沉淀烘干即為麩皮多糖;沉淀用蒸餾水復(fù)溶后即得麩皮多糖溶液。

        1.3.5 麩皮多糖含量的測定

        采用苯酚-硫酸法測定麩皮多糖產(chǎn)量[28]。麩皮多糖產(chǎn)量按下式計(jì)算:

        1.3.6 麩皮多糖抗炎活性分析

        1.3.6.1 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

        選用雄性Wistar大鼠36 只經(jīng)過1 周的適應(yīng)期,按實(shí)驗(yàn)要求將大鼠隨機(jī)分為6 組。低劑量組(low-dose,CL)、中劑量組(middle-dose,CM)和高劑量組(high-dose,CH):每天按大鼠體質(zhì)量分別灌服100、200、400 mg/kg麩皮多糖;正對照組(positive control,PC):100 mg/kg VC;負(fù)對照組(negative control,NC):空白攻毒;正常對照組(control,CT):空白不攻毒。實(shí)驗(yàn)期14 d。實(shí)驗(yàn)結(jié)束當(dāng)天,除CT組外,其他5 組大鼠按體質(zhì)量腹腔注射diquat 0.1 mmol/kg,CT組注射等量生理鹽水,攻毒24 h后屠宰。

        1.3.6.2 血漿和組織樣品的制備

        大鼠攻毒前禁食12 h,自由飲水,攻毒后24 h后乙醚致暈,心臟采血,并采集肝臟樣本。血液樣品采集后立即放置在冰盒中,3 000 r/min離心10 min后,-20 ℃保存。肝臟樣本用生理鹽水洗凈后,裝入無菌采樣袋,浸入液氮,取出后-80 ℃冷凍保存。測定時(shí),用含NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.86%磷酸鹽緩沖溶液(phosphate buered solution,PBS)(0.01 mol/L,pH 7.4)勻漿,3 000 r/min離心10 min后得到的上清液用于炎性因子指標(biāo)測定。

        1.3.6.3 炎性指標(biāo)的測定

        腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白細(xì)胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)、白細(xì)胞介素-2(interleukin-2,IL-2)和白細(xì)胞介素-6(interleukin-6,IL-6)根據(jù)定量測定試劑盒(武漢基因美生物科技有限公司)的說明,進(jìn)行酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)。

        1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

        采用Minitab 17軟件進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果分析;SAS 8.1統(tǒng)計(jì)軟件ANOVA模型進(jìn)行單因素方差分析,用Duncan’s檢驗(yàn)進(jìn)行多重比較,P<0.05為差異顯著。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 單因素試驗(yàn)

        2.1.1 發(fā)酵溫度對麩皮多糖產(chǎn)量的影響

        圖1 發(fā)酵溫度對麩皮多糖產(chǎn)量的影響Fig.1 Effect of fermentation temperature on the yield of polysaccharides

        由圖1可知,當(dāng)發(fā)酵溫度在25~45 ℃范圍內(nèi)變化時(shí),發(fā)酵底物中麩皮多糖產(chǎn)量呈先增加后減少的趨勢。發(fā)酵溫度為35 ℃時(shí)達(dá)到最大值,其麩皮多糖產(chǎn)量為123.44 mg/g,且顯著高于其他溫度(P<0.05)。因此,以發(fā)酵溫度35 ℃作為響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)的發(fā)酵溫度中心點(diǎn)。

        2.1.2 發(fā)酵時(shí)間對麩皮多糖產(chǎn)量的影響

        圖2 發(fā)酵時(shí)間對麩皮多糖產(chǎn)量的影響Fig.2 Effect of fermentation time on the yield of polysaccharides

        由圖2可知,隨著發(fā)酵時(shí)間的延長,發(fā)酵底物中麩皮多糖產(chǎn)量呈先增大后減小的趨勢。在發(fā)酵第48小時(shí)達(dá)到最大值,其麩皮多糖產(chǎn)量為128.05 mg/g,且顯著高于其他時(shí)間(P<0.05)。因此,以第48小時(shí)作為響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)的發(fā)酵時(shí)間中心點(diǎn)。

        2.1.3 總接種量對麩皮多糖產(chǎn)量的影響

        圖3 總接種量對麩皮多糖產(chǎn)量的影響Fig.3 Effect of inoculum size on the yield of polysaccharides

        由圖3可知,隨著總接種量的增加,發(fā)酵底物中麩皮多糖產(chǎn)量呈先增大后減小的趨勢。在總接種量為10%時(shí)達(dá)到最大值,其麩皮多糖產(chǎn)量為124.89 mg/g,且顯著高于其他總接種量(P<0.05);因此,以10%總接種量作為響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)的總接種量中心點(diǎn)。

        2.1.4 料水比對麩皮多糖產(chǎn)量的影響

        圖4 料水比對麩皮多糖產(chǎn)量的影響Fig.4 Effect of solid-to-water ratio on the yield of polysaccharides

        由圖4可知,隨著溶劑用量的增加,發(fā)酵底物中麩皮多糖產(chǎn)量呈先增大后減小的趨勢,在料水比為1∶1達(dá)到最大值,其麩皮多糖產(chǎn)量為122.33 mg/g,且顯著高于其他料水比(P<0.05);因此,以料水比1∶1作為響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)的料水比中心點(diǎn)。

        貫徹落實(shí)黨的十八大精神 開創(chuàng)治水保安興水富民新局面…………………………………………………………… 紀(jì) 冰(1.14)

        2.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果及方差分析

        2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

        結(jié)合單因素試驗(yàn)結(jié)果,選取對發(fā)酵底物中麩皮多糖產(chǎn)量影響顯著的4 個(gè)因素發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間、總接種量和料水比,采用4因素3水平的Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及分析方法進(jìn)行提取條件的優(yōu)化,試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果見表2。

        表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table2 Box-Behnken design with response variable

        利用Minitab 17統(tǒng)計(jì)分析軟件,對表3中試驗(yàn)數(shù)據(jù)經(jīng)多元回歸擬合,獲得發(fā)酵產(chǎn)物中麩皮多糖產(chǎn)量(Y)對4 個(gè)因素的二次回歸模型方程為:Y=126.60+5.96A+14.66B+5.49C+18.11D-37.20A2-24.07B2-33.77C2-35.16D2-3.16AB+1.66AC-0.89AD+11.22BC+6.76BD+6.56CD。

        如表3所示,回歸模型極顯著(P<0.01),失擬項(xiàng)不顯著(P=0.247>0.05),說明該回歸模型擬合程度良好,試驗(yàn)誤差小。復(fù)相關(guān)系數(shù)R2為96.36%,該模型預(yù)測性良好。一次項(xiàng)對發(fā)酵產(chǎn)物中麩皮多糖產(chǎn)量影響顯著,從F值可知,4因素對發(fā)酵產(chǎn)物中麩皮多糖產(chǎn)量影響的順序?yàn)椋毫纤龋―)>發(fā)酵時(shí)間(B)>發(fā)酵溫度(A)>總接種量(C)。

        表3 回歸模型方差分析Table3 Analysis of variance of regression model

        兩因素交互作用中,BC對發(fā)酵產(chǎn)物中麩皮多糖產(chǎn)量影響顯著(P<0.05),其他兩因素交互作用對發(fā)酵產(chǎn)物中麩皮多糖產(chǎn)量影響不顯著(P>0.05)。二次項(xiàng)A2、B2、C2對發(fā)酵產(chǎn)物中麩皮多糖產(chǎn)量均有極顯著影響(P<0.05),進(jìn)一步說明各具體試驗(yàn)因素對發(fā)酵產(chǎn)物中麩皮多糖產(chǎn)量的影響不是簡單的線性關(guān)系。

        圖5 各交互因素對發(fā)酵產(chǎn)物中麩皮多糖產(chǎn)量影響的響應(yīng)面Fig.5 Response surface plots showing the interactive effects of various factors on the yield of polysaccharides

        由圖5可知,4 個(gè)變量在兩兩交互時(shí),保持其中2 個(gè)變量不變,麩皮多糖產(chǎn)量隨著另外2 個(gè)變量水平的增加,呈現(xiàn)上升到一定程度后下降的趨勢。對應(yīng)麩皮多糖產(chǎn)量最大值都在120 mg/kg以上。

        2.2.2 最佳發(fā)酵條件及驗(yàn)證

        由Minitab 17統(tǒng)計(jì)分析軟件中響應(yīng)面優(yōu)化器得到:當(dāng)發(fā)酵溫度35.4 ℃、發(fā)酵時(shí)間52.7 h、總接種量10.4%、料水比1∶1.16時(shí),發(fā)酵產(chǎn)物中麩皮多糖含量的理論值為132.9 mg/g。用得到的最佳發(fā)酵條件進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),6 次平行實(shí)驗(yàn)得到發(fā)酵產(chǎn)物中實(shí)際麩皮多糖含量為130.21 mg/g,與理論值相差2%,說明此模型有效且優(yōu)化結(jié)果可靠。較未發(fā)酵底物中麩皮多糖含量(27.01 mg/g)提高了3.8 倍。

        2.3 麩皮多糖的抗炎活性分析

        2.3.1 血漿中炎性因子指標(biāo)

        表4 麩皮多糖粗制品對大鼠血漿中IL-1β、IL-2、IL-6和TNF-α含量的影響Table4 Effects of polysaccharides from fermented wheat bran on the levels of IL-1β, IL-2, IL-6 and TNF-α in the plasma of rats pg/mL

        如表4所示,與CT組相比,NC組血漿中IL-1β、IL-2、IL-6和TNF-α含量顯著升高(P<0.05)。CL組中IL-1β含量顯著低于NC組(P<0.05),與CT組差異不顯著(P>0.05);CM組中的IL-1β和TNF-α含量顯著低于NC組(P<0.05),與CT組差異不顯著(P>0.05);CH組中的IL-1β、IL-2和TNF-α含量顯著低于NC組(P<0.05),且與CT組差異不顯著(P>0.05);PC組IL-1β含量顯著低于NC組(P<0.05),與CT組差異不顯著(P>0.05)。這表明灌胃發(fā)酵制備的麩皮多糖可以緩解由diquet引起的大鼠血漿中炎性因子含量的升高,并且隨著灌服劑量的升高,大鼠血漿中炎性因子含量逐漸恢復(fù)至正常水平。

        2.3.2 肝臟中炎性因子指標(biāo)

        表5 麩皮多糖粗制品對肝臟中IL-1β、IL-2、IL-6和TNF-α含量的影響Table5 Effects of polysaccharides from fermented wheat bran on the levels of IL-1β, IL-2, IL-6 and TNF-α in the liver of rats pg/mg

        如表5所示,與CT組相比,NC組肝臟中IL-1β、IL-2、IL-6和TNF-α含量顯著升高(P<0.05)。CL組中的IL-1β、IL-6和TNF-α含量顯著低于NC組(P<0.05),但顯著高于CT組(P<0.05);CM組IL-1β、IL-6和TNF-α含量顯著低于NC組(P<0.05),且與CT組差異不顯著(P>0.05);CH組IL-1β、IL-2、IL-6和TNF-α含量顯著低于NC組(P<0.05),且與CT組差異不顯著(P>0.05);PC組IL-1β含量顯著低于NC組(P<0.05),與CT組差異不顯著(P>0.05)。這表明灌胃發(fā)酵制備的麩皮多糖可以緩解由diquet引起的大鼠肝臟組織中炎性因子含量的升高,并且隨著灌服劑量的升高,大鼠肝臟組織中炎性因子含量逐漸恢復(fù)至正常水平。

        3 討論與結(jié)論

        釀酒酵母CGMCC 2.119具有同化五碳糖的特點(diǎn),可在玉米芯水解液中生長[29]??莶菅挎邨U菌則能夠產(chǎn)生蛋白酶、α-淀粉酶、纖維素酶、β-葡聚糖酶、植酸酶、果膠酶和木聚糖酶等十幾種酶[30]。并根據(jù)前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn),混合菌種發(fā)酵麩皮多糖產(chǎn)量為64.91 mg/g,而釀酒酵母和枯草芽孢桿菌作為單一菌種發(fā)酵麩皮多糖產(chǎn)量分別為31.07 mg/g和30.60 mg/g,兩種菌混合發(fā)酵制備的麩皮多糖產(chǎn)量顯著高于單一菌種發(fā)酵,因此,本實(shí)驗(yàn)選取釀酒酵母和枯草芽孢桿菌作為混合菌種發(fā)酵生產(chǎn)麩皮多糖。對于固態(tài)發(fā)酵這樣一種復(fù)雜的生化過程來說,發(fā)酵條件是一個(gè)重要的影響參數(shù),直接影響發(fā)酵產(chǎn)品的品質(zhì)。不同的發(fā)酵菌種由于其自身的菌種特異性,需要不同的發(fā)酵條件以完成生長代謝和發(fā)酵產(chǎn)物的生成。尤其在混菌發(fā)酵過程中,由于不同的發(fā)酵菌種有不同的最適發(fā)酵條件,為了使發(fā)酵效果最好,得到更多的目的產(chǎn)物就必須對混菌發(fā)酵的發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化,本研究通過結(jié)合單因素法和響應(yīng)面優(yōu)化法快速、準(zhǔn)確地確定發(fā)酵需要的適當(dāng)條件,并且優(yōu)化后理論值與實(shí)際值基本一致,說明利用響應(yīng)面法優(yōu)化本實(shí)驗(yàn)條件是有效的。

        機(jī)體處于氧化應(yīng)激狀態(tài)時(shí),會(huì)產(chǎn)生大量的炎癥介質(zhì)和細(xì)胞因子擴(kuò)大氧化應(yīng)激造成組織器官的損害[31]。敵草快是二吡啶基除草劑,它能利用分子氧產(chǎn)生超氧陰離子和過氧化氫,繼而產(chǎn)生其他自由基,誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生氧化應(yīng)激[32]。在本實(shí)驗(yàn)中,diquat作為攻毒劑,腹腔注射后可以激活炎性細(xì)胞,促進(jìn)如TNF-α、IL-1β、IL-2和IL-6等炎性細(xì)胞因子的合成和釋放,導(dǎo)致血漿和肝臟組織中的炎癥因子水平顯著提高(P<0.05)。麩皮多糖灌胃處理組的大鼠,血漿和肝臟組織中其部分炎性細(xì)胞因子水平顯著降低(P<0.05),并且表現(xiàn)出隨麩皮多糖灌胃劑量的升高而降低效果更顯著,逐漸恢復(fù)到正常水平。Kang等[33]研究發(fā)現(xiàn),經(jīng)酶處理釋放阿拉伯木聚糖的麥麩可以有效抑制由LPS引起的小鼠血清TNF-α和IL-6等炎性細(xì)胞因子的升高趨勢,表現(xiàn)出一定的抗炎作用,這一結(jié)果與本研究結(jié)果一致。

        本研究在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,經(jīng)響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化,以釀酒酵母以及枯草芽孢桿菌為發(fā)酵菌種制備麩皮多糖的最適發(fā)酵工藝條件為發(fā)酵溫度35.4 ℃、發(fā)酵時(shí)間52.7 h、總接種量10.4%、料水比1∶1.16,該條件下麩皮多糖產(chǎn)量為130.21 mg/g。以diquat攻毒建立大鼠炎癥模型,發(fā)現(xiàn)麩皮多糖可以有效緩解大鼠血液和肝臟組織中TNF-α、IL-6、IL-2和IL-1β炎性因子水平的升高,表現(xiàn)出一定的抗炎作用。

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