王 園，史俊祥，段元霄，張倩茹，孟子琪，李 暄，安曉萍*，齊景偉*

（內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學動物科學學院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018）

小麥麩皮是小麥加工面粉的副產(chǎn)物，是小麥提取胚芽和胚乳后的剩余部分，主要由小麥的皮層和糊粉層組成[1]。除含有一定數(shù)量的淀粉、蛋白質(zhì)、脂肪外，麩皮主要含有46%左右的非淀粉多糖[2-3]，包括果膠多糖、纖維素多糖以及由阿拉伯木聚糖、混合鏈β-葡聚糖、葡甘露聚糖、半乳聚糖、木聚糖等組成的非纖維素多糖[4]。大量研究表明，麩皮非淀粉多糖中的非纖維多糖具有諸多生物活性，包括抑菌[5]、抗氧化[6-8]、免疫調(diào)節(jié)[9-11]和益生作用等[12-14]，故又將此類多糖稱為麩皮活性多糖，簡稱麩皮多糖。

隨著研究應用的不斷深入，麥麩多糖已經(jīng)在食品工業(yè)、發(fā)酵工業(yè)等領域嶄露頭角。麥麩多糖的傳統(tǒng)提取方法主要有物理法[15-16]、化學法[17-19]和酶法[20-21]等。近幾年，微生物發(fā)酵法得到廣泛應用[22-23]，與其他方法相比，該方法具有成本低、條件溫和、不受設備限制且多糖轉(zhuǎn)化率較高的優(yōu)點。

目前，微生物發(fā)酵法制備麩皮多糖采用的菌種多為食用菌和霉菌[24-25]，以非霉系菌種作為發(fā)酵菌種的報道較少，祁紅兵等[26]研究了以納豆芽孢桿菌作為發(fā)酵菌株固態(tài)發(fā)酵麩皮的抗氧化活性。崔晨曉等[27]研究了酵母菌發(fā)酵小麥麩皮中可溶性阿拉伯木聚糖和總酚含量。本實驗以釀酒酵母以及枯草芽孢桿菌為發(fā)酵菌種固態(tài)發(fā)酵小麥麩皮制備麩皮多糖，通過響應面法確定最佳發(fā)酵工藝參數(shù)，并通過敵草快攻毒建立大鼠模型研究制備的麩皮多糖的抗炎活性，以期為在生產(chǎn)中將麩皮多糖應用于改善動物健康狀況、促進其生長提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

釀酒酵母CGMCC 2.119以及枯草芽孢桿菌CGMCC 1.892為動物科學學院水產(chǎn)實驗室保存；麩皮、豆粕粉和玉米粉均購于市場；乙醇、苯酚、濃硫酸、尿素、葡萄糖均為國產(chǎn)分析純；營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、麥芽汁液體培養(yǎng)基廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；無菌級Wistar大鼠內(nèi)蒙古大學動物實驗中心。

1.2 儀器與設備

手提式壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫(yī)療器械廠；SW-CJ超凈工作臺 上海新苗醫(yī)療器械公司；GX2型智力光照培養(yǎng)箱 寧波東南儀器有限公司；SH2-82旋轉(zhuǎn)氣浴恒溫振蕩器 金壇市岸頭中旺實驗儀器廠；TG16-WS臺式高速離心機 湖南湘儀儀器開發(fā)有限公司；電熱恒溫水浴鍋 上海醫(yī)療器械有限公司；微孔板分光光度計美國伯騰儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 底物配制

枯草芽孢桿菌種子液的制備：將保藏的枯草芽孢桿菌接種于滅菌（121 ℃，0.1 MPa）的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，培養(yǎng)24 h（37 ℃，120 r/min），使菌體濃度達到108CFU/mL。釀酒酵母種子液的制備：將保藏的釀酒酵母接種于滅菌（121 ℃，0.1 MPa）的麥芽汁培養(yǎng)基中，培養(yǎng)24 h（37 ℃，120 r/min），使菌體濃度達到108CFU/mL。復合菌種液含有釀酒酵母和枯草芽孢桿菌，比例為6.73∶3.26，總接種量10%?；A發(fā)酵底物為麩皮 80.46%、豆粕粉9.32%和玉米粉10.22%，料水比為1∶1。

1.3.2 單因素試驗設計

分別研究確定發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間、總接種量和料水比對麩皮多糖產(chǎn)量的影響。根據(jù)預實驗結(jié)果，發(fā)酵溫度設定為25、30、35、40 ℃和45 ℃；發(fā)酵時間設定為24、36、48、60 h和72 h；總接種量為5%、7.5%、10%、12.5%和15%；料水比為1∶0.5、1∶1、1∶1.5、1∶2和1∶2.5（g/mL）。

1.3.3 響應面優(yōu)化試驗

在單因素試驗基礎上，確定發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間、總接種量和料水比的取值范圍，采用Box-Behnken試驗設計4因素3水平的響應面分析試驗，以發(fā)酵底物中麩皮多糖產(chǎn)量為響應值，利用Minitab 17軟件對數(shù)據(jù)進行分析，得出微生物發(fā)酵法制備麩皮多糖的最佳發(fā)酵工藝。響應面試驗因素與水平設計見表1。

表1 響應面試驗因素與水平Table1 Coded levels of independent variables used in Box-Behnken design

1.3.4 麩皮多糖的提取制備

發(fā)酵麩皮濕樣于45 ℃烘箱中烘干24 h后粉碎，10 g干燥發(fā)酵麩皮加入200 mL水中，80 ℃水浴30 min，離心取上清液，上清液加入4 倍體積的95%乙醇溶液，靜置過夜，離心收集沉淀，沉淀烘干即為麩皮多糖；沉淀用蒸餾水復溶后即得麩皮多糖溶液。

1.3.5 麩皮多糖含量的測定

采用苯酚-硫酸法測定麩皮多糖產(chǎn)量[28]。麩皮多糖產(chǎn)量按下式計算：

1.3.6 麩皮多糖抗炎活性分析

1.3.6.1 動物實驗設計

選用雄性Wistar大鼠36 只經(jīng)過1 周的適應期，按實驗要求將大鼠隨機分為6 組。低劑量組（low-dose，CL）、中劑量組（middle-dose，CM）和高劑量組（high-dose，CH）：每天按大鼠體質(zhì)量分別灌服100、200、400 mg/kg麩皮多糖；正對照組（positive control，PC）：100 mg/kg VC；負對照組（negative control，NC）：空白攻毒；正常對照組（control，CT）：空白不攻毒。實驗期14 d。實驗結(jié)束當天，除CT組外，其他5 組大鼠按體質(zhì)量腹腔注射diquat 0.1 mmol/kg，CT組注射等量生理鹽水，攻毒24 h后屠宰。

1.3.6.2 血漿和組織樣品的制備

大鼠攻毒前禁食12 h，自由飲水，攻毒后24 h后乙醚致暈，心臟采血，并采集肝臟樣本。血液樣品采集后立即放置在冰盒中，3 000 r/min離心10 min后，-20 ℃保存。肝臟樣本用生理鹽水洗凈后，裝入無菌采樣袋，浸入液氮，取出后-80 ℃冷凍保存。測定時，用含NaCl質(zhì)量分數(shù)為0.86%磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buered solution，PBS）（0.01 mol/L，pH 7.4）勻漿，3 000 r/min離心10 min后得到的上清液用于炎性因子指標測定。

1.3.6.3 炎性指標的測定

腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）、白細胞介素-2（interleukin-2，IL-2）和白細胞介素-6（interleukin-6，IL-6）根據(jù)定量測定試劑盒（武漢基因美生物科技有限公司）的說明，進行酶聯(lián)免疫吸附實驗（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用Minitab 17軟件進行響應面試驗設計及結(jié)果分析；SAS 8.1統(tǒng)計軟件ANOVA模型進行單因素方差分析，用Duncan’s檢驗進行多重比較，P＜0.05為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 發(fā)酵溫度對麩皮多糖產(chǎn)量的影響

圖1 發(fā)酵溫度對麩皮多糖產(chǎn)量的影響Fig.1 Effect of fermentation temperature on the yield of polysaccharides

由圖1可知，當發(fā)酵溫度在25～45 ℃范圍內(nèi)變化時，發(fā)酵底物中麩皮多糖產(chǎn)量呈先增加后減少的趨勢。發(fā)酵溫度為35 ℃時達到最大值，其麩皮多糖產(chǎn)量為123.44 mg/g，且顯著高于其他溫度（P＜0.05）。因此，以發(fā)酵溫度35 ℃作為響應面優(yōu)化試驗的發(fā)酵溫度中心點。

2.1.2 發(fā)酵時間對麩皮多糖產(chǎn)量的影響

圖2 發(fā)酵時間對麩皮多糖產(chǎn)量的影響Fig.2 Effect of fermentation time on the yield of polysaccharides

由圖2可知，隨著發(fā)酵時間的延長，發(fā)酵底物中麩皮多糖產(chǎn)量呈先增大后減小的趨勢。在發(fā)酵第48小時達到最大值，其麩皮多糖產(chǎn)量為128.05 mg/g，且顯著高于其他時間（P＜0.05）。因此，以第48小時作為響應面優(yōu)化試驗的發(fā)酵時間中心點。

2.1.3 總接種量對麩皮多糖產(chǎn)量的影響

圖3 總接種量對麩皮多糖產(chǎn)量的影響Fig.3 Effect of inoculum size on the yield of polysaccharides

由圖3可知，隨著總接種量的增加，發(fā)酵底物中麩皮多糖產(chǎn)量呈先增大后減小的趨勢。在總接種量為10%時達到最大值，其麩皮多糖產(chǎn)量為124.89 mg/g，且顯著高于其他總接種量（P＜0.05）；因此，以10%總接種量作為響應面優(yōu)化試驗的總接種量中心點。

2.1.4 料水比對麩皮多糖產(chǎn)量的影響

圖4 料水比對麩皮多糖產(chǎn)量的影響Fig.4 Effect of solid-to-water ratio on the yield of polysaccharides

由圖4可知，隨著溶劑用量的增加，發(fā)酵底物中麩皮多糖產(chǎn)量呈先增大后減小的趨勢，在料水比為1∶1達到最大值，其麩皮多糖產(chǎn)量為122.33 mg/g，且顯著高于其他料水比（P＜0.05）；因此，以料水比1∶1作為響應面優(yōu)化試驗的料水比中心點。

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2.2 響應面優(yōu)化試驗結(jié)果及方差分析

2.2.1 響應面試驗結(jié)果

結(jié)合單因素試驗結(jié)果，選取對發(fā)酵底物中麩皮多糖產(chǎn)量影響顯著的4 個因素發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間、總接種量和料水比，采用4因素3水平的Box-Behnken試驗設計及分析方法進行提取條件的優(yōu)化，試驗設計方案及結(jié)果見表2。

表2 響應面試驗設計與結(jié)果Table2 Box-Behnken design with response variable

利用Minitab 17統(tǒng)計分析軟件，對表3中試驗數(shù)據(jù)經(jīng)多元回歸擬合，獲得發(fā)酵產(chǎn)物中麩皮多糖產(chǎn)量（Y）對4 個因素的二次回歸模型方程為：Y=126.60+5.96A+14.66B+5.49C+18.11D-37.20A2-24.07B2-33.77C2-35.16D2-3.16AB+1.66AC-0.89AD+11.22BC+6.76BD+6.56CD。

如表3所示，回歸模型極顯著（P＜0.01），失擬項不顯著（P=0.247＞0.05），說明該回歸模型擬合程度良好，試驗誤差小。復相關系數(shù)R2為96.36%，該模型預測性良好。一次項對發(fā)酵產(chǎn)物中麩皮多糖產(chǎn)量影響顯著，從F值可知，4因素對發(fā)酵產(chǎn)物中麩皮多糖產(chǎn)量影響的順序為：料水比（D）＞發(fā)酵時間（B）＞發(fā)酵溫度（A）＞總接種量（C）。

表3 回歸模型方差分析Table3 Analysis of variance of regression model

兩因素交互作用中，BC對發(fā)酵產(chǎn)物中麩皮多糖產(chǎn)量影響顯著（P＜0.05），其他兩因素交互作用對發(fā)酵產(chǎn)物中麩皮多糖產(chǎn)量影響不顯著（P＞0.05）。二次項A2、B2、C2對發(fā)酵產(chǎn)物中麩皮多糖產(chǎn)量均有極顯著影響（P＜0.05），進一步說明各具體試驗因素對發(fā)酵產(chǎn)物中麩皮多糖產(chǎn)量的影響不是簡單的線性關系。

圖5 各交互因素對發(fā)酵產(chǎn)物中麩皮多糖產(chǎn)量影響的響應面Fig.5 Response surface plots showing the interactive effects of various factors on the yield of polysaccharides

由圖5可知，4 個變量在兩兩交互時，保持其中2 個變量不變，麩皮多糖產(chǎn)量隨著另外2 個變量水平的增加，呈現(xiàn)上升到一定程度后下降的趨勢。對應麩皮多糖產(chǎn)量最大值都在120 mg/kg以上。

2.2.2 最佳發(fā)酵條件及驗證

由Minitab 17統(tǒng)計分析軟件中響應面優(yōu)化器得到：當發(fā)酵溫度35.4 ℃、發(fā)酵時間52.7 h、總接種量10.4%、料水比1∶1.16時，發(fā)酵產(chǎn)物中麩皮多糖含量的理論值為132.9 mg/g。用得到的最佳發(fā)酵條件進行驗證實驗，6 次平行實驗得到發(fā)酵產(chǎn)物中實際麩皮多糖含量為130.21 mg/g，與理論值相差2%，說明此模型有效且優(yōu)化結(jié)果可靠。較未發(fā)酵底物中麩皮多糖含量（27.01 mg/g）提高了3.8 倍。

2.3 麩皮多糖的抗炎活性分析

2.3.1 血漿中炎性因子指標

表4 麩皮多糖粗制品對大鼠血漿中IL-1β、IL-2、IL-6和TNF-α含量的影響Table4 Effects of polysaccharides from fermented wheat bran on the levels of IL-1β, IL-2, IL-6 and TNF-α in the plasma of rats pg/mL

如表4所示，與CT組相比，NC組血漿中IL-1β、IL-2、IL-6和TNF-α含量顯著升高（P＜0.05）。CL組中IL-1β含量顯著低于NC組（P＜0.05），與CT組差異不顯著（P＞0.05）；CM組中的IL-1β和TNF-α含量顯著低于NC組（P＜0.05），與CT組差異不顯著（P＞0.05）；CH組中的IL-1β、IL-2和TNF-α含量顯著低于NC組（P＜0.05），且與CT組差異不顯著（P＞0.05）；PC組IL-1β含量顯著低于NC組（P＜0.05），與CT組差異不顯著（P＞0.05）。這表明灌胃發(fā)酵制備的麩皮多糖可以緩解由diquet引起的大鼠血漿中炎性因子含量的升高，并且隨著灌服劑量的升高，大鼠血漿中炎性因子含量逐漸恢復至正常水平。

2.3.2 肝臟中炎性因子指標

表5 麩皮多糖粗制品對肝臟中IL-1β、IL-2、IL-6和TNF-α含量的影響Table5 Effects of polysaccharides from fermented wheat bran on the levels of IL-1β, IL-2, IL-6 and TNF-α in the liver of rats pg/mg

如表5所示，與CT組相比，NC組肝臟中IL-1β、IL-2、IL-6和TNF-α含量顯著升高（P＜0.05）。CL組中的IL-1β、IL-6和TNF-α含量顯著低于NC組（P＜0.05），但顯著高于CT組（P＜0.05）；CM組IL-1β、IL-6和TNF-α含量顯著低于NC組（P＜0.05），且與CT組差異不顯著（P＞0.05）；CH組IL-1β、IL-2、IL-6和TNF-α含量顯著低于NC組（P＜0.05），且與CT組差異不顯著（P＞0.05）；PC組IL-1β含量顯著低于NC組（P＜0.05），與CT組差異不顯著（P＞0.05）。這表明灌胃發(fā)酵制備的麩皮多糖可以緩解由diquet引起的大鼠肝臟組織中炎性因子含量的升高，并且隨著灌服劑量的升高，大鼠肝臟組織中炎性因子含量逐漸恢復至正常水平。

3 討論與結(jié)論

釀酒酵母CGMCC 2.119具有同化五碳糖的特點，可在玉米芯水解液中生長[29]?？莶菅挎邨U菌則能夠產(chǎn)生蛋白酶、α-淀粉酶、纖維素酶、β-葡聚糖酶、植酸酶、果膠酶和木聚糖酶等十幾種酶[30]。并根據(jù)前期實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，混合菌種發(fā)酵麩皮多糖產(chǎn)量為64.91 mg/g，而釀酒酵母和枯草芽孢桿菌作為單一菌種發(fā)酵麩皮多糖產(chǎn)量分別為31.07 mg/g和30.60 mg/g，兩種菌混合發(fā)酵制備的麩皮多糖產(chǎn)量顯著高于單一菌種發(fā)酵，因此，本實驗選取釀酒酵母和枯草芽孢桿菌作為混合菌種發(fā)酵生產(chǎn)麩皮多糖。對于固態(tài)發(fā)酵這樣一種復雜的生化過程來說，發(fā)酵條件是一個重要的影響參數(shù)，直接影響發(fā)酵產(chǎn)品的品質(zhì)。不同的發(fā)酵菌種由于其自身的菌種特異性，需要不同的發(fā)酵條件以完成生長代謝和發(fā)酵產(chǎn)物的生成。尤其在混菌發(fā)酵過程中，由于不同的發(fā)酵菌種有不同的最適發(fā)酵條件，為了使發(fā)酵效果最好，得到更多的目的產(chǎn)物就必須對混菌發(fā)酵的發(fā)酵條件進行優(yōu)化，本研究通過結(jié)合單因素法和響應面優(yōu)化法快速、準確地確定發(fā)酵需要的適當條件，并且優(yōu)化后理論值與實際值基本一致，說明利用響應面法優(yōu)化本實驗條件是有效的。

機體處于氧化應激狀態(tài)時，會產(chǎn)生大量的炎癥介質(zhì)和細胞因子擴大氧化應激造成組織器官的損害[31]。敵草快是二吡啶基除草劑，它能利用分子氧產(chǎn)生超氧陰離子和過氧化氫，繼而產(chǎn)生其他自由基，誘導機體產(chǎn)生氧化應激[32]。在本實驗中，diquat作為攻毒劑，腹腔注射后可以激活炎性細胞，促進如TNF-α、IL-1β、IL-2和IL-6等炎性細胞因子的合成和釋放，導致血漿和肝臟組織中的炎癥因子水平顯著提高（P＜0.05）。麩皮多糖灌胃處理組的大鼠，血漿和肝臟組織中其部分炎性細胞因子水平顯著降低（P＜0.05），并且表現(xiàn)出隨麩皮多糖灌胃劑量的升高而降低效果更顯著，逐漸恢復到正常水平。Kang等[33]研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)酶處理釋放阿拉伯木聚糖的麥麩可以有效抑制由LPS引起的小鼠血清TNF-α和IL-6等炎性細胞因子的升高趨勢，表現(xiàn)出一定的抗炎作用，這一結(jié)果與本研究結(jié)果一致。

本研究在單因素試驗的基礎上，經(jīng)響應面試驗優(yōu)化，以釀酒酵母以及枯草芽孢桿菌為發(fā)酵菌種制備麩皮多糖的最適發(fā)酵工藝條件為發(fā)酵溫度35.4 ℃、發(fā)酵時間52.7 h、總接種量10.4%、料水比1∶1.16，該條件下麩皮多糖產(chǎn)量為130.21 mg/g。以diquat攻毒建立大鼠炎癥模型，發(fā)現(xiàn)麩皮多糖可以有效緩解大鼠血液和肝臟組織中TNF-α、IL-6、IL-2和IL-1β炎性因子水平的升高，表現(xiàn)出一定的抗炎作用。