蘇 敏，樸春紅,*，梁德春*，初 琦，王玉華，王 尚，陳 月，胡 洋，霍 越

（1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，吉林 長春 130118；2.韓國慶熙大學(xué)人參資源中心，韓國 京畿道水源 449-701）

人參皂苷是人參（Panax ginseng C. A. Mey. entum）中主要生物活性成分之一，屬于四環(huán)三萜皂苷，結(jié)構(gòu)上由苷元與糖連接而成，由于苷元結(jié)構(gòu)類型、糖基的數(shù)量和位置的不同，其性質(zhì)和功能具有很大差異[1]。將人參中含量豐富的人參皂苷（Rb1、Rb2、Rc、Rd、Re、Rg1、Rf等）轉(zhuǎn)化為藥用價值更高、腸道吸收功能更強的稀有人參皂苷（Rh1、Rh2、F1、F2、Rg3、Rb3、Rh2、compound K等）成為現(xiàn)代研究的重點之一[2]，其中稀有人參皂苷Rg3具有抑制腫瘤細胞增殖、浸潤、轉(zhuǎn)移作用，抑制胃癌誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細胞增殖作用等備受關(guān)注[3]。然而自然生長的人參中人參皂苷Rg3含量極少[4]，可以通過化學(xué)法、酶法和微生物法達到轉(zhuǎn)化的目的。微生物法轉(zhuǎn)化原理主要在于微生物所分泌的β-葡萄糖苷酶為主的酶系對人參皂苷進行轉(zhuǎn)化。人參皂苷Rb1與人參皂苷Rg3相比，只在C-20位上多出2 個葡萄糖基[5]，利用β-葡萄糖苷酶轉(zhuǎn)移葡萄糖基的作用[6]，可以將人參皂苷Rb1轉(zhuǎn)化為人參皂苷Rg3（圖1）[7]。邵巍等[8]研究利用β-葡萄糖苷酶將人參皂苷Rb1的C-21位2 個—GLc鍵水解，進而轉(zhuǎn)化為稀有人參皂苷Rg3；閆炳雄等[9]研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)黑曲霉發(fā)酵人參后，也可生成人參皂苷Rg3，并得到較好的轉(zhuǎn)化效果。

圖1 人參皂苷Rg3轉(zhuǎn)化途徑[7]Fig.1 Transformation pathway of ginsenoside Rg3

kefir粒是一種多菌種共生的可食用微生物資源，研究表明kefir粒發(fā)酵液中含有β-葡萄糖苷酶在內(nèi)的豐富酶系[10-11]，其中β-葡萄糖苷酶是轉(zhuǎn)化人參皂苷的重要酶之一[12-13]，但目前利用kefir粒發(fā)酵人參的研究鮮有報道。本項目組利用kefir粒發(fā)酵全組分人參漿，研究發(fā)現(xiàn)其香氣成分發(fā)生明顯變化，人參感官品質(zhì)得到顯著改善，人參總皂苷含量也得以提高[14]，本實驗采用改良七葉苷瓊脂糖培養(yǎng)基，從kef i r粒發(fā)酵人參漿中分離出β-葡萄糖苷酶菌株，并優(yōu)化該菌株發(fā)酵人參轉(zhuǎn)化稀有人參皂苷Rg3的發(fā)酵工藝。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

人參（4 a生）產(chǎn)于吉林省汪清縣；kefir粒為本實驗室保存菌種；伊利純牛乳 市售。

人參皂苷Rb1（140518）、Rd（CAS號：52705-93-8）、Rg3（CAS號：14197-60-5）（純度≥98%） 南京景竹生物有限公司；硅膠60薄層板 德國Merk公司；Taq DNA聚合酶、Ezup柱式酵母基因組DNA抽提試劑盒、DNA Ladder Mix marker 生工生物工程（上海）股份有限公司；乙腈、甲醇為色譜純，其他試劑為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

LC-20AT高效液相色譜儀、CS-9301PC薄層掃描儀日本島津公司；AppLied Biosystems 3730XLDNA電泳槽、DYCP-31DN穩(wěn)壓電泳儀 北京六一儀器廠；DYY-5電熱恒溫水槽 上海一恒科學(xué)儀器有限公司；DK-8D凝膠成像儀 上海復(fù)日科技儀器有限公司；FR980恒溫培養(yǎng)箱 太倉市科教器材廠；DHP-9162恒溫搖床 太倉市實驗設(shè)備廠。

1.3 方法

1.3.1 培養(yǎng)基制備

改良七葉苷瓊脂糖培養(yǎng)基的配制參照宋欣等[15]的方法改良，配方為1 g七葉苷、0.5 g檸檬酸鐵、2 g酵母膏、0.5 g蛋白胨、20 g瓊脂，經(jīng)121 ℃高壓蒸氣滅菌20 min；種子培養(yǎng)基配方為10 g酵母粉、20 g蛋白胨、20 g葡萄糖、20 g瓊脂、1 000 mL蒸餾水、調(diào)至pH 6.0、經(jīng)121 ℃高壓蒸氣滅菌20 min；人參漿制備方法為挑選無病蟲害的完整鮮人參，清洗干凈，蒸制20 min，按照人參-水質(zhì)量比1∶2、5 000 r/min多次點動共計3 min打漿，110 ℃滅菌20 min。

1.3.2 產(chǎn)β-葡萄糖苷酶菌株的篩選與鑒定

形態(tài)結(jié)構(gòu)鑒定：kefir粒在28 ℃條件下發(fā)酵人參漿48 h后，將其按10-3、10-4、10-5、10-64 個梯度稀釋，各取50 μL菌液均勻涂布于改良七葉苷培養(yǎng)基，25 ℃培養(yǎng)48 h，菌落周圍出現(xiàn)黑色的水解斑則為產(chǎn)β-葡萄糖苷酶菌株[16]。

分子鑒定方法：26S rDNA D1/D2區(qū)的序列分析是按照Jespersen[17]和Baleiras[18]等的方法。待測菌株DNA提取采用SK8257試劑盒操作；使用引物為NL1（5’-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3’）和NL4（5’-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3’），由生工生物工程（上海）股份有限公司合成引物和序列測定，所得菌株DNA序列信息在NCBI上BLAST比對分析。PCR反應(yīng)體系（25 μL）：包括基因組DNA（20～50 ng/μL）0.5 μL，10×Buffer（含有Mg2+）2.5 μL，dNTP（各2.5 mmol/L）1 μL，Taq DNA聚合酶0.2 μL、上游引物（10 μmol/L）0.5 μL，下游引物（10 μmol/L）0.5 μL，加雙蒸水至25 μL；PCR反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性4 min、94 ℃延伸45 s；55 ℃延伸45 s；72 ℃延伸1 min；30 個循環(huán)；72 ℃修復(fù)延伸10 min。PCR擴增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，電泳條件為150 V、100 mA、20 min，使用凝膠成像儀觀察結(jié)果。

1.3.3 人參漿全組分的發(fā)酵

將全人參培養(yǎng)基以5 mL/100 g的接種量接種107CFU/mL的馬克斯克魯維酵母菌，28 ℃培養(yǎng)48 h。由于本研究策略是盡可能不加大體系體積的前提下，提高稀有人參皂苷的含量，且前期實驗表明搖床培養(yǎng)和靜置培養(yǎng)對Rg3的含量變化不顯著，因此實驗采用靜置培養(yǎng)。同等培養(yǎng)條件下加入相等體積的無菌水作為未發(fā)酵人參空白對照組。發(fā)酵結(jié)束后立即冷凍，隨后使用真空冷凍進行干燥，干燥后將樣品真空包裝，-4 ℃儲存?zhèn)溆肹19]。

1.3.4 全組分發(fā)酵人參漿中總?cè)藚⒃碥盏奶崛?/p>

取發(fā)酵人參漿凍干粉末1 g，利用索氏提取法，三氯甲烷加熱回流3 h后，棄去三氯甲烷，揮干溶劑，移入100 mL錐形瓶中，加入50 mL飽和正丁醇，靜置過夜后，超聲處理（功率250 W，頻率50 Hz）30 min，過濾后取濾液25 mL，置于蒸發(fā)皿中蒸干，干燥物中加入少量甲醇溶液完全溶解后轉(zhuǎn)入5 mL容量瓶定容后用于檢測[20]。將各人參皂苷標(biāo)品溶于100%甲醇中制得0.2 mg/mL溶液用于皂苷的分析[21]。

1.3.5 人參皂苷的測定

1.3.5.1 高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法

將1.3.4節(jié)中的總?cè)藚⒃碥仗崛∫河?.22 μm微孔濾膜過濾后，利用HPLC進行分析。分析條件：C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；柱溫35 ℃；進樣量10 μL；流速1 mL/min；流動相A為5%磷酸溶液、B為乙腈，洗脫條件是0～45 min，33% B；45～80 min，49% B；檢測波長為203 nm[22]。

1.3.5.2 薄層層析（thin layer chromatography，TLC）法

將人參皂苷點樣于TLC硅膠板上，展開劑為氯仿-甲醇-水（10∶5∶1，V/V）[23]，噴20%硫酸-乙醇溶液后于110 ℃顯色5 min。用薄層掃描儀掃描其灰度，按下式計算皂苷轉(zhuǎn)化率：

式中：A為未發(fā)酵樣品灰分質(zhì)量；B為發(fā)酵后樣品灰分質(zhì)量。

1.3.6 單因素試驗

考察人參-水質(zhì)量比、pH值、接種量、發(fā)酵時間對轉(zhuǎn)化人參皂苷Rg3含量的影響。人參皂苷Rg3含量表示1 g人參干質(zhì)量含有的稀有人參皂苷Rg3含量。以轉(zhuǎn)化人參皂苷Rg3含量為考核指標(biāo)，確定各單因素試驗合適的發(fā)酵條件，為轉(zhuǎn)化人參皂苷Rg3的條件優(yōu)化提供參考范圍，試驗設(shè)計設(shè)置3 個平行。

1.3.7 響應(yīng)面試驗

篩選得到的菌株轉(zhuǎn)化人參皂苷Rg3單因素試驗的基礎(chǔ)上，采用Box-Behnken設(shè)計試驗因素與水平（表1），試驗結(jié)果用Design Expert 8.1分析，確定各因素及因素之間的交互作用對人參皂苷Rg3含量的影響，優(yōu)化其工藝條件[24]。

表1 Box-Behnken試驗因素與水平Table1 Factors and levels used in Box-Behnken design

1.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計

采用MEGA5.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，采用Design Expert 8.1響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計。數(shù)據(jù)以 ±s表示，采用Microsoft Excel 2010處理數(shù)據(jù)，用GraphPad Prism5.0制圖，應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計分析數(shù)據(jù)，組間比較采用單因素方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 kef i r粒發(fā)酵人參液中稀有人參皂苷Rg3含量的變化

HPLC法分析人參稀有皂苷發(fā)現(xiàn)人參皂苷Rg3保留時間與Rh2、compound K的基本一致，紫外檢測器條件下無法精確分析其變化。因此將HPLC法與TLC法相結(jié)合分析人參漿中人參皂苷Rg3的轉(zhuǎn)化情況。人參皂苷Rg3有多種轉(zhuǎn)化途徑，其中一條轉(zhuǎn)化途徑為人參皂苷Rb1→Rd→Rg3[25]。本實驗測定5%接種量kef i r粒發(fā)酵人參漿，28 ℃培養(yǎng)3 d后，發(fā)酵人參漿中人參皂苷Rb1、Rd和Rg3變化結(jié)果如表2所示。kef i r粒發(fā)酵后大大增加了Rg3的含量，稀有皂苷Rg3提高了134.7%。同時，發(fā)酵人參中人參皂苷Rb1比未發(fā)酵組降低了41.3%，人參皂苷Rd提高了104.5%。因此可以推測，kefir粒發(fā)酵人參轉(zhuǎn)化人參皂苷Rg3可能的轉(zhuǎn)化途徑為Rb1→Rd→Rg3，研究表明β-葡萄糖苷酶在該轉(zhuǎn)化途徑中起重要作用[19]。

表2 ke fi r粒發(fā)酵人參皂苷含量Table2 Ginsenoside content in ke fi r fermented ginseng mg/g

2.2 產(chǎn)β-葡萄糖苷酶菌種的篩選

kefir粒發(fā)酵人參菌液涂布于改良七葉苷培養(yǎng)基上培養(yǎng)36 h后，篩選出產(chǎn)黑色水解斑的菌株C21（圖2A），判斷其為產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的菌種。在七葉苷培養(yǎng)基中產(chǎn)黑色水解斑的菌落，進行形態(tài)結(jié)構(gòu)鑒定，挑取單一菌落經(jīng)反復(fù)劃線分離得純培養(yǎng)，制片、革蘭氏染色、電子顯微鏡下觀察其形態(tài)。形態(tài)相似，菌株在固體種子培養(yǎng)基中呈乳白色、平滑、不透明，表面光滑，菌落易挑起（圖2B）。顯微鏡（×100）下觀察形態(tài)結(jié)果如圖2C所示，初步鑒定結(jié)果為一株酵母菌，進一步對其進行分子鑒定。

圖2 產(chǎn)β-葡萄糖苷酶菌菌株的培養(yǎng)形態(tài)與形態(tài)特征Fig.2 Colony morphology and cultural characteristics of the strain capable of producing β-glucosaccharase on agar plate

2.3 產(chǎn)β-葡萄糖苷酶菌株分子鑒定

利用NL1和NL4一對引物擴增待測菌株26S rDNA近5’端D1/D2區(qū)域，擴增結(jié)果見圖3。由圖3可知，擴增產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測出現(xiàn)578 bp熒光條帶，與預(yù)期結(jié)果一致，片段大小與已報道的片段（500～600 bp）相符[15]。將待測菌株的D1/D2區(qū)域測序，在GenBank中進行同源性序列搜索（BLAST Search），結(jié)果顯示待測菌株與馬克斯克魯維酵母序列相比，同源性高達99%（圖4），因此進一步驗證待測菌株為馬克斯克魯維酵母菌（Kluyveromyces marxianus）。該菌種是克魯維酵母屬中非常重要的一個菌種，因其耐高溫、生長速率快且安全性高等諸多優(yōu)勢而應(yīng)用于如酶類、乙醇等工業(yè)生物技術(shù)領(lǐng)域[26]。王和平[27]和曾爽[28]等從kefir粒分離鑒定出馬克斯克魯維酵母菌，鐘浩等[12]從6 種不同來源的kefir粒分離的4 種菌種中也含有馬克斯克魯維酵母，與本研究的結(jié)果一致。微生物轉(zhuǎn)化人參皂苷反應(yīng)機制一般認為是微生物產(chǎn)生的酶水解人參皂苷中的糖基，從而引起結(jié)構(gòu)的改變而得到稀有皂苷，如人參皂苷Rg3。目前研究結(jié)果表明，微生物轉(zhuǎn)化Rg3的酶主要為β-葡萄糖苷酶[29]，而利用微生物產(chǎn)β-葡萄糖苷酶應(yīng)用于人參皂苷轉(zhuǎn)化的研究多數(shù)為黑曲霉等真菌。因黑曲霉菌株的產(chǎn)酶活性會隨著保存時間的延長而降低，不利于儲存[30]，在食品加工中的應(yīng)用受到限制。近年來，許多學(xué)者關(guān)注于研究篩選產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的食品級安全菌種。如金清等[31]研究從辣白菜、四川泡菜等蔬菜發(fā)酵篩選乳酸菌，史學(xué)偉等[32]研究從新疆特色葡萄中篩選產(chǎn)β-葡萄糖苷酶酵母菌等。kef i r粒中含有多種乳酸菌和酵母菌等微生物，但是kefir粒發(fā)酵全組分人參時，發(fā)現(xiàn)產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的微生物為馬克斯克魯維酵母。馬克斯克魯維酵母適應(yīng)性強，可以推測kefir粒發(fā)酵人參中馬克斯克魯維酵母成為優(yōu)勢菌種，抑制了乳酸菌的生長。將該菌株保存于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心（CGMCC），保藏編號為13907。

圖3 待測菌株（C21）26S rDNA D1/D2區(qū)域的PCRFig.3 PCR of the 26S rDNA D1/D2 region of the strain (C21)

圖4 依據(jù)26S rDNA序列的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic tree based on 26S rDNA sequences constructed by neighbor-joining method

2.4 馬克斯克魯維酵母發(fā)酵人參提高人參皂苷Rg3工藝優(yōu)化

2.4.1 單因素試驗結(jié)果

圖5 人參-水質(zhì)量比、pH值、接種量和發(fā)酵時間對人參皂苷Rg3含量的影響Fig.5 Effects of ginseng-to-water ratio, pH value, inoculumconcentration, and fermentation time on the content of ginsenoside Rg3

由圖5可知，人參-水質(zhì)量比在1∶2.0～1∶2.6范圍內(nèi)，隨著水比例的增加，人參皂苷Rg3含量呈現(xiàn)上升趨勢，當(dāng)人參-水質(zhì)量比為1∶2.6時人參皂苷含量達到最大值為（3.22±0.18）mg/g，隨后人參皂苷Rg3含量趨于穩(wěn)定。在pH值范圍為4.5～6.5范圍內(nèi)，隨著pH值的增加，人參皂苷Rg3的含量呈現(xiàn)先上升再下降的趨勢，當(dāng)pH值為5.5時，人參皂苷Rg3的產(chǎn)量達到最大值為（2.36±0.23）mg/g?？疾祚R克斯克魯維酵母接種量對稀有皂苷轉(zhuǎn)化率的影響中發(fā)現(xiàn)，隨著接種量的增加，人參皂苷Rg3的含量呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢，當(dāng)接種量為3%時，人參皂苷含量達到最高值為（3.02±0.25）mg/g，隨后人參皂苷Rg3的含量有所下降，這可能是由于酵母菌的積累所產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物將人參皂苷Rg3轉(zhuǎn)化成其他皂苷。在發(fā)酵時間1～9 d內(nèi)，隨著發(fā)酵時間延長，人參皂苷Rg3含量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，且呈階梯狀下降，當(dāng)發(fā)酵時間3 d時，人參皂苷Rg3的含量達到最大值為（3.13±0.11）mg/g。結(jié)果顯示，人參-水質(zhì)量比、pH值、接種量和發(fā)酵時間對轉(zhuǎn)化Rg3影響顯著。但是所有試驗組的人參漿pH值范圍保持在5.5～6.0左右，從成本和工業(yè)化生產(chǎn)角度出發(fā)，選擇人參-水質(zhì)量比、接種量和發(fā)酵時間進行響應(yīng)面試驗分析。

2.4.2 響應(yīng)面試驗結(jié)果與方差分析

根據(jù)Box-Behnken試驗設(shè)計原理，綜合單因素試驗結(jié)果，進行3因素3水平響應(yīng)面試驗，結(jié)果如表3所示，方差分析結(jié)果見表4。

表3 響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果Table3 Experimental design and results for response surface analysis

對上述試驗結(jié)果進行二次回歸擬合，建立的回歸方程為Y=3.40+0.26A-0.099B-0.024C+0.30AB+0.055AC-0.33BC-0.50A2-0.39B2+0.24C2。

表4 方差分析結(jié)果Table4 Analysis of variance for quadric regression model

從表4可得出，整體模型的F值為78.44（P＜0.000 1），表明試驗所采用二次回歸方程模型極顯著，在統(tǒng)計學(xué)上是有意義的。本試驗失擬項P值為0.220 3大于0.05，對模型有利，無失擬因素存在。該模型方程決定系數(shù)R2值為0.977 6，說明回歸方程擬合程度良好，自變量與響應(yīng)面之間線性關(guān)系顯著，可用于人參皂苷Rg3含量檢測試驗的理論預(yù)測[24]。對比影響人參皂苷Rg3含量的主次因素為人參-水質(zhì)量比（A）＞接種量（B）＞發(fā)酵時間（C）。

圖6 Box-Behnken試驗?zāi)Ｐ晚憫?yīng)面圖和等高線圖Fig.6 Rsponse surface and contour plots

由圖6可以看出，對人參-水質(zhì)量比、接種量和發(fā)酵時間3 個因素交互作用分析，得到交互因素的響應(yīng)面圖，等高線圖均為橢圓形，響應(yīng)面三維圖均有穩(wěn)定點，且為極大值。結(jié)果顯示人參-水質(zhì)量比和酵母接種量、酵母接種量和發(fā)酵時間均具有交互性（P＜0.05），人參-水質(zhì)量比和發(fā)酵時間的交互作用不顯著（P＞0.05）。通過數(shù)據(jù)處理分析可知，優(yōu)化的發(fā)酵條件為人參-水質(zhì)量比1∶2.65、發(fā)酵時間3 d、接種量2.94%，人參皂苷Rg3含量最大預(yù)測值為3.3298 mg/g。為檢驗?zāi)Ｐ偷臏?zhǔn)確性，采用優(yōu)化后最佳發(fā)酵條件進行發(fā)酵驗證實驗，3 次實驗得到人參皂苷Rg3含量平均值為（3.31±0.04）mg/g。預(yù)測值與實際值接近，說明該回歸模型優(yōu)化的發(fā)酵工藝是有效的。

眾多學(xué)者致力于微生物發(fā)酵轉(zhuǎn)化人參皂苷的研究[1,2,15]，得到了較好的結(jié)果。江波等[33]研究發(fā)現(xiàn)，馬克斯克魯維酵母分泌的酶具有糖基轉(zhuǎn)移的活性，能促進人參皂苷的形成。本實驗研究kefir粒以及首次探索從kefir粒分離得到的產(chǎn)β-葡萄糖苷酶菌株發(fā)酵全組分人參，發(fā)現(xiàn)均能顯著提高人參皂苷Rg3含量，經(jīng)優(yōu)化發(fā)酵工藝后人參皂苷Rg3含量與未發(fā)酵人參中人參皂苷Rg3相比提高了3.48 倍，高于陳旸等[34]研究的2.3 倍和吳迪等[35]研究的轉(zhuǎn)化率44%。更值得關(guān)注的是，馬克斯克魯維酵母發(fā)酵人參后產(chǎn)生特殊的香氣，給人們一種非常愉悅的感受。本課題組對kefir粒發(fā)酵人參后香氣成分進行分析，發(fā)現(xiàn)發(fā)酵后的人參增加了果香味和燒烤香味，同時降低其不良風(fēng)味[14]。人參進入新資源食品原料庫后，除人參皂苷含量外，人參的感官品質(zhì)也成為重要的食品加工因素。運用微生物法發(fā)酵改善人參風(fēng)味有希望成為開發(fā)人參高價值食品的有效途徑。

3 結(jié) 論

本實驗從kefir粒發(fā)酵人參漿中篩選出產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的菌株，經(jīng)鑒定為馬克斯克魯維酵母（Kluyveromyces marxianus）。通過Box-Behnken試驗設(shè)計優(yōu)化馬克斯克魯維酵母轉(zhuǎn)化生產(chǎn)人參皂苷Rg3工藝，優(yōu)化后的工藝為人參-水質(zhì)量比1∶2.65、發(fā)酵時間3 d、馬克斯克魯維酵母接種量2.94%，該條件下人參皂苷Rg3含量為（3.31±0.04）mg/g，轉(zhuǎn)化率為248%，比優(yōu)化之前提高了1.84 倍。該結(jié)論為全組分人參發(fā)酵食品工業(yè)化生產(chǎn)提供理論數(shù)據(jù)。