張德福，安 慧，張 健，趙禹宗，張 蕊，劉雪飛，楊立娜，白鳳翎，李 春，周冬生，李鈺金，殷 喆，勵(lì)建榮,*

（1.渤海大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，生鮮農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工及安全控制技術(shù)國(guó)家地方聯(lián)合工程研究中心，遼寧省食品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧省高等學(xué)校生鮮食品產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究院，遼寧 錦州 121013；2.軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院微生物流行病研究所，病原微生物生物安全國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100071；3.渤海大學(xué)數(shù)理學(xué)院，遼寧 錦州 121013；4.榮成泰祥食品股份有限公司，山東 榮成 264309）

耐藥細(xì)菌的出現(xiàn)是21世紀(jì)人類健康面臨的最嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)之一，而食物鏈在人接觸耐藥細(xì)菌的途徑中居重要地位[1-3]，如人類大多數(shù)耐藥沙門菌感染就是因?yàn)槭秤昧宋廴镜膭?dòng)物性食品而引起的[3-7]。在美國(guó)，每年可能有一百萬(wàn)起食源性沙門菌喹諾酮耐藥性病例，其中有上千起死亡病例，幾乎都源于動(dòng)物性食品[8]。人和動(dòng)物的腸道是耐藥菌的儲(chǔ)存庫(kù)，而且由于畜禽集約化養(yǎng)殖的迅猛發(fā)展，畜禽糞便經(jīng)常沒(méi)有任何凈化處理任意排放，污染了土壤和水源[3,7,9-10]；糞便經(jīng)雨水沖刷、地表徑流等最終進(jìn)入湖泊和海洋[11-12]，造成蔬菜[13-14]、水產(chǎn)品[13,15-18]、畜禽等動(dòng)物性食品[6,9,19]及地下水[7,10-11]等出現(xiàn)耐藥菌。耐藥菌最終通過(guò)被污染的作物、耐藥菌感染的畜禽肉和蔬菜、暴露在耐藥菌污染的水中的水產(chǎn)品等途徑進(jìn)入人體，從而引起人類的感染及耐藥菌株的傳播[3]。

奇異變形桿菌（Proteus mirabilis）是腸桿菌科、變形桿菌屬的一種革蘭氏陰性條件致病菌，廣泛存在于水、土壤、腐敗的有機(jī)物以及人和動(dòng)物的腸道中，與臨床關(guān)系較密切，能夠引起慢性中耳炎、創(chuàng)傷感染等繼發(fā)感染，也可引起膀胱炎、嬰兒腹瀉、食物中毒等，是僅次于大腸埃希菌的可引起泌尿系統(tǒng)感染的主要病原菌[20]。奇異變形桿菌主要污染動(dòng)物性食品，特別是肉類，受污染的食品在一定條件下會(huì)引起人的感染。我國(guó)公布的細(xì)菌性食物中毒病原中，奇異變形桿菌僅次于副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）、沙門菌（Salmonella）和金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus），是引起食物中毒的第四大主要病原菌[21]。

多黏菌素是從多黏桿菌培養(yǎng)液中提取的一種多肽類抗菌藥物，主要為多黏菌素B和多黏菌素E（黏菌素）兩種。由于多黏菌素具有腎毒性和神經(jīng)毒性及廣譜抗菌藥物的研發(fā)與使用，在臨床上已較少使用；但是由于20世紀(jì)90年代末多藥耐藥革蘭氏陰性菌的出現(xiàn)，尤其是耐碳青霉烯類腸桿菌的出現(xiàn)，多黏菌素又被重新應(yīng)用于這類細(xì)菌的治療，并被視為對(duì)抗多藥耐藥革蘭氏陰性細(xì)菌感染的最后一道防線[22]。因此，多黏菌素耐藥問(wèn)題受到了國(guó)際上的廣泛關(guān)注。2015年11月，華南農(nóng)業(yè)大學(xué)劉健華教授和中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)沈建忠院士的團(tuán)隊(duì)首次從豬體內(nèi)分離得到一株對(duì)黏菌素耐藥的大腸桿菌SHP45，進(jìn)而報(bào)道了腸桿菌科細(xì)菌質(zhì)粒介導(dǎo)的多黏菌素耐藥基因mcr-1對(duì)多黏菌素的耐藥機(jī)理，該基因是國(guó)際上首次發(fā)現(xiàn)的質(zhì)粒介導(dǎo)的黏菌素耐藥基因[23]。mcr-1耐藥基因多出現(xiàn)在大腸埃希菌中，此外，肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae）、產(chǎn)氣腸桿菌（Enterobacter aerogenes）、陰溝腸桿菌（E. cloacae）、沙門菌（Salmonella）、克呂沃菌（Kluyvera ascorbata）、阪崎克羅諾桿菌（Cronobacter sakazakii）等腸桿菌科細(xì)菌也有關(guān)于mcr-1耐藥基因的報(bào)道[22]，但尚鮮有研究表明奇異變形桿菌攜帶mcr-1耐藥基因的研究報(bào)道。本課題組在對(duì)遼寧錦州附近的養(yǎng)雞場(chǎng)、養(yǎng)豬場(chǎng)、屠宰場(chǎng)等地的食品動(dòng)物源性多藥耐藥菌的調(diào)查中，在某養(yǎng)雞場(chǎng)分離得到一株攜帶mcr-1等耐藥基因的廣泛耐藥分離株F160211，經(jīng)鑒定為奇異變形桿菌，并對(duì)該菌的耐藥譜、耐藥基因、攜帶耐藥基因的質(zhì)粒復(fù)制類型等進(jìn)行了進(jìn)一步的研究。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

麥康凱（MacConkey，MAC）瓊脂培養(yǎng)基、伊紅美藍(lán)（eosin methylene blue，EMB）瓊脂培養(yǎng)基、牛腦心浸液（bovine brain heart infusion，BHI）培養(yǎng)基、Mueller-Hinton肉湯（MH）瓊脂培養(yǎng)基 美國(guó)BD公司；革蘭氏陰性需氧菌藥敏檢測(cè)板 上海星佰生物技術(shù)有限公司；Taq-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）Master Mix、細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒 生工生物工程（上海）股份有限公司；瓊脂糖 美國(guó)Sigma公司；Goldview核酸染料 北京博邁德公司；2000 DNA Marker 北京鴻躍公司；甘油 美國(guó)MP Biomedicals公司；所有引物全部由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

藥敏紙片：頭孢唑啉（30 μg/片）、頭孢他啶（10 μg/片）、亞胺培南（10 μg/片）、環(huán)丙沙星（5 μg/片）、阿米卡星（30 μg/片）、阿奇霉素（15 μ g/片）、四環(huán)素（1 0 μ g/片）、磷霉素（200 μg/片）、氯霉素（30 μg/片）、復(fù)方新諾明（25 μg/片）、替加環(huán)素（15 μg/片）和多黏菌素E（10 μg/片） 英國(guó)Oxoid公司。

1.2 儀器與設(shè)備

DYY-8C型電泳儀 北京市六一儀器廠；LRH系列生化培養(yǎng)箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司；Mastercycler pro梯度PCR儀、5424R冷凍離心機(jī) 德國(guó)Eppendorf公司；Cheimd Doc XRS型凝膠成像儀 美國(guó)Bio-Rad公司；NanoDrop 2000微量分光光度計(jì)、II級(jí)生物安全柜、紙片分配器 美國(guó)Thermo公司；比濁儀 法國(guó)梅里埃公司；HWS恒溫恒濕培養(yǎng)箱 寧波市科技園區(qū)新江南儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)菌的分離與純化

自養(yǎng)雞場(chǎng)采集病雞、自屠宰場(chǎng)采集血液樣品、自養(yǎng)豬場(chǎng)用棉簽蘸取糞便（或者肛門拭子）和鼻拭樣品，樣品放入采樣管或采樣袋中，編號(hào)后放入冰盒內(nèi)帶回實(shí)驗(yàn)室。將病雞解剖后取發(fā)病部位組織約50 g，勻漿后取20 μL涂布MAC瓊脂平板，豬糞便直接涂板，抗凝血取100 μL涂板。平板37 ℃培養(yǎng)過(guò)夜后挑取單克隆劃線接種至EMB瓊脂平板上37 ℃培養(yǎng)24 h，再挑單克隆菌落涂布BHI瓊脂平板上37 ℃培養(yǎng)12 h左右，刮下菌苔，置于含30%甘油的BHI肉湯中-80℃保存?zhèn)溆?。上述培養(yǎng)基均添加200 μg/mL氨芐西林。

1.3.2 細(xì)菌DNA模板的制備

根據(jù)細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒說(shuō)明書提取細(xì)菌基因組DNA，稀釋至質(zhì)量濃度為10 ng/μL備用。

1.3.3 16S rRNA基因擴(kuò)增

以保存的細(xì)菌基因組DNA為模板，以參考文獻(xiàn)[24]中的27F/1492R引物和反應(yīng)條件擴(kuò)增細(xì)菌16S rRNA基因。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳觀察條帶大小無(wú)誤后送到生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序。

1.3.4 紙片擴(kuò)散法鑒定耐藥譜

參照美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)推薦方法[25]及SN/T 1944—2016 《動(dòng)物及其制品中細(xì)菌耐藥性的測(cè)定 紙片擴(kuò)散法》鑒定細(xì)菌的耐藥譜。

1.3.5 最小抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）的測(cè)定

采用肉湯稀釋法，根據(jù)試劑盒說(shuō)明書，挑取單克隆菌落用0.45%滅菌的生理鹽水2～3 mL配制成0.5麥?zhǔn)蠞岫鹊木鷳乙汉笕?0 μL加入12 mL BHI培養(yǎng)基搖勻，加入至革蘭氏陰性需氧菌藥敏檢測(cè)板中，放置37 ℃恒溫培養(yǎng)16～20 h觀察結(jié)果。

1.3.6 耐藥基因篩查

以實(shí)驗(yàn)室建立的方法，用PCR篩查超廣譜β-內(nèi)酰胺酶、碳青霉烯酶和喹諾酮類、大環(huán)內(nèi)酯類、多黏菌素類等常見(jiàn)抗菌藥物的耐藥基因。超廣譜β-內(nèi)酰胺酶、碳青霉烯酶擴(kuò)增引物等見(jiàn)參考文獻(xiàn)[26]，其他引物序列與退火溫度等見(jiàn)表1。

表1 耐藥基因篩查用引物Table1 Primers used for drug-resistant gene screening

續(xù)表1

1.3.7 質(zhì)粒復(fù)制類型分析

根據(jù)p H N S H P4 5序列（G e n B a n k登錄號(hào)：KP347127）的復(fù)制起始蛋白基因repA和質(zhì)粒分離蛋白parA基因設(shè)計(jì)引物進(jìn)行擴(kuò)增，檢測(cè)攜帶mcr-1的質(zhì)粒復(fù)制類型。PCR程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性40 s，58 ℃退火40 s，72 ℃延伸1 min，30 個(gè)循環(huán)；最終72 ℃延伸5 min。引物序列見(jiàn)表2。

表2 質(zhì)粒復(fù)制類型PCR檢測(cè)用引物Table2 Primers used for detection of plasmid replicon type

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)菌的分離與純化

課題組在遼寧省內(nèi)多家養(yǎng)雞場(chǎng)、養(yǎng)豬場(chǎng)、屠宰場(chǎng)等共采集樣品500余份，分離到多藥耐藥菌361 株，其中一株編號(hào)為F160211的菌株初步鑒定為對(duì)多黏菌素等藥物耐藥，因此進(jìn)行了進(jìn)一步的研究。

2.2 16S rRNA菌種擴(kuò)增結(jié)果

以細(xì)菌F160211的基因組DNA為模板，以27F/1492R引物擴(kuò)增16S rRNA基因后的測(cè)序結(jié)果進(jìn)行BLAST分析表明，分離株F160211為奇異變形桿菌。

2.3 紙片擴(kuò)散法鑒定耐藥譜

紙片擴(kuò)散法對(duì)奇異變形桿菌F160211的耐藥譜鑒定表明（表3），該菌對(duì)頭孢唑啉、頭孢他啶、環(huán)丙沙星、阿米卡星、阿奇霉素、四環(huán)素、磷霉素、氯霉素、復(fù)方新諾明和多黏菌素耐藥，對(duì)亞胺培南和替加環(huán)素敏感。

表3 紙片擴(kuò)散法鑒定奇異變形桿菌F160211耐藥譜Table3 Drug-resistance pro fi le of P. mirabilis F160211 using disk-based test

2.4 肉湯稀釋法測(cè)MIC結(jié)果

表4 奇異變形桿菌F160211的MICTable4 MIC of P. mirabilis F160211

利用肉湯稀釋法對(duì)奇異變形桿菌F160211的耐藥情況進(jìn)一步詳細(xì)分析（表4），結(jié)果表明，該菌對(duì)青霉素類、第1代和第2代頭孢菌素類、大環(huán)內(nèi)酯類、氨基糖苷類、酰胺醇類、四環(huán)素類、磺胺類、利福霉素類和黏菌素類等耐藥，對(duì)呋喃類、多肽類、喹諾酮類中介耐藥，對(duì)第3代和第4代頭孢菌素類、單環(huán)β-內(nèi)酰胺類、碳青霉烯類、甘氨酰環(huán)素類敏感。

2.5 耐藥基因篩查結(jié)果

以文獻(xiàn)報(bào)道的、實(shí)驗(yàn)室已合成的多種耐藥基因引物對(duì)奇異變形桿菌F160211的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果表明，F(xiàn)160211攜帶blaCTX-M-1、blaCTX-M-9、blaTEM、blaOXA-1、mph(A)、qnrS和mcr-1等多種耐藥基因（圖1）。

圖1 奇異變形桿菌F160211耐藥基因PCR篩查Fig.1 PCR screening of drug-resistance genes from P. mirabilis F160211

2.6 質(zhì)粒復(fù)制類型分析

通過(guò)對(duì)奇異變形桿菌F160211攜帶mcr-1基因的質(zhì)粒repA和parA基因進(jìn)行PCR驗(yàn)證結(jié)果表明，養(yǎng)殖場(chǎng)分離得到的分離株奇異變形桿菌F160211的mcr-1基因存在于pHNSHP45類似的IncI2型質(zhì)粒上（圖2）。

圖2 質(zhì)粒復(fù)制類型PCR檢測(cè)結(jié)果Fig.2 PCR detection of plasmid replicon type

3 討 論

MIC和耐藥基因PCR擴(kuò)增結(jié)果表明，分離自病雞肉中的奇異變形桿菌F160211為多藥耐藥株，攜帶有多種耐藥基因，耐藥性非常嚴(yán)重，除了對(duì)第3代和第4代頭孢菌素類、單環(huán)β-內(nèi)酰胺類、碳青霉烯類、甘氨酰環(huán)素類敏感外，對(duì)其他藥物均為耐藥或中介耐藥；且其耐藥基因位于質(zhì)粒上，具有水平轉(zhuǎn)移給其他細(xì)菌并播散開來(lái)的風(fēng)險(xiǎn)，給消費(fèi)者的食品安全和身體健康帶來(lái)隱患。

多黏菌素對(duì)大多數(shù)革蘭氏陰性菌具有較好的殺菌作用，一直被養(yǎng)殖業(yè)者廣泛應(yīng)用于促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)和疾病的預(yù)治等；在臨床上用作對(duì)碳青霉烯類耐藥的肺炎克雷伯菌、鮑曼不動(dòng)桿菌和銅綠假單胞菌等革蘭氏陰性多藥耐藥菌治療的最后一道防線；雖然也有耐藥菌出現(xiàn)，但一般都是染色體介導(dǎo)的，其耐藥基因的傳播也是通過(guò)病人之間的克隆株的傳播，耐藥率較低，危害較小[35]。但Liu Yiyun等[23]在雞、豬、零售的肉類和病人體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了質(zhì)粒攜帶的、可在細(xì)菌間接合轉(zhuǎn)移的多黏菌素耐藥基因mcr-1，且該質(zhì)粒在雞肉中存在的比例高達(dá)28%，引起世界范圍的震驚。

本研究中，奇異變形桿菌F160211攜帶有mcr-1耐藥基因，但其耐藥性為敏感，這也與Liu Yiyun[23]、易靈嫻[22]、Skov[36]等報(bào)道m(xù)cr-1介導(dǎo)宿主菌低水平的黏菌素耐藥相符；攜帶mcr-1的奇異變形桿菌質(zhì)粒與Liu Yiyun等[23]報(bào)道的屬于同一類型不相容性質(zhì)粒，宿主范圍也由報(bào)道的大腸桿菌、沙門菌等進(jìn)一步擴(kuò)大至奇異變形桿菌，這說(shuō)明該質(zhì)粒已在不同菌種間發(fā)生了水平轉(zhuǎn)移，形勢(shì)更加嚴(yán)峻。隨著時(shí)間的推移，如果沒(méi)有合理的應(yīng)對(duì)措施，將可能有更多的菌種產(chǎn)生mcr-1耐藥基因，這無(wú)論對(duì)食品安全還是臨床感染的治療都將是嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)，同時(shí)也對(duì)人類濫用抗菌藥物的行為敲響了警鐘。