郗恩光，譚海生，楊勁松,*，崔坤鵬，張萬昌，鞠雪莉，李曉雷，張桂和

（1.海南大學(xué)食品學(xué)院，海南 ?？?570228；2.海南大學(xué)材料與化工學(xué)院，海南 ?？?570228）

香蕉（Musa nana Lour.）為芭蕉科芭蕉屬植物，主要生長在熱帶地區(qū)。果實營養(yǎng)豐富，味香，收獲期較長，溫帶地區(qū)也很重視香蕉的栽培。原產(chǎn)亞洲東南部：中國臺灣、海南、廣東、廣西等地區(qū)均有栽培[1]。在我國，香蕉是排在蘋果、梨和柑橘之后的第四大水果，香蕉產(chǎn)業(yè)已經(jīng)成為我國南亞熱帶地區(qū)農(nóng)業(yè)支柱性產(chǎn)業(yè)，在熱區(qū)經(jīng)濟和農(nóng)村社會發(fā)展中發(fā)揮著重要作用[2]。隨著香蕉種植面積的不斷擴大，香蕉植株及香蕉副產(chǎn)物上附著的乳酸菌的研究不斷得到各界學(xué)者的重視。

凡是能從葡萄糖或乳糖的發(fā)酵過程中產(chǎn)生乳酸的細(xì)菌統(tǒng)稱為乳酸菌[3]。乳酸菌分布非常廣泛，物種多樣性非常豐富，具有重要的學(xué)術(shù)價值，是多個學(xué)科領(lǐng)域的理想材料，而且在多個工業(yè)領(lǐng)域的應(yīng)用價值也很高。此外，這類菌中有些細(xì)菌又是人畜的致病菌，因此受到人們極大的關(guān)注和重視[4]。徐紹成等[5]從香蕉莖葉中篩出3 株高產(chǎn)酸菌株，分別為植物乳桿菌、短乳桿菌和乳酸片球菌，桿菌產(chǎn)酸速率大于球菌的產(chǎn)酸速率。翟海瑞[6]從柱花草中篩出4 組乳酸菌，分別為海氏腸球菌、糞腸球菌、乳酸乳球菌霍氏亞種及類植物乳桿菌，類植物乳桿菌對柱花草青貯飼料的品質(zhì)有明顯改善。

本研究擬利用MRS選擇性培養(yǎng)基，從海南省五指山野生香蕉植株上分離出乳酸菌菌株，對其進行純化、鑒定。對特殊乳酸菌進行16S rDNA序列同源性分析，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。16S rDNA序列同源性分析就是一種分子水平上鑒定乳酸菌菌種的手段，這種鑒定方法能夠從分子和基因水平上認(rèn)識乳酸菌在香蕉植株上各個部位的多樣性及種群結(jié)構(gòu)[7-10]。海南省五指山地區(qū)冬暖夏涼，不受寒潮侵襲，也不受臺風(fēng)影響。由于獨特的氣候條件，使海南省五指山生物種類繁多，為擴大植物源乳酸菌菌種庫提供了有力的條件。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

樣品為采自海南省五指山上的野生香蕉植株。

牛肉膏、酵母膏、檸檬酸銨（分析純）、吐溫80（化學(xué)純） 國藥集團化學(xué)試劑有限公司；瓊脂 天津市大茂化學(xué)試劑廠；葡萄糖、乙酸鈉、磷酸氫二鉀、硫酸鎂、硫酸錳、氯化鈉（均為分析純），二甲基亞砜、異丙醇（均為化學(xué)純） 廣州化學(xué)試劑廠；蛋白胨廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

SW-CJ-17-D超凈工作臺 蘇州佳寶凈化工作設(shè)備有限公司；DHG-9203A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 寧波江南儀器廠；SKP-01電熱恒溫培養(yǎng)箱 湖北省黃石恒豐醫(yī)療器械有限公司；PHS-3E型 pH計 上海雷磁儀器廠；PL303電子天平 梅特勒-托利多儀器有限公司；MDF-382E（N）超低溫冰箱 日本三洋公司；YM50FGN全自動高壓滅菌鍋 上海滬譽貿(mào)易有限公司；5417R離心機 德國Eppendorf公司；Millipore純水儀 默克密理博（中國）有限公司；DYY-7B電泳儀 北京六一儀器廠；S1000高性能聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀 美國Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品的采集與制備

利用冰盒將采集的樣品運回實驗室。分別稱取切碎的樣品10 g于90 mL 0.85%無菌生理鹽水中，振蕩均勻，靜置，吸取1 mL于9 mL無菌生理鹽水的試管中，逐步稀釋到10-7，選擇10-5、10-6、10-7三個稀釋度溶液，備用[11-12]。將剩下的樣品分別放入裝有MRS液體培養(yǎng)基的真空袋中，進行厭氧富集培養(yǎng)48 h[13]。

1.3.2 樣品中其他微生物的測定

運用涂布法將各樣品10-5、10-6、10-7三個稀釋液，取100 μL均勻涂布到PDA和LB固體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)48 h，并記錄各菌群生長情況。將各樣品的10-1稀釋液于75 ℃水浴中恒溫30 min，取100 μL均勻涂布到LB固體培養(yǎng)基中，適溫培養(yǎng)48 h，測定芽孢桿菌含量[14]。

1.3.3 乳酸菌的分離純化

運用稀釋法將富集后的培養(yǎng)液，逐步稀釋到10-7，吸取10-5、10-6、10-7三種稀釋液100 μL，均勻涂布接種到含有1.5% CaCO3的MRS固體培養(yǎng)基中，37 ℃厭氧培養(yǎng)48 h[15-16]。挑取有溶鈣圈的單個菌落，采用劃線法進行逐步純化。觀察菌落特征，同時進行革蘭氏染色實驗和過氧化氫酶觸實驗，初步確定菌株是否為疑似乳酸菌菌株，以便進行以下實驗[17-18]。

1.3.4 乳酸菌屬的鑒定實驗

根據(jù)文獻(xiàn)[19-21]方法，對疑似乳酸菌菌株進行生理生化鑒定實驗，實驗內(nèi)容包括葡萄糖產(chǎn)氣實驗、明膠液化實驗、硝酸鹽還原實驗、耐酸實驗、耐溫實驗、耐鹽實驗及糖發(fā)酵實驗[22-23]，以確定各菌種屬的劃分。

1.3.5 乳酸菌生長速率和產(chǎn)酸速率的測定

將各菌種以3%的接種量，接入液體MRS培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫培養(yǎng)，每隔2 h測定各菌種發(fā)酵液的pH值以及測定在600 nm波長處的OD值[5]，并繪制產(chǎn)酸速率曲線和生長速率曲線[24]。

1.3.6 乳酸菌分子鑒定

利用16S rDNA序列分析對乳酸菌進行分子鑒定，技術(shù)路線：基因組DNA的提取→DNA電泳檢測→PCR擴增→PCR產(chǎn)物電泳檢測→測序。

1.3.6.1 基因組DNA的提取[25]

按照文獻(xiàn)[25]進行基因組DNA的提取。

1.3.6.2 DNA電泳檢測

取3 μL樣品與3 μL 6×Loading buffer混合，加樣于預(yù)先制備的1.0%瓊脂糖凝膠點樣孔中進行電泳，電壓100 V，在0.5×TBE電泳液電泳20 min。電泳后，在紫外燈下觀察。

1.3.6.3 PCR擴增[26-28]

16S引物序列：27f：AGAGTTTGATCMTGGCTCAG；1492R：TACGGYTACCTTGTTACGACTT。

1.3.6.4 PCR產(chǎn)物電泳檢測及測序

待擴增反應(yīng)完畢后，取3 μL PCR產(chǎn)物與3 μL 6×Loading buffer混合，加樣于預(yù)先制備的1.0%瓊脂糖凝膠點樣孔中進行電泳，電壓100 V，在0.5×TBE電泳液電泳20 min。電泳后，在紫外燈下觀察。上機測序，輸出峰圖。

1.3.7 系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

測序所得的16S rDNA序列校對后，與NCBI的GenBank數(shù)據(jù)庫進行BLAST分析，根據(jù)序列同源性，選取不同的模式菌株，采用MEGA 5.0的UPGMA法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，確定菌株的種屬關(guān)系[12,14]。

1.3.8 濾紙片法測定乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)物對致病菌抑菌作用

1.3.8.1 未處理的上清液對致病菌抑菌作用[13,29]

將乳酸菌以3%的接種量接種到MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃厭氧恒溫培養(yǎng)48 h，測定其pH值，5 000 r/min離心15 min，取上清液。將各致病菌利用生理鹽水逐步稀釋至106CFU/mL，利用平板涂布法將100 μL菌懸液分別均勻涂布到NA、LB和牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基中。滅菌后的濾紙片浸泡在上清液中30 min，將浸泡后的濾紙片瀝干平鋪到平板上，同時做空白對照，37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，觀察濾紙片周圍是否出現(xiàn)抑菌圈，并用十字測量法測定其抑菌圈直徑。

1.3.8.2 排除乳酸和過氧化氫的上清液對致病菌抑菌作用

利用2.5 mol/L的NaOH溶液將上清液中和至pH 7.0，用過氧化氫酶溶液加入到中性上清液中至過氧化氫酶過量，37 ℃水浴2 h后，滅菌后的濾紙片浸泡在上清液中30 min，將浸泡后的濾紙片瀝干平鋪到平板上，同時做空白對照，37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，觀察濾紙片周圍是否出現(xiàn)抑菌圈，并用十字測量法測定其抑菌圈直徑。

2 結(jié)果與分析

2.1 微生物菌群的測定結(jié)果

從表1可以看出，樣品中乳酸菌總數(shù)在106～107CFU/g之間，好氧細(xì)菌總數(shù)在105～107CFU/g之間，霉菌總數(shù)在103～106CFU/g之間，酵母總數(shù)在102～103CFU/g之間，芽孢桿菌在102～104CFU/g之間。樣品微生物菌群中乳酸菌屬于優(yōu)勢菌種，酵母菌和芽孢桿菌相對來說較少。

2.2 菌落與菌體特征

表2 香蕉植株上代表菌株菌體及菌落特征Table2 Colony and cellular morphology of the isolated strains

從樣品中共篩出44 株疑似乳酸菌株。根據(jù)過氧化氫酶實驗以及革蘭氏染色實驗結(jié)果，排除5 株過氧化氫酶實驗陽性菌株。從剩下的39 株菌種中挑選18 株進行鏡檢生理生化實驗。表2為18 株菌株的菌體和菌落形態(tài)。

從表2可以看出，全部菌株菌落形態(tài)基本相似，為生長狀況良好、邊緣光滑整齊、乳白色、凸起的圓形菌落；只有菌株WL7-1和WSo7-1顏色為微白色，WL7-1生長狀況較差；菌株直徑在0.8～2.0 mm之間。菌株WR7-1為球狀，WSt5-2、WSt6-3、WSt6-4、WL7-1為橢圓狀，其余為桿狀。

2.3 生理生化實驗結(jié)果

將選出的18 株疑似乳酸菌菌株進行一系列生理生化鑒定實驗，由表3可知，18 株菌株均為革蘭氏陽性、過氧化氫酶陰性、明膠液化陰性、硝酸鹽還原陰性，產(chǎn)酸性能較好。WL7-1和WFr5-1產(chǎn)氣，其余菌株不產(chǎn)氣。在耐酸實驗中，隨著生長環(huán)境pH值的升高，菌種生長狀況逐漸變好，在pH 7.0時長勢最好；WSo7-1、WSo7-2、WSt5-2、WSt6-3和WSt6-4耐酸效果較好。在耐鹽實驗中，菌種在3.0% NaCl和6.5% NaCl環(huán)境下長勢基本較好；但是WR7-1菌種在含有6.5% NaCl的培養(yǎng)基中不能正常生長。在耐溫實驗中，所有菌種在5、45 ℃和50 ℃環(huán)境下不能正常生長；在10 ℃環(huán)境下WL7-1、WSo7-1、WSt5-4、WSt6-3、WFr5-1、WR5-2能夠生長，WSt5-2和WSt6-4長勢較好，說明這兩株菌耐低溫性能較好，其余菌株不能正常生長。

2.4 實驗菌株糖類發(fā)酵實驗結(jié)果

根據(jù)18 株乳酸菌的菌體和菌落特征、生理生化實驗結(jié)果、生長曲線和產(chǎn)酸速率曲線，選出具有代表性的5 株菌株，進行糖類發(fā)酵實驗。WR7-1是唯一菌體特征為球形成對的菌株，同時它的生長曲線和產(chǎn)酸速率曲線較平緩，比較特殊；WFl5-3菌株生長形勢較突出，產(chǎn)酸性能較好，同時此菌株的生理生化實驗結(jié)果和其他大多數(shù)菌株相似；WL7-3和WFr6-4菌株的延遲期較短，比其他菌株能夠快速適應(yīng)環(huán)境，快速進入對數(shù)期和穩(wěn)定期；WSt6-4菌株長勢和產(chǎn)酸量較好，同時耐酸耐低溫性能較好。由表4可知，5 株代表菌株利用多糖的情況基本相近，但是不盡相同。WR7-1能利用木糖，WFl5-3能利用山梨糖，WFr6-4能利用鼠李糖，WL7-3能利用少量的糖原和木糖醇；WSt6-4不能利用蜜二糖。

2.5 乳酸菌生長速率測定結(jié)果

表3 香蕉植株上代表菌株生理生化實驗結(jié)果Table3 Physiological and biochemical characteristics of 18 suspected strains

表4 香蕉植株上代表菌株糖類發(fā)酵實驗結(jié)果Table4 Carbohydrate fermentation prof i les of fi ve typical strains

圖1 乳酸菌生長速率曲線Fig.1 Growth rate curves of fi ve typical strains of lactic acid bacteria

由圖1可知，接種后菌種有短暫的延滯期，過后很快進入對數(shù)期生長，14 h后進入穩(wěn)定期，生長速率減緩，菌種量基本保持恒定；整體趨向“S”型?？梢钥闯?，WFr6-4相比其他菌種在對數(shù)期長勢較快，WR7-1在對數(shù)期長勢較平緩；達(dá)到穩(wěn)定期后，WFl5-3長勢最好，WR7-1長勢較差。

2.6 乳酸菌產(chǎn)酸速率測定結(jié)果

圖2 乳酸菌產(chǎn)酸速率曲線Fig.2 Acid production curves of fi ve typical strains of lactic acid bacteria

接種后，每隔2 h測定各菌種發(fā)酵液的pH值，由圖2可知，隨著菌種生長速率增加，產(chǎn)酸速率同時增加，在4 h后，各菌種產(chǎn)酸量明顯增加，pH值明顯下降；12 h后，產(chǎn)酸量基本恒定。對各菌種進行比較可知，WFr6-4產(chǎn)酸速率較大，WFl5-3產(chǎn)酸能力較強，WR7-1產(chǎn)酸速率較緩和，產(chǎn)酸量較差。各菌種的產(chǎn)酸情況基本一致，但是還有一些差異，可以根據(jù)其自身的生物特性應(yīng)用到不同的生產(chǎn)中。

2.7 16S rDNA序列同源性分析

2.7.1 乳酸菌16S rDNA片段PCR擴增結(jié)果

圖3為待測菌株16S rDNA片段PCR擴增產(chǎn)物凝膠電泳圖，各菌株在1 500 bp處出現(xiàn)單一熒光條帶，而且沒有明顯拖尾現(xiàn)象，符合測序需要。

圖3 乳酸菌16S rDNA片段PCR擴增產(chǎn)物凝膠電泳圖Fig.3 Agarose gel electrophoresis patterns of PCR amplif i ed-products of 16S rDNA fragments from fi ve typical strains of lactic acid bacteria

2.7.2 乳酸菌16S rDNA序列同源性對比結(jié)果

將代表菌株進行16S rDNA測序后，將序列結(jié)果登錄NCBI數(shù)據(jù)庫進行相似性比對，結(jié)果見表5。WFl5-3和戊糖乳桿菌（Lactobacillus pentosus）同源性最高，WL7-3和植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）同源性最高，WSt6-4和植物乳桿菌（Lactobacillus sp. SMG131）同源性最高，WFr6-4和植物乳桿菌（Lactobacillus sp.Sy1）同源性最高，WR7-1和酪黃腸球菌（Enterococcus casseliflavus）同源性最高。所有菌種的同源性均達(dá)到99%以上，和標(biāo)準(zhǔn)菌株序列覆蓋率均達(dá)到99%以上，E值都為0.0。

表5 菌株的16S rDNA序列同源性比對結(jié)果Table5 Homologous alignment analysis of 16S rDNA sequences from fi ve typical isolates

2.8 系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

圖4 利用16S rDNA序列對乳酸桿菌進行構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic tree for lactic acid bacteria based on their 16S rDNA sequences

將代表菌株進行系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建，如圖4、5所示，WFl5-3和戊糖乳桿菌（L. pentosus）系統(tǒng)位置最近，WL7-3和植物乳桿菌（L. plantarum）系統(tǒng)位置最近，WSt6-4和植物乳桿菌（Lactobacillus sp. SMG131）系統(tǒng)位置最近，WFr6-4和植物乳桿菌（Lactobacillus sp. Sy1）系統(tǒng)位置最近，WR7-1和酪黃腸球菌（E. casseliflavus）系統(tǒng)位置最近。根據(jù)16S rDNA序列同源性對比和系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建，可以得到：WL7-3、WSt6-4和WFr6-4鑒定為植物乳桿菌（L. plantarum），WFl5-3鑒定為戊糖乳桿菌（L. pentosus），WR7-1鑒定為酪黃腸球菌（E. casselif l avus）。

圖5 利用16S rDNA序列對球菌WR7-1進行構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.5 Phylogenetic tree for WR7-1 based on its 16S rDNA sequence

2.9 濾紙片法測定乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)物對致病菌抑菌作用結(jié)果

表6 乳酸菌發(fā)酵液對指示菌的抑制作用Table6 Antibacterial activity of the fermentation broths of fi ve Lactobacillus isolates on indicator strains

從表6可以看出，乳酸菌抑制致病菌的抑菌圈直徑均超過12 mm，抑菌效果很明顯。乳酸菌抑制大腸桿菌效果最好，抑菌圈均超過20 mm；抑制單核細(xì)胞性李斯特菌效果一般，抑菌圈在12 mm左右。乳桿菌和球菌抑制大腸桿菌、沙門菌、單核細(xì)胞性李斯特菌的效果基本一致；但是乳桿菌抑制枯草芽孢桿菌的效果明顯好于球菌的抑制效果。其中菌株WL7-3相比較其他菌株抑菌效果最好。菌株WL7-3可作為潛在產(chǎn)細(xì)菌素乳酸菌進行研究。

乳酸菌的發(fā)酵液都能抑制致病菌的生長，其中抑制致病菌生長的因素有乳酸及細(xì)菌素等。在排除有機酸和過氧化氫后，對各菌株的發(fā)酵上清液再進行抑菌實驗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)濾紙片周圍沒有明顯的抑菌圈，但是濾紙片周圍的致病菌相對較少，其中WL7-1效果最明顯?？梢钥闯?，菌株會產(chǎn)生少量的抑菌物質(zhì)。在對上清液濃縮之后，濾紙片周圍會有較小的抑菌圈。今后可以從乳酸菌發(fā)酵條件和促進細(xì)菌素產(chǎn)生物質(zhì)著手，努力尋找最佳的發(fā)酵條件和能夠促進細(xì)菌素物質(zhì)，以期望能夠增加細(xì)菌素的產(chǎn)量，為天然防腐劑開發(fā)等相關(guān)領(lǐng)域研究提供理論依據(jù)。

3 結(jié) 論

本研究從海南省五指山上野生香蕉植株上6 個部位共篩出44 株乳酸菌疑似菌株，排除5 株過氧化氫酶實驗陽性菌株。從剩下的39 株菌種中挑選18 株進行鏡檢、生理生化實驗、糖發(fā)酵實驗、生長速率測定實驗和產(chǎn)酸速率實驗。根據(jù)結(jié)果選出5 株代表菌株，對其進行測序、同源性分析和系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建。結(jié)果顯示：5 株代表性菌株中有3 株為植物乳桿菌（L. plantarum）、1 株為戊糖乳桿菌（L. pentosus）、1 株為酪黃腸球菌（E.casseliflavus）。由此可見，在香蕉植株上乳桿菌屬菌種為優(yōu)勢菌種。5 株代表菌株的產(chǎn)酸性能很好，可作為潛在益生菌株作進一步系統(tǒng)研究，能夠擴大植物源乳酸菌菌種庫，乳酸菌種類較為多樣，而且抑菌效果較好。

目前已有學(xué)者對香蕉植株部分部位及其他熱帶植物進行了研究，本研究全面研究了香蕉植株上乳酸菌的多樣性及分布，擴大了植物源乳酸菌菌種庫，能夠為今后的食品發(fā)酵工業(yè)和青貯飼料發(fā)酵業(yè)等提供植物源乳酸菌。但是香蕉的品種和種植地區(qū)都會對乳酸菌的多樣性產(chǎn)生影響，今后要對不同地區(qū)不同品種的香蕉植株進行研究，了解相應(yīng)的乳酸菌多樣性，努力建立完善的體系，擴大熱帶乳酸菌菌種庫。