郗恩光,譚海生,楊勁松,*,崔坤鵬,張萬昌,鞠雪莉,李曉雷,張桂和
(1.海南大學(xué)食品學(xué)院,海南 ???570228;2.海南大學(xué)材料與化工學(xué)院,海南 ???570228)
香蕉(Musa nana Lour.)為芭蕉科芭蕉屬植物,主要生長在熱帶地區(qū)。果實營養(yǎng)豐富,味香,收獲期較長,溫帶地區(qū)也很重視香蕉的栽培。原產(chǎn)亞洲東南部:中國臺灣、海南、廣東、廣西等地區(qū)均有栽培[1]。在我國,香蕉是排在蘋果、梨和柑橘之后的第四大水果,香蕉產(chǎn)業(yè)已經(jīng)成為我國南亞熱帶地區(qū)農(nóng)業(yè)支柱性產(chǎn)業(yè),在熱區(qū)經(jīng)濟和農(nóng)村社會發(fā)展中發(fā)揮著重要作用[2]。隨著香蕉種植面積的不斷擴大,香蕉植株及香蕉副產(chǎn)物上附著的乳酸菌的研究不斷得到各界學(xué)者的重視。
凡是能從葡萄糖或乳糖的發(fā)酵過程中產(chǎn)生乳酸的細(xì)菌統(tǒng)稱為乳酸菌[3]。乳酸菌分布非常廣泛,物種多樣性非常豐富,具有重要的學(xué)術(shù)價值,是多個學(xué)科領(lǐng)域的理想材料,而且在多個工業(yè)領(lǐng)域的應(yīng)用價值也很高。此外,這類菌中有些細(xì)菌又是人畜的致病菌,因此受到人們極大的關(guān)注和重視[4]。徐紹成等[5]從香蕉莖葉中篩出3 株高產(chǎn)酸菌株,分別為植物乳桿菌、短乳桿菌和乳酸片球菌,桿菌產(chǎn)酸速率大于球菌的產(chǎn)酸速率。翟海瑞[6]從柱花草中篩出4 組乳酸菌,分別為海氏腸球菌、糞腸球菌、乳酸乳球菌霍氏亞種及類植物乳桿菌,類植物乳桿菌對柱花草青貯飼料的品質(zhì)有明顯改善。
本研究擬利用MRS選擇性培養(yǎng)基,從海南省五指山野生香蕉植株上分離出乳酸菌菌株,對其進行純化、鑒定。對特殊乳酸菌進行16S rDNA序列同源性分析,構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。16S rDNA序列同源性分析就是一種分子水平上鑒定乳酸菌菌種的手段,這種鑒定方法能夠從分子和基因水平上認(rèn)識乳酸菌在香蕉植株上各個部位的多樣性及種群結(jié)構(gòu)[7-10]。海南省五指山地區(qū)冬暖夏涼,不受寒潮侵襲,也不受臺風(fēng)影響。由于獨特的氣候條件,使海南省五指山生物種類繁多,為擴大植物源乳酸菌菌種庫提供了有力的條件。
樣品為采自海南省五指山上的野生香蕉植株。
牛肉膏、酵母膏、檸檬酸銨(分析純)、吐溫80(化學(xué)純) 國藥集團化學(xué)試劑有限公司;瓊脂 天津市大茂化學(xué)試劑廠;葡萄糖、乙酸鈉、磷酸氫二鉀、硫酸鎂、硫酸錳、氯化鈉(均為分析純),二甲基亞砜、異丙醇(均為化學(xué)純) 廣州化學(xué)試劑廠;蛋白胨廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。
SW-CJ-17-D超凈工作臺 蘇州佳寶凈化工作設(shè)備有限公司;DHG-9203A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 寧波江南儀器廠;SKP-01電熱恒溫培養(yǎng)箱 湖北省黃石恒豐醫(yī)療器械有限公司;PHS-3E型 pH計 上海雷磁儀器廠;PL303電子天平 梅特勒-托利多儀器有限公司;MDF-382E(N)超低溫冰箱 日本三洋公司;YM50FGN全自動高壓滅菌鍋 上海滬譽貿(mào)易有限公司;5417R離心機 德國Eppendorf公司;Millipore純水儀 默克密理博(中國)有限公司;DYY-7B電泳儀 北京六一儀器廠;S1000高性能聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction,PCR)儀 美國Bio-Rad公司。
1.3.1 樣品的采集與制備
利用冰盒將采集的樣品運回實驗室。分別稱取切碎的樣品10 g于90 mL 0.85%無菌生理鹽水中,振蕩均勻,靜置,吸取1 mL于9 mL無菌生理鹽水的試管中,逐步稀釋到10-7,選擇10-5、10-6、10-7三個稀釋度溶液,備用[11-12]。將剩下的樣品分別放入裝有MRS液體培養(yǎng)基的真空袋中,進行厭氧富集培養(yǎng)48 h[13]。
1.3.2 樣品中其他微生物的測定
運用涂布法將各樣品10-5、10-6、10-7三個稀釋液,取100 μL均勻涂布到PDA和LB固體培養(yǎng)基中,37 ℃培養(yǎng)48 h,并記錄各菌群生長情況。將各樣品的10-1稀釋液于75 ℃水浴中恒溫30 min,取100 μL均勻涂布到LB固體培養(yǎng)基中,適溫培養(yǎng)48 h,測定芽孢桿菌含量[14]。
1.3.3 乳酸菌的分離純化
運用稀釋法將富集后的培養(yǎng)液,逐步稀釋到10-7,吸取10-5、10-6、10-7三種稀釋液100 μL,均勻涂布接種到含有1.5% CaCO3的MRS固體培養(yǎng)基中,37 ℃厭氧培養(yǎng)48 h[15-16]。挑取有溶鈣圈的單個菌落,采用劃線法進行逐步純化。觀察菌落特征,同時進行革蘭氏染色實驗和過氧化氫酶觸實驗,初步確定菌株是否為疑似乳酸菌菌株,以便進行以下實驗[17-18]。
1.3.4 乳酸菌屬的鑒定實驗
根據(jù)文獻(xiàn)[19-21]方法,對疑似乳酸菌菌株進行生理生化鑒定實驗,實驗內(nèi)容包括葡萄糖產(chǎn)氣實驗、明膠液化實驗、硝酸鹽還原實驗、耐酸實驗、耐溫實驗、耐鹽實驗及糖發(fā)酵實驗[22-23],以確定各菌種屬的劃分。
1.3.5 乳酸菌生長速率和產(chǎn)酸速率的測定
將各菌種以3%的接種量,接入液體MRS培養(yǎng)基中,37 ℃恒溫培養(yǎng),每隔2 h測定各菌種發(fā)酵液的pH值以及測定在600 nm波長處的OD值[5],并繪制產(chǎn)酸速率曲線和生長速率曲線[24]。
1.3.6 乳酸菌分子鑒定
利用16S rDNA序列分析對乳酸菌進行分子鑒定,技術(shù)路線:基因組DNA的提取→DNA電泳檢測→PCR擴增→PCR產(chǎn)物電泳檢測→測序。
1.3.6.1 基因組DNA的提取[25]
按照文獻(xiàn)[25]進行基因組DNA的提取。
1.3.6.2 DNA電泳檢測
取3 μL樣品與3 μL 6×Loading buffer混合,加樣于預(yù)先制備的1.0%瓊脂糖凝膠點樣孔中進行電泳,電壓100 V,在0.5×TBE電泳液電泳20 min。電泳后,在紫外燈下觀察。
1.3.6.3 PCR擴增[26-28]
16S引物序列:27f:AGAGTTTGATCMTGGCTCAG;1492R:TACGGYTACCTTGTTACGACTT。
1.3.6.4 PCR產(chǎn)物電泳檢測及測序
待擴增反應(yīng)完畢后,取3 μL PCR產(chǎn)物與3 μL 6×Loading buffer混合,加樣于預(yù)先制備的1.0%瓊脂糖凝膠點樣孔中進行電泳,電壓100 V,在0.5×TBE電泳液電泳20 min。電泳后,在紫外燈下觀察。上機測序,輸出峰圖。
1.3.7 系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建
測序所得的16S rDNA序列校對后,與NCBI的GenBank數(shù)據(jù)庫進行BLAST分析,根據(jù)序列同源性,選取不同的模式菌株,采用MEGA 5.0的UPGMA法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,確定菌株的種屬關(guān)系[12,14]。
1.3.8 濾紙片法測定乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)物對致病菌抑菌作用
1.3.8.1 未處理的上清液對致病菌抑菌作用[13,29]
將乳酸菌以3%的接種量接種到MRS液體培養(yǎng)基中,37 ℃厭氧恒溫培養(yǎng)48 h,測定其pH值,5 000 r/min離心15 min,取上清液。將各致病菌利用生理鹽水逐步稀釋至106CFU/mL,利用平板涂布法將100 μL菌懸液分別均勻涂布到NA、LB和牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基中。滅菌后的濾紙片浸泡在上清液中30 min,將浸泡后的濾紙片瀝干平鋪到平板上,同時做空白對照,37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h,觀察濾紙片周圍是否出現(xiàn)抑菌圈,并用十字測量法測定其抑菌圈直徑。
1.3.8.2 排除乳酸和過氧化氫的上清液對致病菌抑菌作用
利用2.5 mol/L的NaOH溶液將上清液中和至pH 7.0,用過氧化氫酶溶液加入到中性上清液中至過氧化氫酶過量,37 ℃水浴2 h后,滅菌后的濾紙片浸泡在上清液中30 min,將浸泡后的濾紙片瀝干平鋪到平板上,同時做空白對照,37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h,觀察濾紙片周圍是否出現(xiàn)抑菌圈,并用十字測量法測定其抑菌圈直徑。
從表1可以看出,樣品中乳酸菌總數(shù)在106~107CFU/g之間,好氧細(xì)菌總數(shù)在105~107CFU/g之間,霉菌總數(shù)在103~106CFU/g之間,酵母總數(shù)在102~103CFU/g之間,芽孢桿菌在102~104CFU/g之間。樣品微生物菌群中乳酸菌屬于優(yōu)勢菌種,酵母菌和芽孢桿菌相對來說較少。
表2 香蕉植株上代表菌株菌體及菌落特征Table2 Colony and cellular morphology of the isolated strains
從樣品中共篩出44 株疑似乳酸菌株。根據(jù)過氧化氫酶實驗以及革蘭氏染色實驗結(jié)果,排除5 株過氧化氫酶實驗陽性菌株。從剩下的39 株菌種中挑選18 株進行鏡檢生理生化實驗。表2為18 株菌株的菌體和菌落形態(tài)。
從表2可以看出,全部菌株菌落形態(tài)基本相似,為生長狀況良好、邊緣光滑整齊、乳白色、凸起的圓形菌落;只有菌株WL7-1和WSo7-1顏色為微白色,WL7-1生長狀況較差;菌株直徑在0.8~2.0 mm之間。菌株WR7-1為球狀,WSt5-2、WSt6-3、WSt6-4、WL7-1為橢圓狀,其余為桿狀。
將選出的18 株疑似乳酸菌菌株進行一系列生理生化鑒定實驗,由表3可知,18 株菌株均為革蘭氏陽性、過氧化氫酶陰性、明膠液化陰性、硝酸鹽還原陰性,產(chǎn)酸性能較好。WL7-1和WFr5-1產(chǎn)氣,其余菌株不產(chǎn)氣。在耐酸實驗中,隨著生長環(huán)境pH值的升高,菌種生長狀況逐漸變好,在pH 7.0時長勢最好;WSo7-1、WSo7-2、WSt5-2、WSt6-3和WSt6-4耐酸效果較好。在耐鹽實驗中,菌種在3.0% NaCl和6.5% NaCl環(huán)境下長勢基本較好;但是WR7-1菌種在含有6.5% NaCl的培養(yǎng)基中不能正常生長。在耐溫實驗中,所有菌種在5、45 ℃和50 ℃環(huán)境下不能正常生長;在10 ℃環(huán)境下WL7-1、WSo7-1、WSt5-4、WSt6-3、WFr5-1、WR5-2能夠生長,WSt5-2和WSt6-4長勢較好,說明這兩株菌耐低溫性能較好,其余菌株不能正常生長。
根據(jù)18 株乳酸菌的菌體和菌落特征、生理生化實驗結(jié)果、生長曲線和產(chǎn)酸速率曲線,選出具有代表性的5 株菌株,進行糖類發(fā)酵實驗。WR7-1是唯一菌體特征為球形成對的菌株,同時它的生長曲線和產(chǎn)酸速率曲線較平緩,比較特殊;WFl5-3菌株生長形勢較突出,產(chǎn)酸性能較好,同時此菌株的生理生化實驗結(jié)果和其他大多數(shù)菌株相似;WL7-3和WFr6-4菌株的延遲期較短,比其他菌株能夠快速適應(yīng)環(huán)境,快速進入對數(shù)期和穩(wěn)定期;WSt6-4菌株長勢和產(chǎn)酸量較好,同時耐酸耐低溫性能較好。由表4可知,5 株代表菌株利用多糖的情況基本相近,但是不盡相同。WR7-1能利用木糖,WFl5-3能利用山梨糖,WFr6-4能利用鼠李糖,WL7-3能利用少量的糖原和木糖醇;WSt6-4不能利用蜜二糖。
表3 香蕉植株上代表菌株生理生化實驗結(jié)果Table3 Physiological and biochemical characteristics of 18 suspected strains
表4 香蕉植株上代表菌株糖類發(fā)酵實驗結(jié)果Table4 Carbohydrate fermentation prof i les of fi ve typical strains
圖1 乳酸菌生長速率曲線Fig.1 Growth rate curves of fi ve typical strains of lactic acid bacteria
由圖1可知,接種后菌種有短暫的延滯期,過后很快進入對數(shù)期生長,14 h后進入穩(wěn)定期,生長速率減緩,菌種量基本保持恒定;整體趨向“S”型??梢钥闯?,WFr6-4相比其他菌種在對數(shù)期長勢較快,WR7-1在對數(shù)期長勢較平緩;達(dá)到穩(wěn)定期后,WFl5-3長勢最好,WR7-1長勢較差。
圖2 乳酸菌產(chǎn)酸速率曲線Fig.2 Acid production curves of fi ve typical strains of lactic acid bacteria
接種后,每隔2 h測定各菌種發(fā)酵液的pH值,由圖2可知,隨著菌種生長速率增加,產(chǎn)酸速率同時增加,在4 h后,各菌種產(chǎn)酸量明顯增加,pH值明顯下降;12 h后,產(chǎn)酸量基本恒定。對各菌種進行比較可知,WFr6-4產(chǎn)酸速率較大,WFl5-3產(chǎn)酸能力較強,WR7-1產(chǎn)酸速率較緩和,產(chǎn)酸量較差。各菌種的產(chǎn)酸情況基本一致,但是還有一些差異,可以根據(jù)其自身的生物特性應(yīng)用到不同的生產(chǎn)中。
2.7.1 乳酸菌16S rDNA片段PCR擴增結(jié)果
圖3為待測菌株16S rDNA片段PCR擴增產(chǎn)物凝膠電泳圖,各菌株在1 500 bp處出現(xiàn)單一熒光條帶,而且沒有明顯拖尾現(xiàn)象,符合測序需要。
圖3 乳酸菌16S rDNA片段PCR擴增產(chǎn)物凝膠電泳圖Fig.3 Agarose gel electrophoresis patterns of PCR amplif i ed-products of 16S rDNA fragments from fi ve typical strains of lactic acid bacteria
2.7.2 乳酸菌16S rDNA序列同源性對比結(jié)果
將代表菌株進行16S rDNA測序后,將序列結(jié)果登錄NCBI數(shù)據(jù)庫進行相似性比對,結(jié)果見表5。WFl5-3和戊糖乳桿菌(Lactobacillus pentosus)同源性最高,WL7-3和植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)同源性最高,WSt6-4和植物乳桿菌(Lactobacillus sp. SMG131)同源性最高,WFr6-4和植物乳桿菌(Lactobacillus sp.Sy1)同源性最高,WR7-1和酪黃腸球菌(Enterococcus casseliflavus)同源性最高。所有菌種的同源性均達(dá)到99%以上,和標(biāo)準(zhǔn)菌株序列覆蓋率均達(dá)到99%以上,E值都為0.0。
表5 菌株的16S rDNA序列同源性比對結(jié)果Table5 Homologous alignment analysis of 16S rDNA sequences from fi ve typical isolates
圖4 利用16S rDNA序列對乳酸桿菌進行構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic tree for lactic acid bacteria based on their 16S rDNA sequences
將代表菌株進行系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建,如圖4、5所示,WFl5-3和戊糖乳桿菌(L. pentosus)系統(tǒng)位置最近,WL7-3和植物乳桿菌(L. plantarum)系統(tǒng)位置最近,WSt6-4和植物乳桿菌(Lactobacillus sp. SMG131)系統(tǒng)位置最近,WFr6-4和植物乳桿菌(Lactobacillus sp. Sy1)系統(tǒng)位置最近,WR7-1和酪黃腸球菌(E. casseliflavus)系統(tǒng)位置最近。根據(jù)16S rDNA序列同源性對比和系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建,可以得到:WL7-3、WSt6-4和WFr6-4鑒定為植物乳桿菌(L. plantarum),WFl5-3鑒定為戊糖乳桿菌(L. pentosus),WR7-1鑒定為酪黃腸球菌(E. casselif l avus)。
圖5 利用16S rDNA序列對球菌WR7-1進行構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.5 Phylogenetic tree for WR7-1 based on its 16S rDNA sequence
表6 乳酸菌發(fā)酵液對指示菌的抑制作用Table6 Antibacterial activity of the fermentation broths of fi ve Lactobacillus isolates on indicator strains
從表6可以看出,乳酸菌抑制致病菌的抑菌圈直徑均超過12 mm,抑菌效果很明顯。乳酸菌抑制大腸桿菌效果最好,抑菌圈均超過20 mm;抑制單核細(xì)胞性李斯特菌效果一般,抑菌圈在12 mm左右。乳桿菌和球菌抑制大腸桿菌、沙門菌、單核細(xì)胞性李斯特菌的效果基本一致;但是乳桿菌抑制枯草芽孢桿菌的效果明顯好于球菌的抑制效果。其中菌株WL7-3相比較其他菌株抑菌效果最好。菌株WL7-3可作為潛在產(chǎn)細(xì)菌素乳酸菌進行研究。
乳酸菌的發(fā)酵液都能抑制致病菌的生長,其中抑制致病菌生長的因素有乳酸及細(xì)菌素等。在排除有機酸和過氧化氫后,對各菌株的發(fā)酵上清液再進行抑菌實驗,結(jié)果發(fā)現(xiàn)濾紙片周圍沒有明顯的抑菌圈,但是濾紙片周圍的致病菌相對較少,其中WL7-1效果最明顯??梢钥闯?,菌株會產(chǎn)生少量的抑菌物質(zhì)。在對上清液濃縮之后,濾紙片周圍會有較小的抑菌圈。今后可以從乳酸菌發(fā)酵條件和促進細(xì)菌素產(chǎn)生物質(zhì)著手,努力尋找最佳的發(fā)酵條件和能夠促進細(xì)菌素物質(zhì),以期望能夠增加細(xì)菌素的產(chǎn)量,為天然防腐劑開發(fā)等相關(guān)領(lǐng)域研究提供理論依據(jù)。
本研究從海南省五指山上野生香蕉植株上6 個部位共篩出44 株乳酸菌疑似菌株,排除5 株過氧化氫酶實驗陽性菌株。從剩下的39 株菌種中挑選18 株進行鏡檢、生理生化實驗、糖發(fā)酵實驗、生長速率測定實驗和產(chǎn)酸速率實驗。根據(jù)結(jié)果選出5 株代表菌株,對其進行測序、同源性分析和系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建。結(jié)果顯示:5 株代表性菌株中有3 株為植物乳桿菌(L. plantarum)、1 株為戊糖乳桿菌(L. pentosus)、1 株為酪黃腸球菌(E.casseliflavus)。由此可見,在香蕉植株上乳桿菌屬菌種為優(yōu)勢菌種。5 株代表菌株的產(chǎn)酸性能很好,可作為潛在益生菌株作進一步系統(tǒng)研究,能夠擴大植物源乳酸菌菌種庫,乳酸菌種類較為多樣,而且抑菌效果較好。
目前已有學(xué)者對香蕉植株部分部位及其他熱帶植物進行了研究,本研究全面研究了香蕉植株上乳酸菌的多樣性及分布,擴大了植物源乳酸菌菌種庫,能夠為今后的食品發(fā)酵工業(yè)和青貯飼料發(fā)酵業(yè)等提供植物源乳酸菌。但是香蕉的品種和種植地區(qū)都會對乳酸菌的多樣性產(chǎn)生影響,今后要對不同地區(qū)不同品種的香蕉植株進行研究,了解相應(yīng)的乳酸菌多樣性,努力建立完善的體系,擴大熱帶乳酸菌菌種庫。